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1、(10)申请公布号 CN 102994408 A (43)申请公布日 2013.03.27 CN 102994408 A *CN102994408A* (21)申请号 201210223996.3 (22)申请日 2012.06.29 CGMCC No.5564 2011.12.09 C12N 1/20(2006.01) C12N 9/24(2006.01) C12P 19/14(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (71)申请人 中国科学院大连化学物理研究所 地址 116023 辽宁省大连市中山路 457 号 (72)发明人 杜昱光 孟彦羽 傅赟彬 赵勇 尹恒 王文霞 拓。
2、亚琴 (74)专利代理机构 沈阳科苑专利商标代理有限 公司 21002 代理人 马驰 (54) 发明名称 一种卡拉胶降解菌及其发酵方法和应用 (57) 摘要 本发明涉及一种新土地杆菌属的细菌， 具 体的说是一种降解卡拉胶的新菌及其发酵的 方法和应用， 其命名为卡拉胶降解菌 13-Q， 即 Pedobacter hainanensis sp.13-Q， 该菌株已在 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 保藏， 保藏单位名称 ： 中国普通微生物菌种保藏 管理中心， 保藏日期 ： 2011年12月9日， 其保藏编 号为 CGMCC NO.5564。本发明还对该菌发展了一 套培养技术， 能从该菌。
3、稳定生产具有降解卡拉胶 能力的酶。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 8 页 序列表 1 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 8 页 序列表 1 页 附图 4 页 1/2 页 2 1. 一种卡拉胶降解菌， 其特征在于 ： 命名为卡拉胶降解菌 13-Q， 即 Pedobacter hainanensis sp.13-Q， 该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏， 保藏单位名称 ： 中国普通微生物菌种保藏管理中心， 保藏日期 ： 2011年12月9日， 其保藏编 号为 C。
4、GMCC NO.5564。 2. 按照权利要求 1 所述卡拉胶降解菌， 其特征在于 ： 菌落形态特征为 ： 在卡拉胶固体培养基上生长良好， 菌落黄色， 圆形， 表面略 凸起， 光滑， 反光， 不透明， 边缘整齐， 直径约为 1.0mm ； 菌体形态特征为 ： 细胞杆状， 0.3-0.5m1.3-2.0m， 单个或成对排列， 革兰氏染色阴性， 不生孢， 运动 ； 主要生理生化特征 ： 在卡拉胶液体培养基中可产生卡拉胶降解酶 ； 好氧 ； 可以利用L-阿拉伯糖、 D-木糖、 半 乳糖、 葡萄糖、 果糖、 甘露醇、 鼠李糖、 - 甲基 -D- 葡萄糖苷、 N- 乙酰 - 葡萄糖胺、 熊果苷、 七叶灵。
5、、 柳醇、 纤维二糖、 麦芽糖、 乳糖、 海藻糖、 龙胆二糖、 D- 松二糖、 葡萄糖酸盐。但是葡 萄糖和阿拉伯糖产酸。该菌的氧化酶、 过氧化氢酶、 碱性磷酸酶、 酯酶 （C4） 、 类脂酯酶 （C8） 反应为阳性 ； 不呈现脲酶、 色氨酸脱氨酶、 鸟氨酸脱羧酶活性 ； 该菌不能水解淀粉、 明胶、 酪 素、 菊糖等 ； 不生成吲哚和硫化氢 ； 硝酸盐还原呈阴性反应 ； 在麦康凯培养基上不能生长， 脂肪酸组分特征 ： 主要脂肪酸及比例为iso-C150(40.4),iso-C150 2-OH and/or C1617c(18.9) and iso-C17:0 3-OH(18.4 )（图 .1） 。
6、， 醌型特征 ： 主要优势醌为甲基萘醌 K7（MK-7） ， 含量大约为 92.9 ( 图 .2)， DNA G+C mol含量特征 ： DNA G+C mol含量为 42.7， 遗传学特征 ： 所述卡拉胶降解菌 （Pedobacter hainanensis sp.） 13-Q 菌株的 16S rRNA 全基因碱基 序列 （表 .1） ； 菌株 16S rRNA 全基因序列共 1391bp(Genbank 登录号为 ： JQ083404) ； 与 Genbank 国际基因序列数据库记录的最相似的菌株 Pedobacter terricola DS-40T(EF446146) 的相似性为 95。
7、.2。 3. 一种权利要求 1 所述卡拉胶降解菌的酶解产物， 其特征在于 ： 卡拉胶降解菌的酶解 方法， 1） 将卡拉胶降解菌划线于卡拉胶固体培养基上， 在 25-35 摄氏度培养 72-96 小时 ； 2）将固体培养基种子接于种子培养基的试管中， 接种 1-3 环， 于 25-35 摄氏度下以 150-210rpm 转速培养 48-72 小时 ； 3）按体积比为 1/501.5/5 将种子培养基接入发酵培养基中， 25-35 摄氏度下以 150-210rpm 转速培养 48-96 小时， 获取发酵物。 4. 按照权利 3 所述卡拉胶降解菌的发酵方法， 其特征在于 ： 所述卡拉胶固体培养基 （。
8、g/L） ： 琼脂粉 ： 7-15， 蛋白胨 ： 3-8， 酵母浸出粉 0.5-5， 卡拉 胶 ： 1-10， 氯 化 钠 ： 0-20， FeSO47H2O ： 0.01-0.05 ； MgSO47H2O ： 0.2-1.0 ； CaCl2： 0.1-0.5 ； KH2PO4： 0.5-4， pH 6.0-8.0， 余量为水 ； 所述种子培养基 （g/L） ： 酵母浸膏 ： 0.5-5， 蛋白胨 ： 2-10， 卡拉胶 ： 1-10， 氯化钠 ： 0-20， 权 利 要 求 书 CN 102994408 A 2 2/2 页 3 pH6.0-8.0， 余量为水 ； 所述发酵培养基 （g/L） 。
9、： 卡拉胶 0.2-1， 蛋白胨 2-8， 酵母浸出粉 ： 0.5-5， FeSO47H2O ： 0.01-0.05 ； MgSO47H2O ： 0.2-1.0 ； CaCl2： 0.1-0.5 ； KH2PO4： 0.5-4，用 水 补 足 1000ml， pH 6.0-8.0。 5. 一种权利要求 3 所述卡拉胶降解菌的酶解产物在生产卡拉胶寡糖中的应用， 其特征 在于 ： 利用卡拉胶降解菌的酶解产物中产生的卡拉胶降解酶生产卡拉胶寡糖， 也可称之为卡 拉胶降解菌 （Pedobacter hainanensis sp.） 13-Q 用于生产卡拉胶寡糖 ； 1） 收集发酵粗酶液 ： 将按照权利要。
10、求 3 得的发酵液， 经 10000g 离心 10 分钟去除菌体， 上清液经 60饱和硫酸铵在 4 摄氏度搅拌过夜， 12000g 离心 30 分钟， 收集沉淀， 用 PBS 缓 冲液 （0.02-0.05M， pH 7.0-8.0） 重新溶解沉淀， 再用相同缓冲液透析除盐， 得粗酶液 ； 酶解底物 ： 于反应器中进行反应， 将粗酶液加入卡拉胶底物中， 使 1000ml 体系中卡拉 胶底物质量为 5-20g、 粗酶液 2-10ml、 余量为水， 于 30-40， pH 7.0-8.0 条件下酶解反应 3-9 小时， 将反应器置于沸水 10-15 分钟终止反应 ； 得的卡拉胶寡糖溶液粗产品 ； 。
11、2） 分离产物 ： 所得的卡拉胶寡糖溶液粗产品， 经过除去酶蛋白质 （Sevage 法） 后， 于真 空旋转蒸发仪中去除水分， 或经喷雾干燥或冷冻干燥去除水分， 得到卡拉胶寡糖产物。 权 利 要 求 书 CN 102994408 A 3 1/8 页 4 一种卡拉胶降解菌及其发酵方法和应用 技术领域 0001 本发明涉及一种新土地杆菌属的细菌， 特别是一种卡拉胶降解菌及其发酵方法与 应用。 背景技术 0002 卡拉胶是从某些的红藻中提取酸性的线性多聚糖， 属于亲水性的线性硫酸化半乳 糖家族。它们主要由交替的 3- 连接的 -D- 吡喃半乳糖 （G- 单元） 和 4- 连接的 -D- 吡 喃半乳糖。
12、 （D- 单元） 或 4- 连接的 3， 6- 内醚 -D- 吡喃半乳糖 （DA- 单元） ， 形成重复的二 糖单元组成。 0003 卡拉胶因具有优良的热可逆凝胶化、 抗蛋白凝结、 亲水无毒等性能而广泛应用于 食品工业中。卡拉胶还用于医药行业， 如作为微生物培养基、 缓释胶囊 / 片剂、 药膏基、 鱼肝 油乳化剂等。卡拉胶寡糖是卡拉胶的降解产物， 分子量较小， 溶解性较好， 同时因糖链上的 活性基团充分暴露出来， 使其活性较卡拉胶显著提高， 拓宽了医药上的应用领域。 研究发现 卡拉胶寡糖具有特殊的医药疗效， 它对许多重要病毒病原 （如疱疹病毒、 粘液病毒、 HPV 等） 具有广谱抑制活性， 有。
13、许多证据表明卡拉胶寡糖能够在抗 HIV 上提供保护。卡拉胶寡糖还 对免疫系统具有持续性作用， 能有效的抗胃蛋白酶活、 抗溃疡、 抗凝血、 抗栓物质。 0004 目前降解卡拉胶的方法有物理法、 化学法、 酶解法。 其中酶解法以其降解过程容易 控制， 反应条件温和， 对环境没有污染等优点而倍受青睐。 虽然目前已在很多种微生物中发 现卡拉胶酶， 但由于酶活不高， 产酶量小等缺点， 不能满足对卡拉胶寡糖日益增长的需求， 因此寻找具有能分泌降解卡拉胶能力酶的菌种是十分需要的。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种能分泌卡拉胶降解酶的新菌种， 并提供该新菌种的分 离培养方法和降解卡拉胶生成寡糖的方。
14、法。 （以下部分与权利要求一致） 0006 本发明所述的卡拉胶降解菌 （Pedobacter hainanensis sp.） 13-Q 菌株 （CGMCC NO.5564） 分离自海南省海口市黎安镇麒麟菜晾晒处的土壤中， 经一系列形态学、 生理生化、 16S rRNA、 脂肪酸组分分析、 醌型分析表明它属于土地杆菌属， 但又区别于土地杆菌属中的 其它种， 定名为卡拉胶降解菌 （Pedobacter hainanensis sp.） 13-Q。该菌分类位置比较独 立， 申请人已针对该菌发展了一套培养技术， 能从该菌稳定生产具有降解卡拉胶能力的酶。 该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生。
15、物中心保藏， 保藏单位名称 ： 中国普 通微生物菌种保藏管理中心， 保藏日期 ： 2011 年 12 月 9 日， 其保藏编号为 CGMCC NO.5564。 0007 所述卡拉胶降解菌菌株的生物化学特征为 ： 0008 菌落形态特征为 ： 0009 在卡拉胶固体培养基上生长良好， 菌落黄色， 圆形， 表面略凸起， 光滑， 反光， 不透 明， 边缘整齐， 直径约为 1.0mm ； 0010 菌体形态特征为 ： 说 明 书 CN 102994408 A 4 2/8 页 5 0011 细胞杆状， 0.30.5m1.32.0m， 单个或成对排列， 革兰氏染色阴性， 不生孢， 运动 ； 0012 主要。
16、生理生化特征 ： 0013 在卡拉胶液体培养基中可产生卡拉胶降解酶 ； 好氧 ； 可以利用 L- 阿拉伯糖、 D- 木 糖、 半乳糖、 葡萄糖、 果糖、 甘露醇、 鼠李糖、 - 甲基 -D- 葡萄糖苷、 N- 乙酰 - 葡萄糖胺、 熊 果苷、 七叶灵、 柳醇、 纤维二糖、 麦芽糖、 乳糖、 海藻糖、 龙胆二糖、 D- 松二糖、 葡萄糖酸盐。但 是葡萄糖和阿拉伯糖产酸。该菌的氧化酶、 过氧化氢酶、 碱性磷酸酶、 酯酶 （C4） 、 类脂酯酶 （C8） 反应为阳性 ； 不呈现脲酶、 色氨酸脱氨酶、 鸟氨酸脱羧酶活性 ； 该菌不能水解淀粉、 明 胶、 酪素、 菊糖等 ； 不生成吲哚和硫化氢 ； 硝酸。
17、盐还原呈阴性反应 ； 在麦康凯培养基上不能 生长。 0014 脂肪酸组分特征 ： 0015 主要脂肪酸及比例为 iso-C15:0(40.4%),iso-C15 0 2-OH and/or C16:17c(18.9%) and iso-C17:0 3-OH(18.4%)。 0016 醌型特征 ： 0017 主要优势醌为甲基萘醌 K7（MK-7） ， 含量大约为 92.9。 0018 DNA G+C mol% 含量特征 ： 0019 DNA G+C mol% 含量为 42.7%。 0020 遗传学特征 ： 0021 所述卡拉胶降解菌 （Pedobacter hainanensis sp.） 13。
18、-Q 菌株的 16S rRNA 全基因 序列。菌株 16S rRNA 全基因序列 （1391bp） (Genbank 登录号为 ： JQ083404) 为 ： 0022 1 gtcgaggggc agcggggact ttcgggttcg ccggcgaccg gcgcacgggt gcgtaacgcg 0023 61 tatgcaacct acctttatca gggggatagc ccggagaaat ccggattaac accgcataaa 0024 121 atcacagtac cgcatggtat aatgatcaaa tatttatagg ataaagatgg gcatgcgtg。
19、t 0025 181 cattagctag ttggagaggt aacggctcac caaggcgacg atgactaggg gatctgagag 0026 241 gatgaccccc cacactggta ctgagacacg gaccagactc ctacgggagg cagcagtaag 0027 301 gaatattggt caatggaggg aactctgaac cagccatgcc gcgtgcagga agactgccct 0028 361 atgggttgta aactgctttt gtatgggaat aaaccctggt atgtatacca ggctgaatg。
20、t 0029 421 accataagaa taaggatcgg ctaactccgt gccagcagcc gcggtaatac ggaggatcca 0030 481 agcgttatcc ggatttattg ggtttaaagg gagcgtaggc ggcctgttaa gtcaggggtg 0031 541 aaagacggtg gctcaaccat cgcagtgcct ttgatactga taggcttgaa tatagttgag 0032 601 gtaggcggaa tgtgacaagt agcggtgaaa tgcatagata tgtcacagaa caccgattg。
21、c 0033 661 gaaggcagct tactaaacta atattgacgc tgaggctcga aagcgtgggg atcaaacagg 0034 721 attagatacc ctggtagtcc acgccctaaa cgatgataac tcgatgttag cgatatacag 0035 781 ttagcgtcca agcgaaagcg ttaagttatc cacctgggga gtacgcccgc aagggtgaaa 0036 841 ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggaggagca tgtggtttaa ttcgatgat。
22、a 0037 901 cgcgaggaac cttacccggg cttgaaagtt actgcattac tcagagatga gtaagacctt 0038 961 cgggacagga aactaggtgc tgcatggctg tcgtcagctc gtgccgtgag gtgttgggtt 0039 1021 aagtcccgca acgagcgcaa cccctatgtt tagttgccag catttaaggt ggggactcta 0040 1081 aacagactgc ctgcgcaagc agagaggaag gatgggacga cgtcaagtca tcatggc。
23、cct 说 明 书 CN 102994408 A 5 3/8 页 6 0041 1141 tacgtccggg gctacacacg tgctacaatg gtcggtacag agggccgcta cccagcgatg 0042 1201 ggatgccaat ctcaaaaagc cgatcacagt tcggatcggg gtctgcaact cgaccccgtg 0043 1261 aagttggatt cgctagtaat cgcgtatcag caatgacgcg gtgaatacgt tcccgggcct 0044 1321 tgtacacacc gcccgtcaag ccatg。
24、gaagt tgggggtgcc taaagtccgt aaccgcaagg 1381 atcggcctag g 0045 根据 Bergey s Manual of Deteminative Bacteriology(Ninth Edition)（John G.Holt et al.1994） 和MIDI公司Sherlock全自动细菌鉴定系统脂肪酸成份分析以及形态 和生理生化特征， 本发明菌株与土地杆菌属有相似性， 用Phylip软件包对其16S rRNA序列 进行系统学分析， 并用邻接法 （Neigbor-Joining） 构建系统树表明本菌株与土地杆菌属属 于同一类群， 关系最紧密。 1。
25、6S rRNA序列分析表明， 与Genbank国际基因序列数据库记录的 最相似的菌株 Pedobacter terricola DS-40T (EF446146) 的相似性为 95.2%。 0046 卡拉胶降解菌的发酵方法 0047 1） 将卡拉胶降解菌划线于卡拉胶固体培养基上， 在 25-35 摄氏度培养 72-96 小 时 ； 0048 2）将固体培养基种子接 1-3 环于种子培养基的试管中， 于 25-35 摄氏度下以 150-210rpm 转速培养 48-72 小时。 0049 3） 按体积比为 1/501.5/5 将种子培养基接入发酵培养基中， 25-35 摄氏度下以 150-210。
26、rpm 转速培养 48-96 小时。获取发酵物。 0050 所述卡拉胶固体培养基 （g/L） ： 琼脂粉 ： 7-15， 蛋白胨 ： 3-8， 酵母浸出粉 0.5-5， 卡 拉胶 ： 1-10， 氯化钠 ： 0-20， FeSO47H2O ： 0.01-0.05 ； MgSO47H2O ： 0.2-1.0 ； CaCl2： 0.1-0.5 ； KH2PO4： 0.5-4， 余量为水， pH 6.0-8.0。 0051 所述种子培养基 （g/L） ： 酵母浸膏 ： 0.5-5， 蛋白胨 ： 2-10， 卡拉胶 ： 1-10， 余量为水， 氯化钠 ： 0-20， pH6.0-8.0。 0052 所。
27、 述 发 酵 培 养 基 （g/L） ： 卡 拉 胶 0.2-1， 蛋 白 胨 2-8， 酵 母 浸 出 粉 ： 0.5-5， FeSO47H2O ： 0.01-0.05 ； MgSO47H2O ： 0.2-1.0 ； CaCl2： 0.1-0.5 ； KH2PO4： 0.5-4， 用 水 补 足 1000ml， pH 6.0-8.0。 0053 所述卡拉胶降解菌 13-Q 可用于发酵生产具有降解卡拉胶能力的酶。 0054 本发明的优点 ： 0055 本发明所述的卡拉胶降解菌 （Pedobacter hainanensis sp.） 13-Q CGMCC NO.5564 的优点 ： 0056 。
28、1. 在此之前没有报道过土地杆菌属中能生产卡拉胶降解酶的细菌， 该发明为首次 发现土地杆菌属中该菌还可以进一步遗传选育或改良得到更优良的工业生产用菌 ； 对目前 卡拉胶降解酶日益增加的需求， 本发明为之找到了一条新的生产途径。 0057 2. 具有生产降解卡拉胶能力的酶的用途， 该菌能稳定的产生含量较高的卡拉胶降 解酶。 0058 3. 可应用该菌发酵得到的卡拉胶降解酶制备与其它细菌不同聚合度的卡拉胶寡 糖。 附图说明 说 明 书 CN 102994408 A 6 4/8 页 7 0059 图 1. 脂肪酸组分及比例图 ； 0060 图 2. 醌型分析结果图 ； 0061 图 3. 卡拉胶降解。
29、菌 （Pedobacter hainanensis sp.） 13-Q 菌株 CGMCC NO.5564 酶 解卡拉胶聚糖得到的高效液相色谱图。 0062 图 4. 卡拉胶降解菌 （Pedobacter hainanensis sp.） 13-Q 菌株 CGMCC NO.5564 酶 解卡拉胶聚糖得到的质谱图。 0063 卡拉胶降解菌， 命名为卡拉胶降解菌13-Q， 即Pedobacter hainanensis sp.13-Q， 该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏， 保藏单位名称 ： 中国普 通微生物菌种保藏管理中心， 简称 CGMCC， 地址 : 中国北京市朝阳区北辰。
30、西路 1 号院 3 号中 国科学院微生物研究所， 保藏日期 ： 2011 年 12 月 9 日， 其保藏编号为 CGMCC NO.5564。 0064 表 1. 卡拉胶降解菌 （Pedobacter hainanensis sp.） 13-Q 菌株 CGMCC NO.5564 的 16S rRNA 序列。 具体实施方式 0065 实施例 1 0066 卡拉胶降解菌 （Pedobacter hainanensis sp.） 13-Q 的分离和纯化。 0067 1、 菌株的分离 ： 0068 （1） 采集样品 0069 采集海南省海口市黎安镇麒麟菜晾晒处的土壤后， 取 10g， 加无菌水 90ml。
31、， 制成土 壤悬浮液。 0070 （2） 菌株分离 0071 取菌液 1ml， 用无菌水依次稀释 10-3-10-6倍， 于卡拉胶固体培养基上划线， 卡拉胶 固体培养基配方 （g/L） ： 琼脂粉 ： 7-15， 蛋白胨 ： 3-8， 酵母浸出粉 0.5-5， 卡拉胶 ： 1-10， 氯化 钠 ： 0-20， FeSO47H2O ： 0.01-0.05 ； MgSO47H2O ： 0.2-1.0 ； CaCl2： 0.1-0.5 ； KH2PO4： 0.5-4， pH 6.0-8.0， 余量为水。 0072 （3） 菌株的纯化 0073 按照微生物纯种分离的常规方法， 将上述培养基于 30放置。
32、 3-5 天。挑取多个单 菌落， 接种到新的卡拉胶固体培养基上， 至少重复 10 次， 纯化菌落。再在液体培养基中进行 发酵检验， 结果得到一株卡拉胶酶产量较高的菌株。 0074 所述种子培养基 （g/L） ： 酵母浸膏 ： 0.5-5， 蛋白胨 ： 2-10， 卡拉胶 ： 1-10， 氯化钠 ： 0-20， pH6.0-8.0， 用水不足 1000ml。 0075 所 述 发 酵 培 养 基 （g/L） ： 卡 拉 胶 0.2-1， 蛋 白 胨 2-8， 酵 母 浸 出 粉 ： 0.5-5， FeSO47H2O ： 0.01-0.05 ； MgSO47H2O ： 0.2-1.0 ； CaCl。
33、2： 0.1-0.5 ； KH2PO4： 0.5-4， 用 水 补 足 1000ml， pH 6.0-8.0。 0076 实施例 2 0077 卡拉胶降解菌 （Pedobacter hainanensis sp.） 13-Q 菌株的分离的鉴定。 0078 （1） 卡拉胶降解菌 （Pedobacter hainanensis sp.） 13-Q 菌株的菌体及菌落形态 特征 ： 0079 卡 拉 胶 降 解 菌 （Pedobacter hainanensis sp.） 13-Q 菌 株 为 杆 状， 说 明 书 CN 102994408 A 7 5/8 页 8 0.30.5m1.32.0m， 单个。
34、或成对排列， 革兰氏染色阴性， 不生孢， 运动 ； 在卡拉胶固体 培养基上生长良好， 菌落黄色， 圆形， 表面略凸起， 光滑， 反光， 不透明， 边缘整齐， 直径约为 1.0mm。 0080 （2） 卡拉胶降解菌 （Pedobacter hainanensis sp.） 13-Q 菌株的生理生化特征 ： 0081 好氧， 可以利用 L- 阿拉伯糖、 D- 木糖、 半乳糖、 葡萄糖、 果糖、 甘露醇、 鼠李糖、 - 甲基 -D- 葡萄糖苷、 N- 乙酰 - 葡萄糖胺、 熊果苷、 七叶灵、 柳醇、 纤维二糖、 麦芽糖、 乳糖、 海藻糖、 龙胆二糖、 D-松二糖、 葡萄糖酸盐。 但是葡萄糖和阿拉伯糖。
35、产酸。 该菌的氧化酶、 过 氧化氢酶、 碱性磷酸酶、 酯酶 (C4)、 类脂酯酶 （C8） 反应为阳性 ； 不呈现脲酶、 色氨酸脱氨酶、 鸟氨酸脱羧酶活性 ； 该菌不能水解淀粉、 明胶、 酪素、 菊糖等 ； 不生成吲哚和硫化氢 ； 硝酸盐 还原呈阴性反应 ； 在麦康凯培养基上不能生长。 0082 （3） 脂肪酸组分特征 ： 0083 主 要 脂 肪 酸 及 比 例 为 iso-C15:0(40.4 ),iso-C15 0 2-OH and/or C16 17c(18.9 )and iso-C17:0 3-OH(18.4 )（图 .1） 。 0084 醌型特征 ： 0085 主要优势醌为甲基萘醌。
36、 K7（MK-7） ， 含量大约为 92.9 ( 图 .2)。 0086 DNA G+C mol含量特征 ： 0087 DNA G+C mol含量为 42.7。 0088 遗传学特征 ： 0089 16S rRNA 碱基序列 （表 .1） ； 菌株 16S rRNA 全基因序列共 1391bp(Genbank 登录号 为 ： JQ083404)。 0090 表 1 ： 0091 1 gtcgaggggc agcggggact ttcgggttcg ccggcgaccg gcgcacgggt gcgtaacgcg 0092 61 tatgcaacct acctttatca gggggatagc 。
37、ccggagaaat ccggattaac accgcataaa 0093 121 atcacagtac cgcatggtat aatgatcaaa tatttatagg ataaagatgg gcatgcgtgt 0094 181 cattagctag ttggagaggt aacggctcac caaggcgacg atgactaggg gatctgagag 0095 241 gatgaccccc cacactggta ctgagacacg gaccagactc ctacgggagg cagcagtaag 0096 301 gaatattggt caatggaggg aactctgaac 。
38、cagccatgcc gcgtgcagga agactgccct 0097 361 atgggttgta aactgctttt gtatgggaat aaaccctggt atgtatacca ggctgaatgt 0098 421 accataagaa taaggatcgg ctaactccgt gccagcagcc gcggtaatac ggaggatcca 0099 481 agcgttatcc ggatttattg ggtttaaagg gagcgtaggc ggcctgttaa gtcaggggtg 0100 541 aaagacggtg gctcaaccat cgcagtgcct 。
39、ttgatactga taggcttgaa tatagttgag 0101 601 gtaggcggaa tgtgacaagt agcggtgaaa tgcatagata tgtcacagaa caccgattgc 0102 661 gaaggcagct tactaaacta atattgacgc tgaggctcga aagcgtgggg atcaaacagg 0103 721 attagatacc ctggtagtcc acgccctaaa cgatgataac tcgatgttag cgatatacag 0104 781 ttagcgtcca agcgaaagcg ttaagttatc 。
40、cacctgggga gtacgcccgc aagggtgaaa 0105 841 ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggaggagca tgtggtttaa ttcgatgata 0106 901 cgcgaggaac cttacccggg cttgaaagtt actgcattac tcagagatga gtaagacctt 0107 961 cgggacagga aactaggtgc tgcatggctg tcgtcagctc gtgccgtgag gtgttgggtt 0108 1021 aagtcccgca acgagcgcaa cccctatgtt。
41、 tagttgccag catttaaggt ggggactcta 说 明 书 CN 102994408 A 8 6/8 页 9 0109 1081 aacagactgc ctgcgcaagc agagaggaag gatgggacga cgtcaagtca tcatggccct 0110 1141 tacgtccggg gctacacacg tgctacaatg gtcggtacag agggccgcta cccagcgatg 0111 1201 ggatgccaat ctcaaaaagc cgatcacagt tcggatcggg gtctgcaact cgaccccgtg 0112 12。
42、61 aagttggatt cgctagtaat cgcgtatcag caatgacgcg gtgaatacgt tcccgggcct 0113 1321 tgtacacacc gcccgtcaag ccatggaagt tgggggtgcc taaagtccgt aaccgcaagg 1381 atcggcctag g 0114 实施例 3 0115 种卡拉胶降解菌 (（Pedobacter hainanensis sp.） 13-Q 菌株 CGMCC ： 5564 的发 酵工艺 ： 0116 1） 将卡拉胶降解菌划线于卡拉胶固体培养基上， 在 25 摄氏度培养 4 天 ； 0117 2）。
43、 将固体培养基种子接 1-3 环于种子培养基中， 于 25 摄氏度下以 150rpm 转速培 养 48 小时。 0118 3） 按体积比为 1/501.5/5 将种子培养基接入 1 升发酵培养基中， 25 摄氏度下以 150 转速培养 4 天。获取发酵物。 0119 所述卡拉胶固体培养基 （g/L） ： 琼脂粉 ： 7-15， 蛋白胨 ： 3-8， 酵母浸出粉 0.5-5， 卡 拉胶 ： 1-10， 氯化钠 ： 0-20， FeSO47H2O ： 0.01-0.05 ； MgSO47H2O ： 0.2-1.0 ； CaCl2： 0.1-0.5 ； KH2PO4： 0.5-4， 余量为水， pH。
44、 6.0-8.0。 0120 所述种子培养基 （g/L） ： 酵母浸膏 ： 0.5-5， 蛋白胨 ： 2-10， 卡拉胶 ： 1-10， 蒸馏水 1000ml， 氯化钠 ： 0-20， 余量为水， pH6.0-8.0。 0121 所 述 发 酵 培 养 基 （g/L） ： 卡 拉 胶 0.2-1， 蛋 白 胨 2-8， 酵 母 浸 出 粉 ： 0.5-5， FeSO47H2O ： 0.01-0.05 ； MgSO47H2O ： 0.2-1.0 ； CaCl2： 0.1-0.5 ； KH2PO4： 0.5-4， 用 水 补 足 1000ml， pH 6.0-8.0。 0122 实施例 4 012。
45、3 一种卡拉胶降解菌 （Pedobacter hainanensis sp.） 13-Q菌株CGMCC ： 5564的发酵 工艺 ： 0124 1） 将卡拉胶降解菌接种于卡拉胶固体培养基上， 在 30 摄氏度培养 4 天 ； 0125 2） 将固体培养基种子接于种子培养基的试管中， 于 30 摄氏度下以 180rpm 转速培 养 48 小时。 0126 3） 按体积比为 1/51.5/5 将种子培养基接入 5 升发酵培养基中， 30 摄氏度下以 180 转速培养 4 天。获取发酵物。 0127 所述卡拉胶固体培养基 （g/L） ： 琼脂粉 ： 7-15， 蛋白胨 ： 3-8， 酵母浸出粉 0.。
46、5-5， 卡 拉胶 ： 1-10， 氯化钠 ： 0-20， FeSO47H2O ： 0.01-0.05 ； MgSO47H2O ： 0.2-1.0 ； CaCl2： 0.1-0.5 ； KH2PO4： 0.5-4， 用水补足 1000ml， pH 6.0-8.0。 0128 所述种子培养基 （g/L） ： 酵母浸膏 ： 0.5-5， 蛋白胨 ： 2-10， 卡拉胶 ： 1-10， 氯化钠 ： 0-20， 用水补足 1000ml， pH6.0-8.0。 0129 所 述 发 酵 培 养 基 （g/L） ： 卡 拉 胶 0.2-1， 蛋 白 胨 2-8， 酵 母 浸 出 粉 ： 0.5-5， Fe。
47、SO47H2O ： 0.01-0.05 ； MgSO47H2O ： 0.2-1.0 ； CaCl2： 0.1-0.5 ； KH2PO4： 0.5-4， 用 水 补 足 1000ml， pH 6.0-8.0。 0130 实施例 5 说 明 书 CN 102994408 A 9 7/8 页 10 0131 一种卡拉胶降解菌 （Pedobacter hainanensis sp.） 13-Q菌株CGMCC ： 5564的发酵 工艺 ： 0132 1） 将卡拉胶降解菌接种于卡拉胶固体培养基上， 在 35 摄氏度培养 4 天 ； 0133 2） 将固体培养基种子接 1-3 环于种子培养基的试管中， 于 。
48、35 摄氏度下以 210rpm 转速培养 48 小时。 0134 3） 按体积比为 1/51.5/5 将种子培养基接入 1 升发酵培养基中， 35 摄氏度下以 210 转速培养 4 天。获取发酵物。 0135 所述卡拉胶固体培养基 （g/L） ： 琼脂粉 ： 7-15， 蛋白胨 ： 3-8， 酵母浸出粉 0.5-5， 卡 拉胶 ： 1-10， 氯化钠 ： 0-20， FeSO47H2O ： 0.01-0.05 ； MgSO47H2O ： 0.2-1.0 ； CaCl2： 0.1-0.5 ； KH2PO4： 0.5-4， 用水补足 1000ml， pH 6.0-8.0。 0136 所述种子培养基 （g/L） ： 酵母浸膏 ： 0.5-5， 蛋白胨 ： 2-10， 卡拉胶 ： 1-10， 氯化钠 ： 0-20， 用水补足 1000ml， pH6.0-8.0。 0137 所 述 发 酵 培 养 基 （g/L） ： 卡 拉 胶 0.2-1， 蛋 白 胨 2-8， 酵 母 浸 出 粉 ： 0.5-5， FeSO47H2O ： 0.01-0.05 ； MgSO47H2O ： 0.2-1.0 ； CaCl2： 0.1-0.5 ； KH2PO4： 0.5-4， 用 水 补 足 100。