检测PJVK基因C886CT突变的试剂盒.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102864216 A (43)申请公布日 2013.01.09 CN 102864216 A *CN102864216A* (21)申请号 201210172361.5 (22)申请日 2012.05.29 C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 王秋菊 地址 100853 北京市海淀区复兴路 28 号 申请人 中国人民解放军总医院 (72)发明人 王秋菊 (74)专利代理机构 北京律诚同业知识产权代理 有限公司 11006 代理人 黄韧敏 (54) 发明名称 检测 PJVK 基因 c.886CT 突变的试剂盒 (57) 摘要 本发明提供了检测 PJV。

2、K 基因 c.886CT 突变 的试剂盒， 通过检测患者中是否存在该突变基因 而诊断感音神经性聋及听神经病 / 听神经病谱系 障碍发生的原因和类型。该突变基因和检测方法 将有利于临床上开展感音神经性聋及听神经病 / 听神经病谱系障碍患者的 PJVK 突变筛查工作， 为 感音神经性聋及听神经病 / 听神经病谱系障碍患 者的诊断和治疗提供依据。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 10 页 序列表 4 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 10 页 序列表 4 页 附图 3 页 1/1 页 2 1. 一种用于检测与。

3、感音神经性聋及听神经病 / 听神经病谱系障碍相关的位于 PJVK 基 因的 c.886CT 突变的试剂盒， 所述试剂盒包括 ： 从待测样品中提取 DNA 的试剂 ； 用于扩增样本 DNA 的 PCR 反应试剂 ； 对 PCR 扩增产物进行测序的试剂 ； 其中， 所述扩增样本 DNA 的 PCR 反应试剂包括 PCR 引物， 所述 PCR 引物扩增的目标片段 包含 PJVK 基因第 886 位碱基。 2. 如权利要求 1 所述试剂盒， 其中所述 PCR 引物为选自下述引物中的一对 ： PJVK-7F-1:5 -GCCAGACCCTGTCTCAAAAA-3 ， PJVK-7R-1:5 -GGGAA。

4、TATGATACCCAGACAGG-3 ； PJVK-7F-2:5 -GTGCACCTGTAGTCCCAGC-3 ， PJVK-7R-2:5 -GGCATGATTCATAATCTCTG-3 ； PJVK-7F-3:5 -CAAATTATTTCATGACTAGTGG-3 ， PJVK-7R-3:5 -CAAAAATGATTCTAAAGTGACT-3 ； PJVK-7F-4:5 -CCAGCTTGGGTGACAGAG-3 ， PJVK-7R-4:5 -GATTCTAAAGTGACTGGCATGA-3 。 3. 如权利要求 1 或 2 所述试剂盒， 所述试剂盒用于检测位于 PJVK 基因的 c.88。

5、6CT 突 变的方法， 包括以下步骤 ： 1） 采集待测个体的血液、 体液或组织样本， 提取 DNA ； 2） 以该 DNA 为模板， 以 PCR 引物进行 PCR 反应， 得到 PCR 反应产物 ； 其中， 所述 PCR 引物扩增的目标片段包含 PJVK 基因 886 位碱基 ； 3） 将得到的PCR反应产物进行直接测序， 并将测序结果与PJVK正常基因的序列进行比 较， 确定是否存在 PJVK 基因的 c.886CT 突变位点。 4. 如权利要求 3 所述试剂盒， 其中所述方法还进一步包括下述步骤 ： 4） 按照正常阅读框架进行翻译以确定 c.886CT 突变使氨基酸序列自 296 位发生。

6、无义 突变， 使氨基酸编码在 296 位终止 （p.R296X） 。 5.如权利要求1所述的试剂盒在用于检测感音神经性聋及听神经病/听神经病谱系障 碍中的用途。 权 利 要 求 书 CN 102864216 A 2 1/10 页 3 检测 PJVK 基因 c.886CT 突变的试剂盒 技术领域 0001 本发明涉及基因检测领域， 具体涉及用于检测 PJVK 基因突变基因的试剂盒 ； 本发 明还涉及 PJVK 突变基因及其在诊断和 / 或治疗感音神经性聋及听神经病 / 听神经病谱系 障碍中的应用。 背景技术 0002 听 神 经 病 / 听 神 经 病 谱 系 障 碍 (Auditory Neu。

7、ropathy Spectrum Disorders,ANSD) 是一种耳蜗外毛细胞功能正常， 但声音信号不能同步地从内耳传输到大 脑的听觉障碍性疾病， 系听觉信息传输处理过程的异常。听力学检查表现为以低频听力减 退为主的听力损失， 听性脑干反应不能引出， 耳蜗微音电位和耳声发射多正常。 该类疾病于 上个世纪 90 年代被定义和命名， 是一种新认识的听力障碍性疾病， 在高危婴幼儿中的发病 率约为 0.23%， 在各种原因所致的 ABR 异常的聋病患儿中发病率则高达 11%， 是导致婴幼儿 和青少年言语交流障碍的重要听力障碍性疾病之一。 然而， 其病因、 病变部位和发病机制尚 不十分明确， 导致。

8、药物治疗、 佩戴助听器及人工耳蜗植入术效果的预测和评估上存在难度。 近几年来， 一系列感音神经性聋及听神经病 / 听神经病谱系障碍相关基因的发现， 从分子 水平揭示了感音神经性聋及听神经病 / 听神经病谱系障碍的病理机制。根据不同基因导致 的不同病变部位对感音神经性聋及听神经病 / 听神经病谱系障碍进行分型， 可为感音神经 性聋及听神经病 / 听神经病谱系障碍的临床治疗提供理论依据。 0003 Starr 教授等根据听神经病谱系障碍发病部位的不同将其分为 TYPE I 型 （病变部 位在听神经） 和 TYPE II 型 （病变部位在内毛细胞、 末梢树突及突触） 国内外研究显示携带 OTOF 基。

9、因突变的听神经病谱系障碍患者临床多以 TypeII 型表现为主， 适合于人工耳蜗植 入并可取得较好效果。而携带 PJVK 基因突变的听神经病谱系障碍患者临床多以 TYPE I 型 为主， 其病变部位在听神经， 位置深在， 人工耳蜗植入术效果欠佳。 0004 PJVK 基因是与非综合征型隐性遗传性感音神经性聋及听神经病 / 听神经病谱系 障碍相关的基因。由 Delmaghani 等于 2006 年首次发现并命名， 也称为 DFNB59 基因 , 位于 染色体 2q31.1 2q31.3 区域， DNA 序列全长 9800bp, 含有 7 个外显子 , 其中第一个外显 子为非编码外显子。该基因的编。

10、码区序列， 含终止密码子如 SEQ ID NO.1 所示， 编码由 352 个氨基酸组成的蛋白 pejvakin （如 SEQ ID NO.2 所示） ， 其中第 249 258 位氨基酸形成核 定位信号基序 (nuclear localization signal,NLS)， 第 305 331 位氨基酸形成一种可 以与 DNA 相互作用的锌指结构 (zinc-binding domains)。Pejvakin 蛋白主要表达于耳蜗 Corti器、 螺旋神经节细胞以及前三级听觉传入通路(耳蜗核、 上橄榄复合体、 下丘)的神经 元细胞中， 所致感音神经性聋及听神经病 / 听神经病谱系障碍的病变部。

11、位主要位于听觉传 导通路， 影响动作电位的传导及细胞内物质交换。自 2006 年首次发现并报道 PJVK 基因至 今,学者们分别在伊朗、 摩洛哥、 土耳其及荷兰等患者中发现了该基因的10余种突变， 但少 见我国感音神经性聋及听神经病 / 听神经病谱系障碍患者该基因的突变报道。申请人所在 课题组针对150名感音神经性聋及听神经病/听神经病谱系障碍患者率先开展了该基因的 说 明 书 CN 102864216 A 3 2/10 页 4 筛查， 并发现我国人群特有的c.886CT突变， 进而研发了检测该基因c.886CT突变的试剂 盒。该成果有助于快速、 高效地在更大范围的感音神经性聋及听神经病 / 。

12、听神经病谱系障 碍人群中进行突变位点的检测， 进而对其定位分型， 为感音神经性聋及听神经病 / 听神经 病谱系障碍患者开展临床干预提供重要的指导意义。 发明内容 0005 本发明的一个目的在于提供用于检测 PJVK 突变 c.886CT 基因的试剂盒， 其技术 方案为 ： 0006 一种用于检测与感音神经性聋及听神经病 / 听神经病谱系障碍相关的位于 PJVK 基因的 c.886CT 突变的试剂盒， 所述试剂盒包括 ： 0007 从待测样品中提取 DNA 的试剂 ； 0008 用于扩增样本 DNA 的 PCR 反应试剂 ； 0009 对 PCR 扩增产物进行测序的试剂 ； 0010 其中， 所。

13、述扩增样本 DNA 的 PCR 反应试剂包括 PCR 引物， 所述 PCR 引物扩增的目标 片段包含 PJVK 基因 886 位碱基。 0011 具体地， 上述 PCR 引物为选自下述引物中的一对 ： 0012 PJVK-7F-1（SEQ ID NO.3） :5 -GCCAGACCCTGTCTCAAAAA-3 ， 0013 PJVK-7R-1（SEQ ID NO.4） :5 -GGGAATATGATACCCAGACAGG-3 ； 0014 PJVK-7F-2（SEQ ID NO.5） :5 -GTGCACCTGTAGTCCCAGC-3 ， 0015 PJVK-7R-2（SEQ ID NO.6）。

14、 :5 -GGCATGATTCATAATCTCTG-3 ； 0016 PJVK-7F-3（SEQ ID NO.7） :5 -CAAATTATTTCATGACTAGTGG-3 ， 0017 PJVK-7R-3（SEQ ID NO.8） :5 -CAAAAATGATTCTAAAGTGACT-3 ； 0018 PJVK-7F-4（SEQ ID NO.9） :5 -CCAGCTTGGGTGACAGAG-3 ， 0019 PJVK-7R-4（SEQ ID NO.10） :5 -GATTCTAAAGTGACTGGCATGA-3 。 0020 本发明的另一个目的在于提供上述试剂盒用于检测位于PJVK基因的c。

15、.886CT突 变的方法， 包括以下步骤 ： 0021 1） 采集待测个体的血液、 体液或组织样本， 提取 DNA ； 0022 2） 以该 DNA 为模板， 以 PCR 引物进行 PCR 反应， 得到 PCR 反应产物 ； 0023 其中， 所述 PCR 引物扩增的目标片段包含 PJVK 基因 886 位碱基 ； 0024 3） 将得到的PCR反应产物进行直接测序， 并将测序结果与PJVK正常基因的序列进 行比较， 确定是否存在 PJVK 基因的 c.886CT 突变位点。 0025 进一步地， 上述方法还包括下述步骤 ： 0026 4） 按照正常阅读框架进行翻译以确定 c.886CT 突变。

16、使氨基酸序列自 296 位发生 无义突变， 使氨基酸编码在 296 位终止 （p.R296X） 。 0027 本发明的又一个目的在于提供上述试剂盒在用于检测感音神经性聋及听神经病 / 听神经病谱系障碍中的用途， 本发明将为在感音神经性聋及听神经病 / 听神经病谱系障碍 患者中开展易感基因筛查提供方便确实的方法 ； 同时可以指导临床治疗， 并为将来利用这 一突变作为靶点开展耳聋的基因治疗提供坚实的基础。 使用本发明的试剂盒的检测方法为 通过检测来自于患者的待测样本中是否存在 PJVK 基因 c.886CT 突变， 而判断该患者感音 说 明 书 CN 102864216 A 4 3/10 页 5 。

17、神经性聋及听神经病 / 听神经病谱系障碍发生原因及类型。其中， PJVK 基因的 c.886CT 碱基改变引起氨基酸编码过程中在 296 位发生无义改变 , 使氨基酸编码在 296 位终止 （p.R296X） , 进而影响 pejvakin 蛋白的正常功能。 0028 PJVK 基因突变相关的感音神经性聋及听神经病 / 听神经病谱系障碍以常染色体 隐性遗传的方式传递。发明人应用候选基因筛查的方法对 150 例非综合征型感音神经性聋 及听神经病/听神经病谱系障碍患者和99例听力正常且无家族史的对照进行筛查， 在一例 听神经病谱系障碍患者发现 PJVK 基因的 c.886CT 突变， 而这一突变位。

18、点高度保守且在 99 例正常人对照组中未发现该突变， 目前国际上报道与感音神经性聋及听神经病 / 听神经病 谱系障碍相关的 PJVK 突变有 10 余种， 尚无 c.886CT 突变的报道， 该突变为中国人群新发 现的听神经病谱系障碍致病突变。 0029 图 1 给出 PJVK 编码区氨基酸与核酸碱基的对照图， 并示出突变位点 （方框标记 处） ， 该突变使位于PJVK基因编码区的第886位的C碱基变为T碱基， 使得氨基酸编码在296 位终止 （p.R296X） ， 突变发生后影响基因表达蛋白的正常功能。 0030 检测该突变可用本领域的任何检测点突变的方法来进行， 例如 PCR（聚合酶链反 。

19、应） 测序法、 采用标记的 PJVK 基因 DNA 探针杂交法或用限制性片段长度多态性方法或序 列特异性引物的方法等等。 0031 在本发明的一个实施方案中， 采用PCR扩增-直接测序法来检测样本， 具体包括下 述步骤 ： 0032 1） 采集待测个体的样本， 例如血液、 体液或组织， 提取基因组 DNA ； 0033 2） 以该DNA为模板， 以针对PJVK基因或PJVK编码区第886位碱基附近设计的PCR 引物进行 PCR 反应， 得到 PCR 扩增产物 ； 0034 3） 将得到的PCR产物进行直接测序分析， 将所得到的序列与PJVK正常基因的序列 进行比较， 确定是否存在 PJVK 突。

20、变位点。 0035 4） 根据以上结果判断待测个体是否为PJVK基因突变c.886CT导致的听神经病谱 系障碍。 0036 进一步的， 该方法可以选择性的包括如下步骤 ： 0037 5） 按正常阅读框进行翻译以确定第 296 位发生无义突变， 使氨基酸编码在 296 位 终止 （p.R296X） 。 0038 在发明人进行的实验中， 通过聋病门诊及资源收集网络收集各种感音神经性耳聋 患者， 包括听神经病谱系障碍患者， 建立资源库。在患者自愿的前提下， 签署知情同意书 后， 留取 5-10ml 血样， 并建立门诊病历资料库， 详细记录患者病情、 家系中的发病情况以及 联系方式。然后， 应用酚氯仿。

21、抽提的方法提取基因组 DNA， 定量后入库， -20 C 保存， 每份 DNA样品均详细对应于登记的患者临床资料。 然后， 应用在线引物设计软件Primer3设计引 物， 包含 PJVK 整个编码区， 应用 PCR 扩增。PCR 产物直接测序 ： 测序引物与 PCR 扩增引物相 同， 正反向测序， 应用 ABI 公司 3700DNA 测序仪。得到的序列与 Genbank 中的序列 （登录号 ： NC_000002.11） 比较确定 PJVK 突变位点。按正常阅读框进行翻译以确定 PJVK 的突变位点。 0039 上述步骤 2 所得到的 PCR 反应产物还可以用杂交探针来检测， 所用的杂交探针可。

22、 以是与正常的 PJVK 核苷酸序列杂交， 或与突变的核苷酸序列杂交， 或与它们的互补序列杂 交的探针。 这些探针可以用放射性同位素、 发色物质或荧光物质标记， 尤其是可利用等位基 说 明 书 CN 102864216 A 5 4/10 页 6 因特异探针， 也可用限制性酶切的方法筛查是否存在已被确定的突变。 0040 因此， 检测 PCR 扩增产物的试剂选自测序检测试剂、 限制性内切酶酶切检测试剂、 限制性长度多态性检测试剂、 序列特异性引物检测试剂和探针杂交检测试剂。在上述方法 中使用的PCR引物可以依据已知的核苷酸序列设计， 通常为1530个碱基， GC含量为45 50% 左右， 在适当。

23、的温度下与末端特异性结合， 其可以利用专门的计算机程序设计。在本发 明的一个具体实施例中， 应用在线引物设计软件 primer 3.0 设计了一对 PCR 引物， 其序列 为 ： 0041 上游引物 :PJVK-7F-1:5 -GCCAGACCCTGTCTCAAAAA-3 （nt9399-nt9418） 0042 下游引物 :PJVK-7R-1:5 -GGGAATATGATACCCAGACAGG-3 （nt9960-nt9981） 0043 PJVK 正常基因的标准序列可以参考例如 Genbank ： NC_000002.11。 0044 用于检测 PJVK 基因 c.886CT 突变的试剂盒。

24、中可以包含以下试剂 ： 0045 用于扩增样本DNA中PJVK基因或PJVK基因编码区第886位碱基附近的PCR引物 ； 以及以下一种或几种试剂的组合 ： 0046 从待测样品中提取 DNA 的试剂 ； 0047 PCR 反应试剂 ； 0048 对 PCR 扩增产物进行直接测序的试剂。 0049 例如， 本发明的一个实施方案中提供一个检测PJVK基因c.886CT突变的试剂盒， 容器内装有用以检测 PJVK 基因 c.886CT 突变的成分， 与之同时提供的可以是经政府药物 管理机构审核的、 有关药品或生物制品的制造、 使用及销售信息。例如， 采用 PCR 扩增后， 直 接检测样品中 PJVK。

25、 基因 c.886CT 突变位点的试剂盒， 可含有扩增引物、 dNTPs、 用于 PCR 反 应的 DNA 聚合酶及其缓冲液、 或测序反应所需试剂等的一种或多种。本领域技术人员已知， 以上组分仅是示意性的， 例如， 所述的引物可以采用上述的一对PJVK-7F-1和PJVK-7R-1引 物， 所述用于 PCR 反应的 DNA 聚合酶是能够用于 PCR 扩增的酶。 0050 所述试剂盒的使用方法主要包括如下步骤 ： 0051 （1） 提取待测血样的 DNA， 利用上述的一对 PJVK-7F-1 和 PJVK-7R-1 引物， 进行 PCR 反应， 得到 PCR 反应产物 ； 0052 （2） PC。

26、R 反应产物纯化后直接测序， 将所得的序列与 Genbank 中的标准序列比较确 定突变位点的存在 ； 0053 所述步骤还可进一步包括 ： 0054 （3） 按正常阅读框进行翻译以确定第 296 位氨基酸是否存在无义突变 （p.R296X） 。 该试剂盒可简便快捷地检测PJVK突变位点， 从而应用于感音神经性聋及听神经病/听神经 病谱系障碍相关基因的检测及其诊断或治疗方法中。 0055 本发明也提供了 PJVK 突变基因在诊断或治疗人类感音神经性聋及听神经病 / 听 神经病谱系障碍中的应用。通过检测来自患者的待测样本中是否存在 PJVK 基因 c.886CT 突变而判断该患者的感音神经性聋及。

27、听神经病 / 听神经病谱系障碍发生原因及类型， 进而 为临床诊断和治疗提供依据 ； 此外， 在进一步的临床治疗方面， 在检测为发生了 PJVK 基因 c.886CT 突变之后， 可以将正常基因导入携带突变基因的细胞并在其中表达， 它可与内源 性突变基因发生重组， 从而可以进行基因治疗。 0056 本发明提出了通过检测患者中是否存在 PJVK 基因新的突变而诊断感音神经性聋 说 明 书 CN 102864216 A 6 5/10 页 7 及听神经病 / 听神经病谱系障碍发生的原因和类型的检测方法， 这将有利于为不同类型感 音神经性聋及听神经病 / 听神经病谱系障碍患者确定个体化治疗方案。 005。

28、7 下面结合附图， 通过对本发明较佳实施方式的说明， 详细描述但不限制本发明。 附图说明 0058 图 1 为 PJVK 基因编码区核苷酸与氨基酸的对照 ： 突变位于 PJVK 基因第 886 位中 的C碱基， 用方框圈起来的是突变的碱基和对应的氨基酸， 突变后的碱基序列使第296位氨 基酸发生无义突变 （p.R296X） 。 0059 图 2 为本发明方法中 PCR 反应过程示意图， 示出了反应温度和时间， 其中 * 表示每 个循环降低 0.5。 0060 图3为本发明方法中， 对PCR产物进行电泳定量的琼脂糖凝胶电泳图谱， 图中示出 了定量 Marker 的片段位置。 0061 图4为本发。

29、明方法中PJVK基因测序结果的局部图， 方框示感音神经性聋及听神经 病 / 听神经病谱系障碍患者突变位点位置 ； 其中图 4A 是 PJVK 基因杂合突变测序结果 ； 图 4B 是野生型 PJVK 基因测序结果。 具体实施方式 0062 本发明所用试验材料， 如无特别说明， 均为市售购买产品。 0063 【实施例 1】 待测血样提取与 PJVK 基因编码区的 PCR 扩增 0064 一、 待测对象血样 DNA 的制备 0065 1、 研究对象 0066 对150例散发非综合征型感音神经性聋及听神经病/听神经病谱系障碍患者和99 名无家族史的听力正常对照按照下述方法进行 PJVK 基因的筛查。1。

30、50 例患者中， 1 例患者 表现为典型的听神经病谱系障碍异常听功能特征， 经过的临床观察和系统的听功能检查后 确诊为非综合征型听神经病谱系障碍。对这例听神经病谱系障碍患者的 PJVK 基因检测发 现患者为杂合的 c.886CT 突变。对 99 名听力正常者的筛查中未发现 c.886CT 突变者。 0067 对所有参加者详细调查其病史以及家族史， 并对其进行体格检查， 耳科检查包括 耳镜检查、 听力学评估。在签署知情同意书以后每人采集血样 5 10ml。 0068 2、 基因组 DNA 提取 0069 采用酚氯仿抽提法。 0070 第一天 0071 1） 抗凝血用 PBS 作 1 倍稀释。 0。

31、072 2） 在离心管中加入 2 倍体积的淋巴分离液 （18 C 28 C） ， 上面铺一层 1 倍体 积已稀释的血液， 室温， 1000g, 离心 20 分钟。 0073 3） 吸弃上清液， 小心吸出中间有核细胞层， 转入 5ml Ep 管中， 5000g, 离心 10 分 钟， 然后用 PBS 洗一次。5000g, 离心 10 分钟。 0074 4） 将细胞悬于 2ml TE 缓冲液 （10mM Tris.HCl， 1mM EDTA， pH8.0） 中， 加 10% 的 SDS （十二烷基硫酸） 至终浓度 0.5%（100l） ， 蛋白激酶 k 100 200g/ml（10mg/ml） ，。

32、 50 C 水浴 3 5 小时。 说 明 书 CN 102864216 A 7 6/10 页 8 0075 5） 用酚氯仿提取。用等体积的饱和酚， 加入混匀， 5000g, 离心 10 分钟。 0076 6）吸上清液至新离心管中， 弃下层沉淀， 加入等体积酚 ： 氯仿混合物， 混匀， 5000g, 离心 10 分钟。 0077 7） 吸上清液至新离心管中， 弃下层沉淀， 加入等体积氯仿 ： 异戊醇混合物， 混匀， 5000g, 离心 10 分钟。 0078 8） 吸上清液至新离心管中， 弃下层沉淀， 加入 1/10 体积的乙酸钠， 混匀。 0079 9） 加入 2.5 倍体积的无水乙醇。 00。

33、80 10） -20 C 沉淀 DNA 过夜。 0081 第二天 0082 11） 高速离心， 10000g， 10 分钟， 4 C。 0083 12） 弃上清液， 加入 75% 乙醇 2ml， 高速离心 10000g， 5 分钟 0084 13） 弃上清液， 吹干。 0085 14） 用 TE 缓冲液溶解 （200l TE/5ml 全血， 400TE/10ml 全血） 。 0086 15） 分装。1% 琼脂糖电泳和分光光度计定量。 0087 二、 PJVK 基因编码区的 PCR 扩增 0088 1、 引物序列 0089 上游引物 :PJVK-7F-1:5 -GCCAGACCCTGTCTCAA。

34、AAA-3 （nt9399-nt9418） 0090 下游引物 :PJVK-7R-1:5 -GGGAATATGATACCCAGACAGG-3 （nt9960-nt9981） 0091 注 ： PJVK 基因序列检索号 ： NC_000002.11 0092 2、 PCR 反应体系的建立 （表 1） 0093 试剂名称 原液浓度 加样量 Buffer 10 5ul Taq 酶 2U/ul 1ul dNTPs 2.5mmol each 1ul Pr imer-L 20uM 1ul Pr imer-R 20uM 1ul 添加剂 Betaine(5M) 10ul dd H2O 30ul Total V。

35、olume 50ul 0094 0095 试剂和仪器 ： PCR 扩增使用鼎国公司 Buffert、 鼎国公司 Taq 酶、 鼎国公司 dNTP、 Sigma 公司 Betaine、 电泳 TaKaRa MarkerDL2000、 染料百维信 Genefinder。 说 明 书 CN 102864216 A 8 7/10 页 9 0096 反应条件 ： 反应过程 （包括温度和时间） 如图 2 所示。 0097 【实施例 2】 PJVK 基因编码区 PCR 扩增产物的纯化和定量 0098 一、 PCR 产物的纯化96 孔板法 0099 1、 向装有 PCR 产物的 96 孔板中加入 50l 无菌。

36、水， 混匀。 0100 2、 将其转移到Millipore纯化板中， 放到真空泵上抽滤约3分钟， 看到纯化板中没 有水即可。 0101 3、 向纯化板中再次加入 50l 的去离子水， 继续抽滤， 直到纯化板中没有水为止。 0102 4、 将纯化板从真空泵上取下， 向板中加入20l的去离子水， 静止15分钟， 再震荡 15 分钟， 然后吸到一新 96 孔板内。 0103 5、 保存在 -20冰箱中。 0104 二、 电泳定量 0105 1、 样品准备 0106 取一96孔点样板， 每孔先加上样缓冲液6l， 在从装有PCR产物的腔板中， 每孔用 排枪移出 PCR 产物 （2l） ， 转移到点样板上。

37、、 混匀、 离心 （腔板孔号要与 96 孔点样板一一对 应） 。 0107 2、 流程 0108 1） 配胶 （0.8% 琼脂糖） ： 称取 2.4g 琼脂糖， 悬浮于 300ml 0.5TBE 中 （500ml 锥形 瓶） 。 0109 2） 溶胶 ： 微波炉中高火加热至沸， 持续沸腾数分钟， 注意不要沸出， 其间取出混匀。 0110 3） 凉胶 ： 待胶完全溶解， 从微波炉中取出， 凉至 60左右， 加入 1 滴 EB（约 10l， 10mg/ml） , 摇匀。 0111 4） 铺胶 ： 平板两端用胶布封严， 把 250ml 胶液全部倒入平板， 插入梳尺。 0112 5） 上胶 ： 将平板。

38、放入已盛有电泳液 （0.5TBE， 液面距胶面 1 至 2mm） 的电泳槽中， 拔下梳尺。 0113 6） 加样 ： 用排枪按规定格式加样， 最后用单枪加入 DNA 标准品。 0114 7） 走胶 ： 盖上电泳槽盖， 检查正负级， 开启电泳仪， 调节电泳电压。 0115 8） 定量 ： 当溴酚蓝走离加样孔 1.5 至 2cm 处， 关闭电泳仪， 小心取胶， 放入摄相仪 照相， 进行定量。 0116 定量 marker 为 DL 2000， 如图 3 所示， 经过电泳后， 有 6 条带可见， 片段长度分别 是 2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp， DL20。

39、00 的总浓度是 300ng/5l。电泳时取 5l DL2000， 因此每条带的含量为 50ng。PCR 产物电泳时取 3l（PCR 产物） +5l（上样 缓冲液） 进行电泳。根据 PCR 产物电泳后的灰度值与 DL2000 的灰度值的比较判断 PCR 产物 的含量。 0117 【实施例 3】 纯化的 PJVK 基因编码区 PCR 扩增产物的直接测序 0118 一、 PCR 产物 DNA 模板的纯度与用量要求 0119 DNA 纯度 ： OD260/OD280=1.62.0。 0120 DNA 浓度 ： PCR 产物 10ng/l。 0121 DNA 用量 ： 0122 PCR 产物 说 明 。

40、书 CN 102864216 A 9 8/10 页 10 0123 0124 二、 测序反应 0125 1、 测序反应所需试剂应为新鲜配制， 需要经高压灭菌的试剂必须灭菌后方可使 用。测序反应所需的器材 （如 384 孔板、 tip 头等） 同样应为洁净无菌的。 0126 2、 为了保证测序样本及反应试剂的新鲜， 加样时应在冰上操作。 0127 3、 目前的反应体系为 5l， 各种试剂加入量如表 2 所示。 0128 表 2PJVK 基因 PCR 扩增产物的测序反应体系 0129 0130 0131 *BigDye 3.1 为美国应用生物系统公司 （ABI） 生产的一种用于测序反应的荧光染 料。

41、。 0132 4、 样品放于 PCR 仪上， 所作反应的过程见表 3。 0133 表 3PJVK 基因 PCR 扩增产物的测序反应过程 0134 0135 5、 反应完的样品要及时从 PCR 仪上取下， 短时间内要进行纯化的样品放置于 4 冰箱中， 超过一天以上才能纯化的样品放置于 -20冰箱冷冻。 说 明 书 CN 102864216 A 10 9/10 页 11 0136 三、 测序反应物的纯化和测序 0137 1、 向每孔中加入20l 80%乙醇， 4,000rpm离心30min ； 将样品板放在折好的纸巾 上， 在离心机中倒甩， 倒甩时速率不能超过 1,000rpm ； 0138 2、。

42、 在每孔中加入 30l 70乙醇， 4,000rpm 离心 10min， 倒甩 ； 0139 3、 重复第 2 步的操作 ； 0140 4、 重复第 2 步的操作 ； 0141 5、 将样品板放于干净的抽屉中， 避光干燥 30min ； 0142 6、 加入 5l 甲酰胺， 封膜， 离心后置于 -20冰箱中 ； 0143 7、 上机器前 95变性 5 分钟， 放置冰上 2 分钟， 离心后上样。 0144 测序图如图 4 所示。 0145 【实施例 4】 检测耳聋相关基因 PJVKc.886CT 突变位点试剂盒及其应用 0146 1、 试剂盒的组成 0147 （1） 扩增用引物 ： 0148 上。

43、游引物 :PJVK-7F-1:5 -GCCAGACCCTGTCTCAAAAA-3 （nt9399-nt9418） 0149 下游引物 :PJVK-7R-1:5 -GGGAATATGATACCCAGACAGG-3 （nt9960-nt9981） 0150 注 ： PJVK 基因序列检索号 ： NC_000002.11 0151 （2） PCR 扩增用 Taq 酶 2U/l 0152 （3） 10 缓冲液 （含 15ml MgCl2） 0153 （4） dNTP 2.5mM 0154 （5） Big-Dye mix 0155 2、 使用方法 0156 主要包括如下步骤 ： 0157 1） PCR 。

44、扩增 0158 用软件 Primer 3 对 PJVK 基因的编码区设计 PCR 引物， 反应条件为 94 C 预变性 5 分钟， 94 C 变性 30 秒， 65-60 C 退火 40 秒， 72 C 延伸 40 秒， 10 个循环， 94 C 变性 30 秒， 60 C 退火 40 秒， 72 C 延伸 40 秒， 25 个循环， 反应结束后再 72 C 延伸 5 分钟， 4 C 保存 （图 2） 。 0159 2） PCR 产物纯化 0160 将含有 PCR 产物的 MltiScreen-PCR 板抽真空， 加入去离子水， 静置， 随后将 MltiScreen-PCR 板置于混合器上震荡。

45、， 纯化后的 PCR 产物重新溶解后转移至另一洁净的 96 孔板中。 0161 3） 测序反应及验证 0162 以PCR引物作为测序引物进行测序反应， 在ABI9700热循环仪上进行测序反应。 反 应结束后， 延伸产物上样于 ABI PRISM 3700DNA 序列分析仪。将所得到的测序图谱进行分 析， 与 NC_000002.11 的标准序列比较以确定突变位点是否存在。 0163 具体方法参见实施例 1、 2、 3、 4。 0164 【实施例 5】 用选自以下任一对 PCR 扩增引物， 重复上述实施例 1-4 的步骤， 均能达 到相同的检测结果 ： 0165 PJVK-7F-2（SEQ ID。

46、 NO.5） :5 -GTGCACCTGTAGTCCCAGC-3 ， 说 明 书 CN 102864216 A 11 10/10 页 12 0166 PJVK-7R-2（SEQ ID NO.6） :5 -GGCATGATTCATAATCTCTG-3 ； 0167 PJVK-7F-3（SEQ ID NO.7） :5 -CAAATTATTTCATGACTAGTGG-3 ， 0168 PJVK-7R-3（SEQ ID NO.8） :5 -CAAAAATGATTCTAAAGTGACT-3 ； 0169 PJVK-7F-4（SEQ ID NO.9） :5 -CCAGCTTGGGTGACAGAG-3 ， 。

47、0170 PJVK-7R-4（SEQ ID NO.10） :5 -GATTCTAAAGTGACTGGCATGA-3 。 0171 以上对本发明的详细描述并不限制本发明， 本领域技术人员可以根据本发明作出 各种改变和变形， 只要不脱离本发明的精神， 均应属于本发明所附权利要求所定义的范围。 说 明 书 CN 102864216 A 12 1/4 页 13 0001 0002 序 列 表 CN 102864216 A 13 2/4 页 14 0003 序 列 表 CN 102864216 A 14 3/4 页 15 0004 序 列 表 CN 102864216 A 15 4/4 页 16 序 列 表 CN 102864216 A 16 1/3 页 17 说 明 书 附 图 CN 102864216 A 17 2/3 页 18 图 1 说 明 书 附 图 CN 102864216 A 18 3/3 页 19 图 2 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102864216 A 19 。