一种地加瑞克的合成方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102952174 A (43)申请公布日 2013.03.06 CN 102952174 A *CN102952174A* (21)申请号 201210460195.9 (22)申请日 2012.11.16 C07K 7/06(2006.01) C07K 1/16(2006.01) C07K 1/06(2006.01) C07K 1/04(2006.01) (71)申请人 济南环肽医药科技有限公司 地址 250101 山东省济南市高新区舜华路 750 号 (72)发明人 厉保秋 袁强 陈明鲁 房世红 董欣 李娜 (54) 发明名称 一种地加瑞克的合成方法 (57) 。

2、摘要 本发明公开了一种地加瑞克的人工合成方 法， 以 Fmoc 保护的氨基树脂为起始原料， 按照 固相合成的方法， 用 DIC/HOBt 为偶联剂进行接 肽反应， 4 位丝氨酸以叔丁基二甲基代替叔丁基 保护羟基， 5 位苯丙氨酸苯环 4 位氨基相连的氢 化乳清酸片段先以三苯甲基保护， 最后再引入， 避免了重排副反应发生， 以 D-4Aph(Cbm) 代替 D-4Aph(Cbm-tBu)， 避免了 t-Bu 脱除困难， 减少了 副反应发生。 本发明的合成工艺步骤简单， 易于控 制， 环境污染小， 收率高， 适于工业化生产。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 6 页 (19)中华。

3、人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 6 页 1/2 页 2 1. 一种地加瑞克的固相合成方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： 以 Fmoc 保护的氨基树脂为起始原料， 按照固相合成的方法， 用 DIC/ HOBt 为偶联剂进 行接肽反应， 依次连接 Fmoc 保护的氨基酸， 获得保护的十肽树脂， 期间依次脱去氨基酸上 的 Fmoc 基团， 获得保护的十肽树脂后， 脱除氨基酸的侧链保护基， 切肽获得地加瑞克粗品， 然后纯化的地加瑞克， 包括以下步骤 ： 1） 树脂溶胀和脱保护 将Fmoc保护的氨基树脂装入固相反应柱中， 以DMF洗涤14次， 然后以DCM。

4、溶胀2040 分钟， 抽滤去除 DCM， 加入 20% DBLK 溶液脱除氨基树脂的 Fmoc 保护基， 然后以 DMF 洗涤 46 次 ； 2） 制备 Fmoc- D-Ala- 树脂 : 冰浴下将 Fmoc-D-Ala-OH 和 HOBt 溶于 DMF 中， 然后加入 DIC 活化 510 分钟， 将活化好 的溶液重复加入步骤 1） 所得的树脂中反应， 至茚三酮检测法检测树脂呈阴性时停止反应， 树脂以 DMF 洗涤 46 次， 得 Fmoc- D-Ala- 树脂 ； 3） 制备 Fmoc-D-Ala- Pro- ILys （Boc） - Leu- D-4Aph(Cbm)- L-4Aph(Tr。

5、t)- Ser(x)- D-3Pal- D-Phe（4Cl） - D-2Nal- 树脂 ： 将步骤 2） 所得的 Fmoc- D-Ala- 树脂用 DMF 洗涤 26 次， 加入 20% DBLK 溶液脱除 Fmoc 保护基， 以 DMF 洗涤 46 次， 然后按照步骤 2） 的操作进行接肽反应， 依次将 Fmoc-Pro-OH、 Fmoc-ILys（Boc） -OH、 Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-D-4Aph(Cbm)-OH、 Fmoc-L-4Aph(Trt)-OH、 Fmoc-Ser(x)-OH、 Fmoc -D-3Pal-OH， Fmoc -D-Phe（4Cl） -OH， Fmo。

6、c -D-2Nal-OH 按照地加 瑞克的氨基酸序列进行连接 ； 4） 制备 Ac-D-Ala- Pro- ILys（Boc） - Leu- D-4Aph(Cbm)- L-4Aph(Trt)- Ser(x)- D-3Pal- D-Phe（4Cl） - D-2Nal- 树脂 ： 步骤 3） 反应完毕后将树脂以 DMF 洗涤 26 次， 加入 20% DBLK 溶液脱除 Fmoc 保护基， 然后加入乙酸酐和吡啶， 用茚三酮检测法检测， 反应完成后抽干， 以 DMF 洗涤 38 次 ； 5） 制备 Ac-Ala- Pro- ILys（Boc） - Leu- D-4Aph(Cbm)- L-4Aph- 。

7、Ser(x)- D-3Pal- D-4-Cpa- D-2Nal- 树脂 : 在装有 Ac-D-Ala- Pro- ILys（Boc） - Leu- D-4Aph(Cbm)- L-4Aph(Trt)- Ser(x)- D-3Pal- D-Phe（4Cl） - D-2Nal- 树脂的的固相反应柱中加入体积比为 10的 TFA/DCM 溶 液， 室温搅拌反应后， 抽干， 以 DMF 洗涤 38 次 ； 6） 制备 Ac-Ala- Pro- ILys（Boc） - Leu- D-4Aph(Cbm)- L-4Aph（Hor） - Ser(x)- D-3Pal- D-4-Cpa- D-2Nal- 树脂 :。

8、 将 L-4,5- 二氢乳清酸溶于 DMF 中， 加入 HOBt， 再加入 DIC 活化， 然后将活化好的溶液 加入装有 Ac-Ala- Pro- ILys（Boc） - Leu- D-4Aph(Cbm)- L-4Aph- Ser(x)- D-3Pal- D-4-Cpa- D-2Nal- 树脂的的固相反应柱中， 搅拌反应 2 小时后， 茚三酮检测呈阴性， 抽干， DMF 洗涤 38 次 ； 7） 制备 Ac-Ala- Pro- ILys （Boc） - Leu- D-4Aph(Cbm)- L-4Aph （Hor） - Ser- D-3Pal- D-4-Cpa- D-2Nal- 树脂 ： 在装有。

9、 Ac-Ala- Pro- ILys（Boc） - Leu- D-4Aph(Cbm)- L-4Aph（Hor） - Ser(x)- D-3Pal- D-4-Cpa- D-2Nal-树脂的固相反应柱中， 加入TBAF的DMF溶液,搅拌反应2小时 权 利 要 求 书 CN 102952174 A 2 2/2 页 3 后以 DMF 洗涤 38 次 ； 8） 裂解制备粗肽 ： 将冰冻的裂解液加入到烘干的树脂中， 搅拌反应 2 小时， 将反应液加入乙醚中， 冰冻 2060 分钟， 离心， 以 DMF 洗涤 6 次， 至 pH 为中性为止， 分离， 干燥后得粗肽 ； 9） 纯化得地加瑞克精肽 ： 将步骤 。

10、8） 所得粗肽经分离纯化得地加瑞克精肽 ； 所述氨基树脂选自 Rink amide AM、 Rink amide MBHA 中的一种 ； 步骤 2 所述 Fmoc-Ser(x)-OH 的保护基 x 选自 TBDMS、 OBn 中的一种 ； 步骤 8） 所述裂解液由 TFA、 TIS、 苯 酚、 苯甲醚组成， TFA、 TIS、 苯酚、 苯甲醚的体积比为 95: 2:2:1。 2. 根据权利要求 1 所述的固相合成方法， 其特征在于， 所述氨基树脂的替代度为 0.40.8mmol/g。 3. 根据权利要求 1 所述的固相合成方法， 其特征在于， 步骤 4） 所述乙酸酐和吡啶的体 积比为 1:1。。

11、 4. 根据权利要求 1 所述的固相合成方法， 其特征在于， 步骤 9） 所述分离纯化包括以下 步骤 ： 将粗肽溶于5%醋酸水溶液， 经0.45m微孔滤膜过滤后， 直接上样到C18键合硅胶装 填色谱柱， 采用梯度 69% 甲醇 - 水流动相进行梯度洗脱分离， 收集目的组分。 权 利 要 求 书 CN 102952174 A 3 1/6 页 4 一种地加瑞克的合成方法 技术领域 0001 本发明涉及一种具有生理活性的多肽的合成方法， 具体地说是地加瑞克的人工合 成方法。 背景技术 0002 地加瑞克， 英文通用名 Degarelix， 是一种促性腺激素释放激素 （GnRH） 受体抑制 剂类药物，。

12、 可逆性抑制垂体 GnRH 受体来减少促性腺激素释放继而抑制睾酮的释放， 通过抑 制对前列腺癌持续生长至关重要的睾酮而延缓前列腺癌的生长和恶化。 是目前唯一临床用 于晚期前列腺癌的 GnRH 受体拮抗剂。其氨基酸序列为， Ac-D-2Nal-D-4 Cpa-D-3Pal-Ser- 4Aph(L-Hor)-D-4Aph(Cbm)-Leu-Ilys -Pro-D-Ala-NH2， 结构式如下 ： 地加瑞克从用药开始就能降低睾酮浓度， 不会产生如 GnRH 激动剂 （如戈舍瑞林、 亮丙 瑞林等） 带来的 “先升后降” 现象。Degarelix 降低睾酮浓度的效果与亮丙瑞林储库型控释 注射剂相当， 并。

13、且降低睾酮浓度在统计学上显著快， 在治疗的整个 1 年中始终抑制前列腺 特异抗原。 0003 地加瑞克能快速、 持久的控制睾酮水平来抑制前列腺癌的发展， 并且耐受性与目 前上市药物相当。随着中国社会老龄化加快， 前列腺癌的发病逐年提高， Degarelix 的市场 潜力巨大。 0004 地加瑞克为含有 7 个非天然氨基酸的线性十肽， 其中含有 5 个氨基酸为 D 构型氨 基酸。 0005 专利文献最初由 Ferring 公司 Semple Graeme 和 Jiang Guangcheng 合作研发， 专 利文献 WO9846634 报道的地加瑞克固相合成方法， 采用 Boc 策略， 以 N-。

14、Boc-D-Ala 偶合于树 脂上， 然后以TFA脱除Boc保护基， 然后按照氨基酸的次序进行接肽反应， 脱保护。 其中5位 和 6 位的 4- 氨基苯丙氨酸 （Aph） 需要采用 Fmoc 保护基进行保护， 然后再用哌啶 /DMF 溶液 脱除， 再与叔丁基异氰酸酯或 L- 氢化乳清酸反应， 然后再顺次接连下一肽键。最后经醋酸 酐酰化后， 用 HF 脱除 4 位的 Ser-OBn， 6 位的 Aph-Cbm-tBu 和 8 位的 Lys-NCbz。WO9846634 还提到了另外一种方法， 只是 5 位氨基酸侧链上的乳清酸放在整个肽链完成之后再引入。 0006 专利文献 US6214798B1。

15、 公开一种地加瑞克的液相合成方法， 提出的液相合成 方式更适合大量制备产品。最终产品的纯度大约在 98%， 然而在已有文献指出 （J.Med. Chem.,2005， 48, 4851-4860） 按照同样方式制备的产品通过毛细管区域凝胶电泳测量纯度 说 明 书 CN 102952174 A 4 2/6 页 5 为 98%， HPLC 测量仅为 96%。并且最后使用 HF 等危险气体， 不利于工业生产。 0007 专利文献 WO2010121835 公开了一种采用 Fmoc 法来制备 Degarelix 的技术方案， 由文献 （J.Chem.Soc.Perkin,Trans.2, 1984, 。

16、pg1077-1081; Org.Biomol. Chem., 2004, pg1098-1103） 可知， 5 位氨基酸侧链上的 L- 氢化乳清酸结构在碱性条件下不稳定， 容易重 排生成海因 （Hydantoin） 结构的副产物。并且通过实验发现在浓 NaOH 调节 pH 值处理时会 生成 4.5% 重量比的副产物， 2% 的 DBU/DMF(1,8- 二氮杂二环 5.4.0 十一碳 -7- 烯 / 基 ) 处理 degarelix 产生 1.8% 海因结构产物， 如果含 5% 的水， 副产物则增加至 7%。但是在 20% 的哌啶 /DMF（二甲基亚砜） 溶液中 degarelix 没有任何。

17、降解。最后采用该法可以制备小于 0.3% 重量百分比的相关物质的 degarelix， 并且减少了 L- 氢化乳清酸的重排产物生成， 另 外避免了上述 Boc 法大量使用 TFA， 减少了环境危害， 降低了对人体的高毒的 TFA（三氟乙 酸） 的危害。 0008 专利文献 WO2011066386 指出上述 Fmoc 策略中使用 t-Bu 保护丝氨酸的羟基， 脱 保护试验表明， 一般条件并不能完全脱除 t-Bu 保护， 需要 100% 的 TFA（三氟乙酸） 处理 25 小时才能完成脱保护， 在这种强烈的反应条件下， 副反应和副产物的增多， 会影响了最终产 品的质量， 如果采用 45反应可以完。

18、全脱除， 但是仍会产生降解产物影响最终产品的质量。 采用 Trt 保护丝氨酸的羟基， 可以在 95%TFA（三氟乙酸） ， 2.5%TIS（三异丙基硅烷） ， 2.5EDT （1,2- 乙二硫醇） 溶液中 45下 12 小时脱除。采用这一策略制备的 Degarelix HPLC 纯度 达到 98.5% 以上， 采用酸容易解离的 Trt 保护， 由于 Trt 基团的空间位租大和疏水性， 造成 肽键形成困难， 需要较长的反应时间进而产生更多的副产物以及序列肽缺失和消旋。 0009 因此， 急需一种工艺简单、 易于控制质量且适于大工业生产的 1,4,5,6- 四 氢 -2- 甲基 -4- 嘧啶羧酸的。

19、人工化学合成工艺。 发明内容 0010 针对上述现有技术， 本发明提供了地加瑞克的的人工合成方法。 0011 本发明是通过以下技术方案实现的 ： 一种地加瑞克的固相合成方法， 包括以下步骤 ： 以 Fmoc 保护的氨基树脂为起始原料， 按照固相合成的方法， 用 DIC/ HOBt 为偶联剂进行接肽反应， 依次连接 Fmoc 保护的氨基酸， 获得保护的十肽树脂， 期间依 次脱去氨基酸上的 Fmoc 基团， 获得保护的十肽树脂后， 脱除氨基酸的侧链保护基， 切肽获 得地加瑞克粗品， 然后纯化的地加瑞克， 包括以下步骤 ： 1） 树脂溶胀和脱保护 将 Fmoc 保护的氨基树脂装入固相反应柱中， 以 。

20、DMF 洗涤 14 次， 然后以 DCM 溶胀 2040 分钟， 抽滤去除 DCM， 加入 20% DBLK 溶液脱除氨基树脂的 Fmoc 保护基， 然后以 DMF 洗涤 46 次 ； 2） 制备 Fmoc- D-Ala- 树脂 : 冰浴下将 Fmoc-D-Ala-OH 和 HOBt 溶于 DMF 中， 然后加入 DIC 活化 510 分钟， 将活化好的溶液重复加入步骤 1） 所得的树脂中反应， 至茚三酮检测法检测树脂 呈阴性时停止反应， 树脂以 DMF 洗涤 46 次， 得 Fmoc- D-Ala- 树脂 ； 3） 制备 Fmoc-D-Ala- Pro- ILys（Boc） - Leu- D。

21、-4Aph(Cbm)- L-4Aph(Trt)- 说 明 书 CN 102952174 A 5 3/6 页 6 Ser(x)- D-3Pal- D-Phe（4Cl） - D-2Nal- 树脂 ： 将步骤 2） 所得的 Fmoc- D-Ala- 树脂用 DMF 洗涤 26 次， 加入 20% DBLK 溶液脱除 Fmoc 保护基， 以 DMF 洗涤 46 次， 然后按照步骤 2）的操作进行接肽反 应，依 次 将 Fmoc-Pro-OH、 Fmoc-ILys（Boc） -OH、 Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-D-4Aph(Cbm)-OH、 Fmoc-L-4Aph(Trt)-OH、 Fmoc-。

22、Ser(x)-OH、 Fmoc -D-3Pal-OH， Fmoc -D-Phe（4Cl） -OH， Fmoc -D-2Nal-OH 按照地加瑞克的氨基酸序列进行连接 ； 4） 制备 Ac-D-Ala- Pro- ILys（Boc） - Leu- D-4Aph(Cbm)- L-4Aph(Trt)- Ser(x)- D-3Pal- D-Phe（4Cl） - D-2Nal- 树脂 ： 步骤 3） 反应完毕后将树脂以 DMF 洗涤 26 次， 加入 20% DBLK 溶液脱除 Fmoc 保护基， 然后加入乙酸酐和吡啶， 用茚三酮检测法检测， 反应完成后抽干， 以 DMF 洗涤 38 次 ； 5） 制备。

23、 Ac-Ala- Pro- ILys（Boc） - Leu- D-4Aph(Cbm)- L-4Aph- Ser(x)- D-3Pal- D-4-Cpa-D-2Nal- 树脂 : 在装有 Ac-D-Ala- Pro- ILys（Boc） - Leu- D-4Aph(Cbm)- L-4Aph(Trt)- Ser(x)- D-3Pal- D-Phe（4Cl） - D-2Nal- 树脂的的固相反应柱中加入体积比为 10的 TFA/DCM 溶 液， 室温搅拌反应后， 抽干， 以 DMF 洗涤 38 次 ； 6） 制备 Ac-Ala- Pro- ILys（Boc） - Leu- D-4Aph(Cbm)- 。

24、L-4Aph（Hor） - Ser(x)- D-3Pal- D-4-Cpa- D-2Nal- 树脂 : 将 L-4,5- 二氢乳清酸溶于 DMF 中， 加入 HOBt， 再加入 DIC 活化， 然后将 活化好的溶液加入装有 Ac-Ala- Pro- ILys（Boc） - Leu- D-4Aph(Cbm)- L-4Aph- Ser(x)- D-3Pal- D-4-Cpa- D-2Nal-树脂的的固相反应柱中， 搅拌反应2小时后， 茚三酮检 测呈阴性， 抽干， DMF 洗涤 38 次 ； 7） 制备 Ac-Ala- Pro- ILys（Boc） - Leu- D-4Aph(Cbm)- L-4Ap。

25、h（Hor） - Ser- D-3Pal- D-4-Cpa- D-2Nal- 树脂 ： 在装有 Ac-Ala- Pro- ILys（Boc） - Leu- D-4Aph(Cbm)- L-4Aph（Hor） - Ser(x)- D-3Pal- D-4-Cpa- D-2Nal- 树脂的固相反应柱中， 加入 TBAF 的 DMF 溶液 , 搅拌反应 2 小时后以 DMF 洗涤 38 次 ； 8） 裂解制备粗肽 ： 将冰冻的裂解液加入到烘干的树脂中， 搅拌反应 2 小时， 将反应液加入乙醚 中， 冰冻 2060 分钟， 离心， 以 DMF 洗涤 6 次， 至 pH 为中性为止， 分离， 干燥后得粗肽 。

26、； 9） 纯化得地加瑞克精肽 ： 将步骤 8） 所得粗肽经分离纯化得地加瑞克精肽 ； 所述氨基树脂选自 Rink amide AM、 Rink amide MBHA 中的一种 ； 步骤 2 所述 Fmoc-Ser(x)-OH 的保护基 x 选自 TBDMS、 OBn 中的一种 ； 步骤 8） 所述裂解液由 TFA、 TIS、 苯酚、 苯甲醚组成， TFA、 TIS、 苯酚、 苯甲醚的体积比为 95: 2:2:1。 0012 所述氨基树脂的替代度为 0.40.8mmol/g。 0013 步骤 4） 所述乙酸酐和吡啶的体积比为 1:1。 0014 步骤 9） 所述分离纯化包括以下步骤 ： 将粗肽溶。

27、于 5% 醋酸水溶液， 经 0.45m 微孔 滤膜过滤后， 直接上样到 C18 键合硅胶装填色谱柱， 采用梯度 69% 甲醇 - 水流动相进行梯 说 明 书 CN 102952174 A 6 4/6 页 7 度洗脱分离， 收集目的组分。 0015 本发明的地加瑞克的人工合成方法， 以 Fmoc 固相合成， 避免了 Boc 方法反复用酸 来脱保护带来的问题 ： 如在肽与树脂的接头处， 当每次用 50%TFA（三氟乙酸） 脱 Boc 基时， 有约 1.4% 的肽从树脂上脱落， 合成的肽链越长， 损失越严重 ； 此外， 酸处理会引起侧链的一 些副反应。避免了 HF 气体使用， 减轻了环保压力 ； 大。

28、大降低 TFA（三氟乙酸） 使用， 避免了 合成过程中副产物对环境的污染 ； 本发明的地加瑞克的人工合成方法， 4 位丝氨酸以 TBDMS （叔丁基二甲基） 代替叔丁基保护羟基。最后可以用 TBAF（四丁基氟化铵） 温和条件下脱除， 不会带来其他副反应， 减少了杂质生成 ； 本发明的地加瑞克的人工合成方法， 5 位苯丙氨 酸苯环 4 位氨基相连的氢化乳清酸片段在碱性条件下容易发生重排 , 先以三苯甲基保护， 最后再引入， 避免了重排副反应发生 ； 本发明的地加瑞克的人工合成方法， 以 D-4Aph(Cbm) 代替 D-4Aph(Cbm-tBu)， 避免了 t-Bu 脱除困难， 减少了副反应发生。

29、。 具体实施方式 0016 下面结合实施例对本发明作进一步的说明， 应当理解的是， 以下实施例仅用于解 释本发明， 而不是限制本发明的保护范围。 0017 实施例 1 地加瑞克的固相合成 1） Fmoc 保护的 Rink amide AM 树脂溶胀和脱保护 将 Fmoc 保护的 Rink amide AM（替代度 0.49mmol/g， 0.82g， 0.4mmol） 装入固相反应柱 中， 以 DMF 洗涤 14 次， 然后以 DCM 溶胀 2040 分钟， 抽滤去除 DCM， 加入 20% DBLK 溶液脱保 护 5 分钟， 10 分钟各一次， 然后以 DMF 洗涤 46 次。 0018 2。

30、） 制备 Fmoc- D-Ala-Rink amide AM 树脂 冰浴下将 F-D-Ala-OH（249mg， 0.8mmol） ， HOBt-Cl（164mg， 0.88mmol） 溶于 2ml DMF 中， 然后加入 124L DIC 活化 510 分钟将活化好的溶液重复加入步骤 1） 所得的树脂中反应， 至茚三酮检测法检测树脂呈阴性时停止反应， 树脂以 DMF 洗涤 46 次， 得 Fmoc- D-Ala- Rink amide AM 树脂 ； 3） 制备 Fmoc-D-Ala- Pro- ILys（Boc） - Leu- D-4Aph(Cbm)- L-4Aph(Trt)- Ser(T。

31、BDMS)- D-3Pal- D-Phe（4Cl） - D-2Nal- Rink amide AM 树脂 将步骤 2） 所得的 Fmoc- D-Ala-Rink amide AM 用 DMF 洗涤 26 次， 加入 20% DBLK 溶液脱除 Fmoc 保护基， 以 DMF 洗涤 46 次， 然后按照步骤 2） 的操作进行接 肽反应， 依次将 Fmoc-Pro-OH、 Fmoc-ILys（Boc） -OH、 Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-D-4Aph(Cbm)-OH、 Fmoc-L-4Aph(Trt)-OH、 Fmoc-Ser(TBDMS)-OH、 Fmoc -D-3Pal-OH， Fm。

32、oc -D-Phe（4Cl） -OH， Fmoc -D-2Nal-OH 按照地加瑞克的氨基酸序列进行连接 ； 4） 制备Ac-D-Ala- Pro- ILys （Boc） - Leu- D-4Aph(Cbm)- L-4Aph(Trt)- Ser(TBDMS)- D- 3Pal- D-Phe（4Cl） - D-2Nal- Rink amide AM 树脂 ： 步骤 3） 反应完毕后将树脂以 DMF 洗涤 26 次， 加入 20% DBLK 溶液脱除 Fmoc保护基， 然后加入2ml乙酸酐和2ml吡啶， 用茚三酮检测法检测， 反应完成后抽干， 以 DMF 洗涤 38 次 ； 5）制 备 Ac-Al。

33、a- Pro- ILys（Boc） - Leu- D-4Aph(Cbm)- L-4Aph- Ser(TBDMS)- 说 明 书 CN 102952174 A 7 5/6 页 8 D-3Pal- D- 4-Cpa- D-2Nal- 树脂 : 在装有 Ac-D-Ala- Pro- ILys（Boc） - Leu- D-4Aph(Cbm)- L-4Aph(Trt)- Ser(TBDMS)- D-3Pal- D-Phe（4Cl） - D-2Nal- Rink amide AM 树脂的的固相反应柱 中加入体积比为 10的 TFA/DCM 溶液， 室温搅拌反应后， 抽干， 以 DMF 洗涤 38 次 ； 。

34、6） 制备 Ac-Ala- Pro- ILys（Boc） - Leu- D-4Aph(Cbm)- L-4Aph（Hor） - Ser(TBDMS) - D -3Pal- D-4-Cpa- D-2Nal- Rink amide AM 树脂 : 将 L-4,5- 二氢乳清酸 (190mg,1.2mmol) 溶于 1mlDMF 中， 加入 HOBt (183mg, 1.2mmol)， 再加入 DIC（124L） 活化， 然后将活化好的溶液加入装有 Ac-Ala- Pro- ILys（Boc） - Leu- D-4Aph(Cbm)- L-4Aph- Ser(TBDMS)- D-3Pal- D-4-Cp。

35、a- D-2Nal- 树 脂的的固相反应柱中， 搅拌反应 2 小时后， 茚三酮检测呈阴性， 抽干， DMF 洗涤 38 次 ； 7） 制备 Ac-Ala- Pro- ILys （Boc） - Leu- D-4Aph(Cbm)- L-4Aph （Hor） - Ser- D-3Pal- D-4 -Cpa- D-2Nal- Rink amide AM 树脂 ： 在装有 Ac-Ala- Pro- ILys （Boc） - Leu- D-4Aph(Cbm)- L-4Aph （Hor） - Ser(TBDMS)- D-3Pal-D-4-Cpa- D-2Nal- Rink amide AM 树脂的固相反应柱。

36、中， 加入 TBAF（314mg， 1.2mmol） 的 DMF 溶液 , 搅拌反应 2 小时后以 DMF 洗涤 38 次 ； 8） 裂解制备粗肽 ： 将冰冻 （-5） 的裂解液 （TFA ： TIS ： 苯酚 ： 苯甲醚 =95:2:2:1, 1ml） 加入到 烘干的树脂中， 搅拌反应 2h。将反应液倾入到 6ml 的乙醚中， 冰冻 20-60 分钟。离心 （4000rpm， 5min） ， ， 以 DMF 洗涤 6 次， 至 pH 为中性为止。分离， 干燥后得粗肽 0.85g。 0019 9 纯化得地加瑞克精肽 ： 将步骤 8） 所得粗肽溶于 5% 醋酸水溶液， 经 0.45m 微孔滤膜过。

37、滤后， 直接上样到 C18 键合硅胶装填色谱柱， 采用梯度69%甲醇-水流动相进行梯度洗脱分离， 收集目的组分， 得 地加瑞克精肽 0.357g， 收率 42%， 纯度 99.8% ； 实施例 2 地加瑞克的固相合成 将实施例 1 中 Fmoc 保护的 Rink amide AM 树脂换成 Fmoc 保护的 Rink amide MBHA （替 代度 =0.73mmol/g， 0.55g， 0.4mmol） 。其余操作同实施例 1， 收缩后得肽树脂 1.17g， 裂解后 得粗肽 0.52g， 精肽 0.21g， 收率 40%。 0020 实施例 3 地加瑞克的固相合成 将实施例 1 中步骤 3） 的 Fmoc-Ser(TBDMS)-OH 换为 Fmoc-Ser(OBn)-OH， 其余操作同实 施例 1， 脱除 Obn 保护基的反应条件于实施例相同， 得精肽， 收率为 47%， 纯度 99.6% 实施例和前述过程采用的缩写及其代表的物质如下 ： 说 明 书 CN 102952174 A 8 6/6 页 9 说 明 书 CN 102952174 A 9 。