《一种抗烟草青枯病的烟草内生菌菌株及菌剂.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种抗烟草青枯病的烟草内生菌菌株及菌剂.pdf（5页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 102851245 A (43)申请公布日 2013.01.02 CN 102851245 A *CN102851245A* (21)申请号 201210338294.X (22)申请日 2012.09.14 CGMCC No. 6161 2012.05.29 C12N 1/20(2006.01) A01N 63/02(2006.01) A01P 3/00(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (71)申请人 江西省烟草公司抚州市公司 地址 344000 江西省抚州市大桥南路金家山 1 号 (72)发明人 奚家勤 冯小虎 尹启生 韩延 宋纪真 袁球 。
2、赵涛 王利兵 王信民 高自强 郭建华 周汉平 (74)专利代理机构 江西省专利事务所 36100 代理人 张文 (54) 发明名称 一种抗烟草青枯病的烟草内生菌菌株及菌剂 (57) 摘要 本发明公开了一种抗烟草青枯病的烟草内 生菌菌株及菌剂， 所用的生防微生物为烟草赖氨 酸 芽 孢 杆 菌 LysinibacillustobaccocumKpa 菌 株， 该菌株 2012 年 05 月 29 日保藏于中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏号 ： CGMCCNo.6161。该微生物通过产生活性物质抑制 烟草青枯病菌的生长， 且在烟草根际有很好的定 殖能力， 是一种具有工业化生产前景。
3、的菌株。 菌剂 为 Kpa 菌株可湿性粉剂， 它对烟草青枯病菌有很 好的防治效果， 能用于漂浮育苗基质处理， 移栽期 和成熟期。利用 Kpa 菌株制备的 Kpa 菌株可湿性 粉剂具有成本低、 防效高、 无残留、 对人畜安全的 特点， 是烟草农业种植中防治青枯病菌的高效生 物农药。本发明为烟草农业生产中青枯病的防治 提供了一种具有较好防治效果的生防微生物。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 3 页 1/1 页 2 1. 一种抗烟草青枯病的烟草内生菌菌株， 其特征。
4、在于为烟草赖氨酸芽孢杆菌 Lysinibacillus tobaccocum Kpa 菌株， 从烤烟新鲜叶片中分离、 鉴定获得， 已保藏于中国 微生物菌种保藏委员会普通微生物中心， 保藏日期为 2012 年 05 月 29 日， 保藏号 ： CGMCC No.6161。 2. 根据权利要求 1 所述的烟草内生菌菌株， 其特征在于 ： 烟草赖氨酸芽孢杆菌 Lysinibacillus tobaccocum Kpa 菌株的培养条件为 ： 培养基为金氏培养基， pH 7.0， 接 种量 2.53.5%， 摇瓶培养 3846 h， 培养温度 3437 ； 摇瓶培养时 Kpa 菌株的生物量达 2.001。
5、09 cfu/ml ； 在金氏培养基中 ： 葡萄糖24.026.0 g， 蛋白陈19.021.0 g， MgSO4 7H2O 1.41.6 g， KH2PO4 1.41.6g， 蒸馏水 1000 ml。 3. 一种用于培养抗烟草青枯病的烟草内生菌菌株的菌剂， 其特征在于 ： 菌剂中的活菌 数为 6.06.5109 cfu/g、 含水量为 6.06.5%、 悬浮率为 70.072.0%、 细度为 99.599.7%， 过 400 目筛， 湿润时间为 17.518.5 s， 符合微生物农药国家标准 ： GB 20287-2006。 4. 根据权利要求 4 所述的菌剂， 其特征在于 ： 所述菌剂为 。
6、Kpa 菌株可湿性粉剂， Kpa 菌 株可湿性粉剂由如下以百分比计的原料组成 ： Kpa 菌剂原粉 ： 812%， 木钠 ： 47%， 十二烷基 硫酸钠 ： 0.40.6%， 海藻酸钠 ： 0.81.2%， 蔗糖 ： 0.81.2%， 硅藻土 ： 8183%。 5.根据权利要求4所述的菌剂， 其特征在于 ： Kpa菌剂原粉和Kpa菌株可湿性粉剂的最 佳存储温度为 35。 6. 根据权利要求 4 所述的菌剂， 其特征在于 ： Kpa 菌株可湿性粉剂的制备方法为 ： A、 将 Kpa 菌株先在发酵罐中进行发酵， 发酵结束后用超滤系统将发酵液进行浓缩， 得 到浓缩液， 然后在浓缩液于保鲜薄膜上， 摊。
7、开并在室内凉干， 最后用搅碎机粉碎得到 Kpa 菌 剂原粉 ； B、 将 Kpa 菌剂原粉与木钠、 十二烷基硫酸钠、 海藻酸钠、 蔗糖和硅藻土按照 20 11 1 2 2 164 的比例混合， 搅拌均匀， 最后得到 Kpa 菌株可湿性粉剂。 权 利 要 求 书 CN 102851245 A 2 1/3 页 3 一种抗烟草青枯病的烟草内生菌菌株及菌剂 0001 技术领域 0002 本发明涉及微生物农药技术领域， 特别是涉及一种抗烟草青枯病的烟草内生菌菌 株及菌剂。 背景技术 0003 烟草青枯病是由青枯劳尔氏菌 （Ralstonia solanacearum） 引起的一种在世界范 围内广泛传播的。
8、土传病害 （彭西桥， 刘红艳， 罗宽等 . 烟草内生青枯病拮抗细菌的筛选和初 步鉴定 . 中国烟草科学， 2007 （2） :38-40） ， 该病具有危害大、 分布广等特点。烟草青枯病在 我国长江流域及南方各烟草种植区普遍发生， 尤以广东、 福建、 湖南、 江西等烟区为甚 （陈瑞 泰， 朱贤朝， 王智发等 . 全国主产烟省 （区） 烟草侵染性病害调研报告 . 中国烟草科学， 1997 （4） :3-9） 。 目前， 在烟草青枯病的防治方面主要采用化学药剂， 但防治烟草青枯病药剂的药 效尚不十分理想， 且长期使用化学药剂， 导致病原的抗药性不断增强， 用药量不断增加， 严 重影响生态环境及烟叶。
9、的生产质量。 随着人类环保意识的增强， 以及发展绿色烟叶、 有机烟 叶的需要， 生物防治已经成为防控烟草青枯病的主导措施之一。 0004 采用微生物拮抗的方法， 即利用致病拮抗菌或其提取物来防治病害的发生， 具有 高效、 无污染和长效性等优点， 在植物病害的防治中占据越来越重要的位置 （霍沁建， 张深， 王若焱 . 烟草青枯病研究进展 . 中国农学通报， 2007 （8） :364-368） 。对于烟草青枯病的微 生物防治， 研究者多从烟草种植区无病土壤中筛选生防菌。李清飞等从福建烟田根际土壤 中分离出5株对烟草青枯病有明显抑制作用的细菌 （李清飞， 李红丽， 王岩， 等.烟草青枯病 病原菌的。
10、分离及其拮抗菌的筛选 . 河南农业科学， 2006（1） :51-53） ， Lemessa 等从埃塞俄 比亚烟田根际土壤中筛选出 6 株对烟草青枯病有明显拮抗作用的细菌 （LEMESSA F,ZELLER W.Screening rhizobacteria for biological control of ralstonia solanacearum in Ethiopia .Biological Control ,2007,42(3):336-344） 。 然而， 目前这类从土壤分离的拮 抗菌存在的最大问题是防效不稳定。主要原因是 ： 生防菌在土壤中普遍受到土壤抑菌作用 （Lockwoo。
11、d J L.1977. Fungistasis in soil. Biological Reviews,52(1):1-36.） 的影 响， 生防菌的萌发率很低， 一般在 0-30% 之间， 很少超过 50%， 因此， 很难在土壤中建立达到 控制靶标对象所需的种群密度。 这类生防菌在根际的定殖能力已经成为阻碍其产品大面积 推广应用的瓶颈问题。 0005 植物内生菌 （Plant endophyte） 是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活 于健康植物的各种组织和器官内部的微生物， 包括植物内生真菌、 内生细菌和内生放线菌 (Stone J K, Bacon C W. 2000. An ov。
12、erview of endophytic microbes: endo- phytism defined. Bacon C W, White J F Jr. Microbial Endophytes. New York: Marcel Dekker, P3-9)。 虽然， 植物内生菌的分离纯培养较困难， 但植物内生菌易于定殖在植物体内， 相对于 植物外生生防微生物， 在定殖方面更具优势。 说 明 书 CN 102851245 A 3 2/3 页 4 发明内容 0006 本发明的第一个目的在于提供一种通过产生活性物质抑制烟草青枯病菌的生长、 在烟草根际有很好的定殖能力、 具有工业化生产前景的抗烟。
13、草青枯病的烟草内生菌菌株。 0007 本发明的第二个目的在于提供一种用于培养抗烟草青枯病的烟草内生菌菌株的 菌剂。 0008 本发明的第一个目的是这样实现的 ： 一种抗烟草青枯病的烟草内生菌菌株， 为烟草赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus tobaccocum Kpa 菌株， 从烤烟新鲜叶片中分离、 鉴定获得， 已保藏于中国微生物菌种保藏委 员会普通微生物中心， 保藏日期为 2012 年 05 月 29 日， 保藏号 ： CGMCC No.6161。 0009 烟草赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus tobaccocum Kpa 菌株的培养条件为 ： 培养 基为金氏培养基 (K。
14、ings Medium)（葡萄糖 24.026.0 g， 蛋白陈 19.021.0 g， MgSO4 7H2O 1.41.6 g， KH2PO4 1.41.6g， 蒸馏水 1000 ml） ， pH 7.0， 接种量 2.53.5%， 摇瓶培养 3846 h， 培养温度 3437 ； 摇瓶培养时 Kpa 菌株的生物量达 2.00109 cfu/ml。 0010 本发明的第二个目的是这样实现的 ： 一种用于培养抗烟草青枯病的烟草内生菌菌株的菌剂， 特征是 ： 菌剂中的活菌数为 6.06.5109 cfu/g、 含水量为6.06.5%、 悬浮率为70.072.0%、 细度为99.599.7%， 过。
15、400 目筛， 湿润时间为 17.518.5 s， 符合微生物农药国家标准 （GB 20287-2006） 。 0011 所述菌剂为 Kpa 菌株可湿性粉剂， Kpa 菌株可湿性粉剂由如下以百分比计的原料 组成 ： Kpa 菌剂原粉 ： 812%， 木钠 ： 47%， 十二烷基硫酸钠 ： 0.40.6%， 海藻酸钠 ： 0.81.2%， 蔗糖 ： 0.81.2%， 硅藻土 ： 8183%。 0012 Kpa 菌剂原粉和 Kpa 菌株可湿性粉剂的最佳存储温度为 35。 0013 Kpa 菌株可湿性粉剂的制备方法为 ： A、 将 Kpa 菌株先在发酵罐中进行发酵， 发酵结束后用超滤系统将发酵液进行。
16、浓缩， 得 到浓缩液， 然后在浓缩液于保鲜薄膜上， 摊开并在室内凉干， 最后用搅碎机粉碎得到 Kpa 菌 剂原粉 ； B、 将 Kpa 菌剂原粉与木钠、 十二烷基硫酸钠、 海藻酸钠、 蔗糖和硅藻土按照 20 11 1 2 2 164 的比例混合， 搅拌均匀， 最后得到 Kpa 菌株可湿性粉剂。 0014 烟草赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus tobaccocum Kpa菌株是本申请人从烤烟新 鲜叶片中分离、 鉴定的一种植物内生菌新物种。该微生物通过产生活性物质抑制烟草青枯 病菌的生长， 且在烟草根际有很好的定殖能力， 是一种具有工业化生产前景的菌株。 0015 利用 Kpa 菌株制备。
17、的 Kpa 菌株可湿性粉剂对烟草青枯病菌有很好的防治效果， 能 用于漂浮育苗基质处理， 移栽期和成熟期。利用 Kpa 菌株制备的 Kpa 菌株可湿性粉剂具有 成本低、 防效高、 无残留、 对人畜安全的特点， 是烟草农业种植中防治青枯病菌的高效生物 农药。 0016 施用时可将 Kpa 菌株可湿性粉剂与烟草育苗基质混合使用， 也可在移栽时施入烟 草根际周围， 或在成熟期兑水灌根。 对病害发生严重田块， 移栽期和成熟期分别施用一次效 果最好。 0017 本发明为烟草农业生产中青枯病的防治提供了一种具有较好防治效果的生防微 说 明 书 CN 102851245 A 4 3/3 页 5 生物。 具体实。
18、施方式 0018 下面结合实施例对本发明进行进一步的说明。 0019 1. Kpa 菌株的培养及 Kpa 菌剂的制备 Kpa 菌株试管斜面种子的培养 ： 将 Kpa 菌株接种到牛肉膏蛋白胨固体培养基的斜面上， 在 18-38下培养 2-5 天后获得 Kpa 菌株斜面种子， 适宜的培养条件是 36下培养 2 天。 0020 Kpa 菌株液体种子的培养 ： 从划线培养的平板上取一环 Kpa 菌株接到 YSP （蔗糖琼 脂培养基） 培养液中， 在 36下， 转速 150 rpm， 培养 24 h 后作为种子。 0021 Kpa 菌株可湿性粉剂的制备 ： 在 50 L 发酵罐中用 YSP 培养基培养红。
19、霉素抗性标记 的 Kpa 菌株 （Kpa 红霉素抗性标记菌株由云南大学提供） ， 按培养基体积的 5% 接种液体 Kpa 种子， 发酵条件为 30、 转速 200 rpm、 通气率 0.8、 42 h。发酵结束后用超滤系统将发酵液 浓缩至原有体积的 1/5。发酵后浓缩液于保鲜薄膜上摊开， 并在室内凉干， 再用搅碎机粉碎 成 Kpa 菌剂原粉。将 Kpa 菌剂原粉与木钠、 十二烷基硫酸钠、 海藻酸钠、 蔗糖和硅藻土按照 20 11 1 2 2 164 的比例混合， 搅拌均匀， 最后得到 Kpa 菌株可湿性粉剂。 0022 用常规的稀释平板涂布法计算单位重量的 Kpa 菌剂原粉中的活性数 （cfu。
20、/g） 。将 5 gKpa 菌剂原粉于 120下烘烤 1 min 后取称重， 计算 Kpa 菌剂原粉的含水量。 0023 含水量 (%)=（初始重量 - 烘干重量） 初始重量 100%。 0024 2. Kpa 菌株可湿性粉剂防治青枯病的温室试验 供试菌剂 ： 活菌数为 1109个 /g 的 Kpa 可湿性粉剂。 0025 烟草品种 ： K326。 0026 供试病原材料 ： 烟草青枯病菌。 0027 试验方法 ： 烤烟常规漂浮育苗时， 50 g Kpa 可湿性菌剂用 300 ml 水稀释后与 1 kg 育基质混匀 ； 阳性对照处理为青枯灵可湿性粉剂， 青枯灵1 g用300 ml水稀释后与1 。
21、kg育基质混匀 ； 空 白对照为 300 ml 水与 1 kg 育基质混匀。待烟苗长至 5-6 片叶子时， 在直径为 15 cm 的、 装 有 500 g 土壤 （沙土 : 腐殖土 =1:1） 的每一花钵移栽一株烟苗， 在烟根接种青枯病病原菌 5 ml， 每处理三个重复， 每重复 5 盆。肥水管理按常规方法进行， 在室温温室内生长 90 天后统 计各处理的烟草青枯病的发病率， 按以下公式计算发病率和防效 ： 发病率 = 发病株数 / 调查株数 100% 防效 （%） = 空白对照的发病率 - 药剂处理的发病率 试验结果 ： 空白对照的发病率为 87.5% ； 青枯灵可湿性菌剂处理的发病率为 10.8%， 防 效为 76.7% ； Kpa 可湿性菌剂处理的发病率为 11.3%， 防效为 76.2%， 与化学农药青枯灵可湿 性粉剂的防治效果相当。 说 明 书 CN 102851245 A 5 。