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1、(10)申请公布号 CN 102860408 A (43)申请公布日 2013.01.09 CN 102860408 A *CN102860408A* (21)申请号 201210357191.8 (22)申请日 2012.09.24 A23K 1/00(2006.01) C12N 1/00(2006.01) C12N 1/16(2006.01) C12N 1/18(2006.01) C12N 1/20(2006.01) C12R 1/865(2006.01) C12R 1/72(2006.01) C12R 1/125(2006.01) C12R 1/10(2006.01) C12R 1/24。
2、5(2006.01) (71)申请人 江西昌丰由由生物科技有限公司 地址 331100 江西省宜春市丰城市富硒产业 园 (72)发明人 朱建航 张帆 邹晓阳 谢莉 胡波平 (74)专利代理机构 南昌市平凡知识产权代理事 务所 36122 代理人 夏材祥 (54) 发明名称 一种饲用多功能微生物活菌制剂的制备方法 (57) 摘要 本发明公开了一种饲用多功能微生物活菌制 剂的制备方法。该制剂由酿酒酵母、 产朊假丝酵 母、 枯草芽孢杆菌、 地衣芽孢杆菌和干酪乳酸菌 的两种或两种以上组成的混合菌在特定培养基 中培养， 发酵过程采取添加亚硒酸钠， 发酵温度 28-35， 发酵36-48h小时， 获得富含。
3、有机硒和 谷胱甘肽的微生物活菌制剂。该制剂一方面具有 常规微生物活菌制剂的功能， 如能调节动物肠道 微生态平衡， 增强机体免疫机能和抗应激能力， 另 一方面富含有机硒和谷胱甘肽， 具有硒利用率高、 毒性低、 增强动物免疫能力等优点， 能够有效提高 畜禽养殖效益。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 6 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 6 页 1/2 页 2 1. 一种饲用多功能微生物活菌制剂的制备方法， 其特征是 ： A、 种子纯培养 ： （1） 酿酒酵母、 产朊假丝酵母的纯种培养 (a) 菌种活化 无菌条件下取酿酒酵。
4、母或产朊假丝酵母的冻干菌种， 划线接种于试管麦芽汁琼脂斜 面， 30培养 1836 小时， 至斜面上肉眼可见菌落时， 即可准备移种 ； (b) 一级种子培养 无菌条件下用接种环挑取单菌落， 接入装有种子培养液的三角瓶中， 30培养 1848 小时， 至菌体 600nm 吸光值为 1-5 左右时， 可移种至二级种子 ； 种子培养基组成为 12Brix. 麦芽汁 ； (c) 二级种子培养 无菌条件下、 二级种子液以体积比 10% 的接种量接入 50 L 发酵罐， 装量系数为 v/v 60%， 二级种子培养基为 ： 葡萄糖 30 g/L， 酵母浸膏 5 g/L， 蛋白胨 5 g/L， (NH4)2S。
5、O4 3g/L， MgSO47H2O 0.2 g/L， NaCl 0.1 g/L， KH2PO4 2 g/L， 自来水定容， 调 pH6.0， 30培养 24 小 时， 搅拌 150r/min， 通气量 0.5 m3/h ； 当种子液 600nm 吸光值为 5-10 左右时， 可作为二级种 子液接入发酵培养基中 ； (2) 枯草芽孢杆菌、 地衣芽孢杆菌的纯种培养 (a) 菌种活化 无菌条件下取枯草芽孢杆菌、 地衣芽孢杆菌的冻干菌种， 划线接种于试管营养肉汤琼 脂斜面， 37培养 1824 小时， 然后划线转接于营养肉汤琼脂茄子瓶斜面， 37培养 2024 小时， 镜检当 90% 以上菌体形成芽。
6、孢时， 即可准备移种 ； (b) 一级种子培养 用无菌水将茄子瓶斜面上的菌泥刮洗下来， 装入内有玻璃珠的无菌三角瓶中， 振荡分 散， 获得均匀的菌悬液 ； 将菌悬液在 85水浴中加热 5 分钟， 以体积比 5% 的接种量接入 5L 三角瓶中， 三角瓶装量系数为 v/v 40% ； 种子培养基组成为 ： 葡糖糖 10 g/L， 蛋白胨 5 g/L， 酵母膏 3 g/L， NaCl 5 g/L， 自来水定容， 调 pH7.0-7.5， 37培养 18-24h， 搅拌转速 150r/ min， 通气量为 0.5m3/h ； 当种子液 600nm 吸光值为 2-5 时， 即可移种 ； (c) 二级种子。
7、培养 无菌条件下、 将一级种子液按体积 10% 的接种量接入 50 L 发酵罐， 装量系数为 v/v 60%， 二级种子培养基为 ： 葡糖糖 30 g/L， 蛋白胨 10 g/L， 酵母膏 5 g/L， NaCl 5 g/L， 自来 水定容， 调 pH7.0-7.5， 37培养 18-24h， 搅拌转速 150r/min， 通气量为 0.5m3/h ； 当种子液 600nm 吸光值为 5-10 时， 即可移种 ； (3) 干酪乳酸菌的纯种培养 (a) 菌种活化 无菌条件下取干酪乳酸菌的冻干菌种， 接入装有活化培养基的试管中， 进行静置厌氧 培养 ； 活化培养基组成为 ： 葡萄糖20 g/L， 。
8、蛋白胨10 g/L,牛肉浸膏10 g/L， 酵母浸膏5 g/ L， K2HPO42 g/L， 柠檬酸二胺 2 g/L， NaAc 5 g/L， 吐温 -80 1 g/L， MgSO47H2O 0.2 g/L， MnSO4H2O 0.05 g/L， CaCO3 20 g/L， pH6.5， 37培养 30-36h， 然后以体积比 10% 的接种量 转接于新鲜活化培养基中， 37静置厌氧培养 24-36h ； 权 利 要 求 书 CN 102860408 A 2 2/2 页 3 (b) 一级种子培养 活化菌液以体积比10%接种量接入5L三角瓶中， 三角瓶的装量系数为v/v 60%， 种子培 养基组。
9、成为 ： 葡萄糖 30 g/L， 蛋白胨 10 g/L, 牛肉浸膏 10 g/L， 酵母浸膏 5 g/L， K2HPO42 g/ L， 柠檬酸二胺 2 g/L， NaAc 5 g/L， 吐温 -801 g/L， MgSO47H2O 0.2 g/L， MnSO4H2O 0.05 g/L， CaCO310 g/L， pH6.5， 37静置厌氧培养 30-36 h ； (c) 二级种子培养 无菌条件下、 一级种子液以体积比 10% 接种量接入 30 L 发酵罐中， 发酵罐的装量系数 为 v/v 80%， 种子培养基组成为 ： 葡萄糖 30g/L， 蛋白胨 10g/L, 牛肉浸膏 10g/L， 酵母浸。
10、膏 5g/L， K2HPO4 2g/L， 柠檬酸二胺 2g/L， NaAc 5g/L， 吐温 -801 g/L， MgSO47H2O 0.2 g/L， MnSO4H2O 0.05g/L， CaCO3 10g/L， pH6.5， 37静置厌氧培养 30-36h ； B、 酵母菌、 芽孢菌和乳酸菌的混合培养 (1) 混合发酵培养基的制备 按质量将红糖 60-100g、 玉米浆 10-40g、 硫酸铵 5-20g、 硫酸镁 2-10g、 磷酸二氢钾 5-20g、 磷酸氢二钾 5-20g、 柠檬酸二胺 0.5-2g、 氯化锌 0.05-0.1g、 氯化钙 0.1-0.2g 混合均 匀， 加入蒸馏水定容。
11、1升， 充分搅拌溶解完全后密封加热至80-90灭菌0.5-2小时， 冷却至 室温备用 ； 另配制浓度为 1-5g/L 的亚硒酸钠溶液 100ml， 经 0.22m 无菌过滤器除菌， 4 下保存备用 ； (2) 混合发酵工艺 将按步骤 A 制备的酵母混合种子液、 芽孢混合种子液、 干酪乳酸菌种子液等二级种子 液按体积比 12: 12: 12 混合， 以 V/W5%20% 的接种量将混合菌加入到灭菌的发酵液体 培养基中， 同时再加入一定量亚硒酸钠溶液使得发酵培养基中的亚硒酸钠终浓度为 1050 mg/L， 在30-37， 转速50-200r/min， 通气量0.5-2m3/h下， 培养24-36h。
12、， 然后厌氧静置培养 24-48h， 直接制得液态饲用多功能微生物活菌制剂。 权 利 要 求 书 CN 102860408 A 3 1/6 页 4 一种饲用多功能微生物活菌制剂的制备方法 技术领域 0001 本发明的应用范围涉及畜牧养殖业领域， 具体涉及一种饲用多功能微生物活菌制 剂。 它一方面具有常规微生物活菌制剂的功能， 如调节动物肠道微生态平衡， 增强机体免疫 机能和抗应激等能力 ； 另一方面富含有机硒， 养殖过程中具有硒利用率高、 毒性低、 对环境 污染小等优点 ； 同时该制剂还富含谷胱甘肽和 L- 乳酸， 可有效提高畜禽养殖效益。 技术背景 0002 畜禽饲料中添加抗生素可提高养殖效。
13、益。但抗生素的过量使用会带来药物残留、 细菌耐药性等问题， 极大地威胁人体健康。 2006年1月， 欧盟已全面禁止使用抗生素促生长 饲料添加剂。日本对畜牧业中使用抗生素也有严格的规定。美国 FDA 和 CDC( 疾病控制中 心 ) 也号召重新评估抗生素饲料添加剂的继续使用。目前， 我国对绿色安全、 无抗生素残留 的畜禽产品的需求日趋旺盛， 抗生素饲用替代品成为应用推广的热点。 0003 饲用微生物活菌制剂是采用包括干酪乳杆菌、 嗜乳酸杆菌、 乳链球菌、 枯草芽孢 杆菌、 纳豆芽孢杆菌、 酿酒酵母、 产朊假丝酵母、 沼泽红假单胞菌等在内的多种我国农业部 允许使用的有益微生物制成的含有活菌制剂， 。
14、属于营养保健类饲料添加剂， 具有无毒、 无残 留、 无抗药性等优点， 应用前景广阔。 0004 当前动物日粮主要的补硒方式是添加亚硒酸钠。由于亚硒酸离子生物有效性低、 毒性大、 且易污染环境， 瑞典已限制其在乳猪料中使用 , 日本则全面禁止其在动物饲料添 加。富硒酵母作为一种有机硒饲料添加剂 , 具有硒利用率高、 毒性低、 环境污染小等优点 , 其添加效果大大优于亚硒酸盐。 0005 谷胱甘肽具有清除自由基和解毒， 促进氨基酸转运， 保护胃肠粘膜， 提高免疫力， 参与蛋白质合成与降解， 调节基因的复制、 转录， 调节细胞生长等多种生物学功能。 近年来， 谷胱甘肽作为饲料添加剂、 免疫增强剂或某。
15、些畜禽疾病的治疗药物， 在畜禽养殖业中展示 了良好的应用前景。 0006 基于上述背景， 开发出一种兼有常规微生态功能， 同时又富含生物有机硒与谷胱 甘肽的微生物活菌制剂， 应用于畜牧养殖业， 对减少抗生素和化学药物的使用， 生产安全的 富硒畜禽产品， 提高养殖效益具有重要意义。 发明内容 0007 本发明的目的是针对现有微生物活菌制剂功能单一， 提供一种饲用多功能微生物 活菌制剂， 该制剂除具有常规微生态制剂的功能外， 同时还富含有机硒蛋白与谷胱甘肽。 有 机硒蛋白能有效补充动物日粮中的硒元素， 具有低毒， 快速吸收， 环境污染小等优点。谷胱 甘肽具有清除自由基和解毒， 促进氨基酸转运， 保。
16、护胃肠粘膜， 提高免疫力， 参与蛋白质合 成与降解， 调节基因的复制、 转录， 调节细胞生长等功能。 0008 本发明的目的通过以下技术方案实现 ： 本发明的饲用多功能微生物活菌制剂是呈红棕色液态， 含有多种混合菌株， 以 说 明 书 CN 102860408 A 4 2/6 页 5 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)、 产朊假丝酵母 (Candida tails)、 枯草芽孢 杆菌 (Bacillus subtilis)、 地衣芽孢杆菌 (Bacillus licheniformis)、 干酪乳酸菌 (Lactobacillus easei) 等五种有益微生物及日。
17、粮必须的微量元素有机硒蛋白和免疫增强 剂谷胱甘肽为特征组分， 采用添加亚硒酸钠， 通过发酵罐混合培养多种微生物， 按照特定发 酵工艺直接发酵制成。 0009 该饲用多功能微生物活菌制剂是由酿酒酵母、 产朊假丝酵母、 枯草芽孢杆菌、 地 衣芽孢杆菌、 干酪乳酸菌五种益生菌组成， 其中富含有机硒蛋白和谷胱甘肽 ； 制剂中活菌 总数分别为 ： 酿酒酵母 1108CFU/ml， 产朊假丝酵母 1108CFU/ml， 枯草芽孢杆菌 1109CFU/ml， 地衣芽孢杆菌 1109CFU/ml， 干酪乳酸菌 1109CFU/ml， 制剂中含有 功能性营养物分别为有机硒含量 10mg/L-50mg/L， 谷胱。
18、甘肽含量 0.5-5g/L， L- 乳酸的含量 10g/L-60g/L。 0010 本发明所述饲用多功能微生物活菌制剂的制备工艺步骤为 ： 1、 种子纯培养 ： （1） 酿酒酵母、 产朊假丝酵母的纯种培养 (a) 菌种活化 无菌条件下取酿酒酵母或产朊假丝酵母的冻干菌种， 划线接种于试管麦芽汁琼脂斜 面， 30培养 1836 小时， 至斜面上肉眼可见菌落时， 即可准备移种 ； (b) 一级种子培养 无菌条件下用接种环挑取单菌落， 接入装有种子培养液的三角瓶中， 30培养 1848 小时， 至菌体 600nm 吸光值为 1-5 左右时， 可移种至二级种子。种子培养基组成为 12Brix. 麦芽汁 。
19、； (c) 二级种子培养 无菌条件下， 二级种子液以体积比 10% 的接种量接入 50 L 发酵罐， 装量系数为 60%(v/ v)， 二级种子培养基为 ： 葡萄糖 30 g/L， 酵母浸膏 5 g/L， 蛋白胨 5 g/L， (NH4)2SO4 3g/L， MgSO47H2O 0.2 g/L， NaCl 0.1 g/L， KH2PO4 2 g/L， 自来水定容， 调 pH6.0， 30培养 24 小 时， 搅拌 150r/min， 通气量 0.5 m3/h。当种子液 600nm 吸光值为 5-10 左右时， 可作为二级 种子液接入发酵培养基中 ； (2) 枯草芽孢杆菌、 地衣芽孢杆菌的纯种培。
20、养 (a) 菌种活化 无菌条件下取枯草芽孢杆菌、 地衣芽孢杆菌的冻干菌种， 划线接种于试管营养肉汤琼 脂斜面， 37培养 1824 小时， 然后划线转接于营养肉汤琼脂茄子瓶斜面， 37培养 2024 小时， 镜检当 90% 以上菌体形成芽孢时， 即可准备移种 ； (b) 一级种子培养 用无菌水将茄子瓶斜面上的菌泥刮洗下来， 装入内有玻璃珠的无菌三角瓶中， 振荡分 散， 获得均匀的菌悬液。将菌悬液在 85水浴中加热 5 分钟， 以体积比 5% 的接种量接入 5L 三角瓶中， 三角瓶装量系数为 40%(v/v)。种子培养基组成为 ： 葡糖糖 10 g/L， 蛋白胨 5 g/ L， 酵母膏3 g/L。
21、， NaCl 5 g/L， 自来水定容， 调pH7.0-7.5， 37培养18-24h， 搅拌转速150r/ min， 通气量为 0.5m3/h。当种子液 600nm 吸光值为 2-5 时， 即可移种 ； (c) 二级种子培养 说 明 书 CN 102860408 A 5 3/6 页 6 无菌条件下， 将一级种子液按体积 10% 的接种量接入 50 L 发酵罐， 装量系数为 60%(v/ v)， 二级种子培养基为 ： 葡糖糖30 g/L， 蛋白胨10 g/L， 酵母膏5 g/L， NaCl 5 g/L， 自来水定 容， 调pH7.0-7.5， 37培养18-24h， 搅拌转速150r/min，。
22、 通气量为0.5m3/h。 当种子液600nm 吸光值为 5-10 时， 即可移种 ； (3) 干酪乳酸菌的纯种培养 (a) 菌种活化 无菌条件下取干酪乳酸菌的冻干菌种， 接入装有活化培养基的试管中， 进行静置厌氧 培养。活化培养基组成为 ： 葡萄糖 20 g/L， 蛋白胨 10 g/L, 牛肉浸膏 10 g/L， 酵母浸膏 5 g/L， K2HPO42 g/L， 柠檬酸二胺 2 g/L， NaAc 5 g/L， 吐温 -80 1 g/L， MgSO47H2O 0.2 g/L， MnSO4H2O 0.05 g/L， CaCO3 20 g/L， pH6.5， 37培养 30-36h， 然后以体积。
23、比 10% 的接种量 转接于新鲜活化培养基中， 37静置厌氧培养 24-36h ； (b) 一级种子培养 活化菌液以体积比 10% 接种量接入 5L 三角瓶中， 三角瓶的装量系数为 60%(v/v)， 种子 培养基组成为 ： 葡萄糖 30 g/L， 蛋白胨 10 g/L, 牛肉浸膏 10 g/L， 酵母浸膏 5 g/L， K2HPO42 g/L， 柠檬酸二胺 2 g/L， NaAc 5 g/L， 吐温 -801 g/L， MgSO4 7H2O 0.2 g/L， MnSO4 H2O 0.05 g/L， CaCO310 g/L， pH6.5， 37静置厌氧培养 30-36 h ； (c) 二级种子。
24、培养 无菌条件下， 一级种子液以体积比 10% 接种量接入 30 L 发酵罐中， 发酵罐的装量系数 为 80%(v/v)， 种子培养基组成为 ： 葡萄糖 30g/L， 蛋白胨 10g/L, 牛肉浸膏 10g/L， 酵母浸膏 5g/L， K2HPO4 2g/L， 柠檬酸二胺 2g/L， NaAc 5g/L， 吐温 -801 g/L， MgSO47H2O 0.2 g/L， MnSO4H2O 0.05g/L， CaCO3 10g/L， pH6.5， 37静置厌氧培养 30-36h ； 2、 酵母菌、 芽孢菌和乳酸菌的混合培养 (1) 混合发酵培养基的制备 按质量将红糖 60-100g、 玉米浆 10。
25、-40g、 硫酸铵 5-20g、 硫酸镁 2-10g、 磷酸二氢钾 5-20g、 磷酸氢二钾 5-20g、 柠檬酸二胺 0.5-2g、 氯化锌 0.05-0.1g、 氯化钙 0.1-0.2g 混合均 匀， 加入蒸馏水定容1升， 充分搅拌溶解完全后密封加热至80-90灭菌0.5-2小时， 冷却至 室温备用。另配制浓度为 1-5g/L 的亚硒酸钠溶液 100ml， 经 0.22m 无菌过滤器除菌， 4 下保存备用 ； (2) 混合发酵工艺 将按步骤 1 制备的酵母混合种子液、 芽孢混合种子液、 干酪乳酸菌种子液等二级种子 液按体积比 12: 12: 12 混合， 以 V/W5%20% 的接种量将混。
26、合菌加入到灭菌的发酵液体 培养基中， 同时再加入一定量亚硒酸钠溶液使得发酵培养基中的亚硒酸钠终浓度为 1050 mg/L， 在30-37， 转速50-200r/min， 通气量0.5-2m3/h下， 培养24-36h， 然后厌氧静置培养 24-48h， 直接制得液态饲用多功能微生物活菌制剂。 0011 本发明的优势在于 ： (1) 本制剂为多菌混合发酵直接制成的饲用多功能微生物活菌制剂， 除具有常规微生 物活菌制剂的特性外， 还富含多种功能性营养物质， 大大提升畜牧养殖效益。 0012 (2) 本制剂富含有机硒， 其相对于无机亚硒酸盐来说， 具有低毒， 快速吸收， 环境污 染小等优点， 能有效。
27、补充动物日粮中的硒元素。 说 明 书 CN 102860408 A 6 4/6 页 7 0013 (3) 本制剂富含谷胱甘肽， 能够直接或间接提高动物的免疫力和抗应激。 0014 (4) 本制剂富含 L- 乳酸菌， 可促调节动物肠胃 pH， 抑制有害菌的生长， 降低腹泻 率， 提高消化酶的活性， 促进畜禽的生长。 0015 (5) 本发明的饲用多功能微生物活菌制剂的制备工艺简单， 采用混合发酵过程中 添加无机硒， 发酵时无机硒转化为有机硒， 各益生菌群生长态势均衡， 同时产生大量谷胱甘 肽、 L- 乳酸等功能性营养物质。发酵结束后产物可直接作为微生态活菌产品， 简单高效， 易 于大规模生产和使。
28、用。 具体实施方式 0016 实施例 1: 种子纯培养 (1) 酿酒酵母、 产朊假丝酵母的纯种培养 菌种活化 无菌条件下取酿酒酵母或产朊假丝酵母的冻干菌种， 划线接种于试管麦芽汁琼脂斜 面， 30培养 1836 小时， 至斜面上肉眼可见菌落时， 即可准备移种。 0017 一级种子培养 无菌条件下用接种环挑取单菌落， 接入装有种子培养液的三角瓶中， 30培养 1848 小时， 至菌体 600nm 吸光值为 1-5 左右时， 可移种至二级种子。种子培养基组成为 12Brix. 麦芽汁。 0018 二级种子培养 无菌条件下， 二级种子液以体积比 10% 的接种量接入 50 L 发酵罐， 装量系数为 。
29、60%(v/ v)， 二级种子培养基为 ： 葡萄糖 30 g/L， 酵母浸膏 5 g/L， 蛋白胨 5 g/L， (NH4)2SO4 3g/L， MgSO47H2O 0.2 g/L， NaCl 0.1 g/L， KH2PO4 2 g/L， 自来水定容， 调 pH6.0， 30培养 24 小 时， 搅拌 150r/min， 通气量 0.5 m3/h。当种子液 600nm 吸光值为 5-10 左右时， 可作为二级 种子液接入发酵培养基中。 0019 (2) 枯草芽孢杆菌、 地衣芽孢杆菌的纯种培养 无菌条件下取枯草芽孢杆菌、 地衣芽孢杆菌的冻干菌种， 划线接种于试管营养肉汤琼 脂斜面， 37培养 1。
30、824 小时， 然后划线转接于营养肉汤琼脂茄子瓶斜面， 37培养 2024 小时， 镜检当 90% 以上菌体形成芽孢时， 即可准备移种。 0020 一级种子培养 用无菌水将茄子瓶斜面上的菌泥刮洗下来， 装入内有玻璃珠的无菌三角瓶中， 振荡分 散， 获得均匀的菌悬液。将菌悬液在 85水浴中加热 5 分钟， 以体积比 5% 的接种量接入 5L 三角瓶中， 三角瓶装量系数为 40%(v/v)。种子培养基组成为 ： 葡糖糖 10 g/L， 蛋白胨 5 g/ L， 酵母膏3 g/L， NaCl 5 g/L， 自来水定容， 调pH7.0-7.5， 37培养18-24h， 搅拌转速150r/ min， 通气。
31、量为 0.5m3/h。当种子液 600nm 吸光值为 2-5 时， 即可移种。 0021 二级种子培养 无菌条件下， 将一级种子液按体积 10% 的接种量接入 50 L 发酵罐， 装量系数为 60%(v/ v)， 二级种子培养基为 ： 葡糖糖30 g/L， 蛋白胨10 g/L， 酵母膏5 g/L， NaCl 5 g/L， 自来水定 容， 调pH7.0-7.5， 37培养18-24h， 搅拌转速150r/min， 通气量为0.5m3/h。 当种子液600nm 吸光值为 5-10 时， 即可移种。 说 明 书 CN 102860408 A 7 5/6 页 8 0022 (3) 干酪乳酸菌的纯种培养。
32、 无菌条件下取干酪乳酸菌的冻干菌种， 接入装有活化培养基的试管中， 进行静置厌氧 培养。活化培养基组成为 ： 葡萄糖 20 g/L， 蛋白胨 10 g/L, 牛肉浸膏 10 g/L， 酵母浸膏 5 g/L， K2HPO42 g/L， 柠檬酸二胺 2 g/L， NaAc 5 g/L， 吐温 -80 1 g/L， MgSO47H2O 0.2 g/L， MnSO4H2O 0.05 g/L， CaCO3 20 g/L， pH6.5， 37培养 30-36h， 然后以体积比 10% 的接种量 转接于新鲜活化培养基中， 37静置厌氧培养 24-36h。 0023 一级种子培养 无菌条件下， 活化菌液以体积。
33、比 10% 接种量接入 5L 三角瓶中， 三角瓶的装量系数为 60%(v/v)， 种子培养基组成为 ： 葡萄糖 30 g/L， 蛋白胨 10 g/L, 牛肉浸膏 10 g/L， 酵母浸膏 5 g/L， K2HPO42 g/L， 柠檬酸二胺 2 g/L， NaAc 5 g/L， 吐温 -801 g/L， MgSO47H2O 0.2 g/L， MnSO4H2O 0.05 g/L， CaCO310 g/L， pH6.5， 37静置厌氧培养 30-36 h。 0024 二级种子培养 无菌条件下， 一级种子液以体积比 10% 接种量接入 30 L 发酵罐中， 发酵罐的装量系数 为 80%(v/v)， 种。
34、子培养基组成为 ： 葡萄糖 30g/L， 蛋白胨 10g/L, 牛肉浸膏 10g/L， 酵母浸膏 5g/L， K2HPO4 2g/L， 柠檬酸二胺 2g/L， NaAc 5g/L， 吐温 -80 1 g/L， MgSO47H2O 0.2 g/L， MnSO4H2O 0.05g/L， CaCO3 10g/L， pH6.5， 37静置厌氧培养 30-36h。 0025 实施例 2 ： 酵母菌、 芽孢菌和乳酸菌的混合培养 菌种活化与种子培养 酿酒酵母、 产朊假丝酵母、 枯草芽孢杆菌、 地衣芽胞杆菌和干酪乳酸菌的活化及种子培 养与实施例 1 中所述相同。 0026 发酵培养 将酿酒酵母、 产朊假丝酵母。
35、、 枯草芽孢杆菌、 地衣芽胞杆菌和干酪乳酸菌的二级种子液 按酿酒酵母 : 产朊假丝酵母 : 枯草芽孢杆菌 : 地衣芽胞杆菌 : 干酪乳酸菌 =2:2:1:1:1 比 例进行接种， 以体积比 20% 的接种总量接入 0.5 m3的发酵罐中， 发酵罐的装液量为 70%(v/ v)。 0027 发酵培养基组成为 ： 红糖 80g/L、 玉米浆 20g/L、 硫酸铵 5g/L、 硫酸镁 2g/L、 磷酸二 氢钾5g/L、 磷酸氢二钾5g/L、 柠檬酸二胺0.5g/L、 氯化锌0.05g/L、 氯化钙0.1g/L， 亚硒酸钠 30 mg/L， pH7.0。在 33， 转速 100r/min， 通气量 1。
36、m3/h 下， 培养 24-36h， 然后厌氧静置培养 24-48h。 0028 实施例 3 ： 发酵过程中菌数与功能性营养成分的分析 1. 菌落计数 ： 在完全固体培养基中添加 500 ppm 的硫酸铜来抑制酵母的生长， 采用稀释平板计数 法， 以芽孢菌与乳酸菌菌落形态加以区分， 测定乳酸菌的总数和芽孢菌总数。 0029 在改良的酵母菌固体培养基 ( YPD) 中添加 500 ppm 的氨苄青霉素， 排除乳酸菌 和芽孢菌生长对酵母菌总菌数检测的干扰， 采用稀释平板计数法， 测定发酵产品中的酵母 菌总活菌数。 0030 2. 无机硒和有机硒的测定方法 ： 无机硒和有机硒的定性分析 ： 取样品液。
37、 ( 含硒超过 50 nmol/L)510mL 于试管中， 加 说 明 书 CN 102860408 A 8 6/6 页 9 150g/L 的半胱氨酸溶液 1mL， 摇匀后静置， 加 0.050.1mL 2% 亚甲蓝溶液， 摇匀， 并计时。对 有机硒亚甲蓝的褪色时间 510min， 对无机硒则为 3060s。根据亚甲蓝的褪色时间可定性 鉴别无机硒和有机硒。 0031 无机硒和有机硒含量的测定 ： 将酵母放于 TrisHCl- 甘油缓冲液中， 加入 SiO2进 行研磨， 在电子显微镜下观察， 待酵母细胞完全破碎后， 装入事先处理好的透析袋内， 扎紧 上端， 于蒸馏水中透析， 期间不断换水， 用无。
38、机硒和有机硒的定性鉴别方法， 分别检测透析 外液和透析内液， 直到透析外液中检测不出无机硒时， 停止透析。 对上述透析内液进行消化 和测定， 可得到硒酵母中有机硒含量的测定结果 ； 对上述透析外液进行浓缩和测定， 可得到 硒酵母中无机硒含量的测定结果。 0032 3. 谷胱甘肽含量测定 ： 胞内谷胱甘肽提取 ： 新鲜酵母经蒸馏水洗涤3次后， 30下于40%的稀乙醇中振荡处理 3h， 4800r/min 离心得到的上清液富含 GSH， 经稀释后用作 GSH 的分析检测。 0033 谷胱甘肽测定 ： DTNB5,5 - 二硫双 -(2- 硝基苯甲酸 )-GSH 还原酶循环法。 0034 4.L- 乳酸菌含量测定 ： 乳酸脱氢酶测定试剂盒 表 1 混合菌发酵参数 说 明 书 CN 102860408 A 9 。