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1、(10)申请公布号 CN 102899384 A (43)申请公布日 2013.01.30 CN 102899384 A *CN102899384A* (21)申请号 201210455108.0 (22)申请日 2012.11.13 C12Q 1/02(2006.01) (71)申请人 中国科学院广州生物医药与健康研 究院 地址 510530 广东省广州市科学城开源大道 190 号 申请人 陈峰 (72)发明人 陈峰 裴端卿 粱桂婵 周兴茹 舒晓东 (74)专利代理机构 天津滨海科纬知识产权代理 有限公司 12211 代理人 杨慧玲 (54) 发明名称 应用斑马鱼测试有机溶剂毒性的方法 (5。
2、7) 摘要 本发明涉及一种应用斑马鱼测试有机溶剂毒 性的方法， 其主要步骤为 ： 配制胚胎培养液， 然后 向胚胎培养液中加入有机溶剂， 使得胚胎培养液 中有机溶剂的浓度达到测量需要的浓度， 用加入 了有机溶剂的胚胎培养液培养斑马鱼胚胎， 然后 在 6-12 小时观察记录斑马鱼胚胎发育的畸形率 和死亡率， 来判断有机溶剂对胚胎的毒性。 其中胚 胎培养液用 pH 为 6.7-8.5 的弱碱性水直接配制， 胚胎培养液中含有5mM NaCl、 0.17mM KCl、 0.43mM CaCl2和0.33mM MgSO4。 本发明使用弱碱性水配制 的胚胎培养液使得斑马鱼胚胎能够快速测试有机 溶剂的毒性， 。
3、缩短了检测周期。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 2 页 1/1 页 2 1. 本发明提供一种应用斑马鱼测试有机溶剂毒性的方法， 其特征在于包含如下步骤 ： 配制胚胎培养液， 然后向胚胎培养液中加入有机溶剂， 使得胚胎培养液中有机溶剂的 浓度达到测量需要的浓度， 用加入了有机溶剂的胚胎培养液培养斑马鱼胚胎， 然后在 6-12 小时观察记录斑马鱼胚胎发育的畸形率和死亡率， 来判断有机溶剂对胚胎的毒性。 2. 根据权利要求 1 所述的方法， 其中胚胎培养液。
4、用 pH 为 6.7-8.5 的弱碱性水直接配 制， 胚胎培养液中含有 5mM NaCl、 0.17mM KCl、 0.43mM CaCl2和 0.33mM MgSO4。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的方法， 其中斑马鱼胚胎通过如下方法选择 ： 采卵前一天将性成熟的斑马鱼， 按雌雄为12的比例放入配缸内并隔开， 次日上午 9:00 自然交配并收集受精卵， 用胚胎培养液清洗两次收集得到的受精卵， 并去除杂质和坏 卵， 之后后置于胚胎培养液中， 29.3进行控光培养 ； 当 2hpf 时， 在显微镜下挑选来自同一 亲本、 正常发育比率达 85以上且发育时期一致的斑马鱼胚胎。 4. 根据权利。
5、要求 1-3 任一项所述的方法， 其中培养斑马鱼胚胎的方法如下 ： 将斑马鱼 胚胎用胚胎培养液清洗两次， 然后移入 24 孔板的样孔中， 每孔 20 枚， 每孔滴加加入了有机 溶剂的胚胎培养液， 每孔 3ml， 随后加盖封闭， 置于培养箱中， 在 29.3培养斑马鱼胚胎。 5.根据权利要求1-4任一项所述的方法， 其中观察记录的时间是培养后第4、 6、 8、 12小 时， 记录畸形率和死亡率。 6. 根据权利要求 1-5 任一项所述的方法， 其中 pH 为 7.0-7.8。 7. 根据权利要求 6 所述的方法， 其中 pH 为 7.2。 8. 根据权利要求 1-7 任一项所述的方法， 其中有机。
6、溶剂为任何需要测量其对生物毒性 的有机溶剂。 9. 根据权利要求 8 所述的方法， 其中有机溶剂为二甲基甲酰胺、 丙酮、 甲醇和乙醇中任 意一种。 权 利 要 求 书 CN 102899384 A 2 1/5 页 3 应用斑马鱼测试有机溶剂毒性的方法 技术领域 0001 本发明涉及毒性检测领域， 具体涉及一种应用斑马鱼测试有机溶剂毒性的方法。 背景技术 0002 现有技术中大多数药物水溶性较差， 因此在剂型制备过程中往往需要一定量的溶 剂。然而， 溶剂作为化学物质， 对人或动物等也存在一定的潜在威胁， 大量的摄入也会影响 人或动物的健康。因此， 快速检测溶剂的毒性， 拟定其最高使用限量将变得尤。
7、为重要。 0003 斑马鱼是一种新颖的模式生物， 活体斑马鱼筛选模型具有诸多优势， 是取代青蛙、 果蝇、 小白鼠等作为研究对象的优良试验模式鱼。斑马鱼喂养和维持的费用更便宜， 所需 空间场地不大， 易于室内大规模繁殖。成体鱼长 3 4cm， 一次交配能获得 100 200 个 胚胎， 每周产卵一次， 这样中等规模的鱼缸每年就能养殖成鱼数百万只， 成本仅为养小鼠的 0.1 -1。斑马鱼是一种脊椎动物， 与人类基因的相似度高达 85左右， 实验结果可比性 强， 所以可以利用斑马鱼来检测物质的毒性， 进而初步评价其对人类等的毒性。 0004 现有技术中也有溶剂对斑马鱼胚胎发育影响相关的报道。例如王思。
8、峰等发表 的 “溶剂乙醇对斑马鱼胚胎发育的影响”中， 分析了乙醇对斑马鱼胚胎发育的影响 ； 李 佳等发表的 “助溶剂甲苯和二甲基亚砜对斑马鱼胚胎发育的复合毒性效应”中， 分析了 甲苯和二甲基亚砜对斑马鱼胚胎发育的复合毒性效应的研究。前者是在 12hpf(hours post-fertilization， 受精后小时数 )、 24hpf 时进行处理， 而在 72hpf 进行调查统计 ； 后者 虽然是在 3hpf 时进行处理， 但最快也需在 12hpf 才能调查胚胎发育情况。上述两篇现有技 术所报道的方法周期均较长。 0005 本发明发明人在科研过程中， 有了一个惊奇的发现， 即当使用特殊的胚胎培。
9、养液 配制溶剂时， 能够使胚胎对溶剂的不良反应在较短的时间内表现出来， 大大缩短了检测周 期， 正是基于上述发现， 发明人完成了本发明。 发明内容 0006 本发明所要解决的技术问题提供一种应用斑马鱼测试有机溶剂毒性的方法。 为了 解决上述问题， 本发明采用以下的技术方案。 0007 本发明提供一种应用斑马鱼测试有机溶剂毒性的方法， 其特征在于包含如下步 骤 ： 0008 配制胚胎培养液， 然后向胚胎培养液中加入有机溶剂， 使得胚胎培养液中有机溶 剂的浓度达到测量需要的浓度， 用加入了有机溶剂的胚胎培养液培养斑马鱼胚胎， 然后在 6-12 小时观察记录斑马鱼胚胎发育的畸形率和死亡率， 来判断有。
10、机溶剂对胚胎的毒性。其 中胚胎培养液用 pH 为 6.7-8.5 的弱碱性水直接配制， 胚胎培养液中含有 5mM NaCl、 0.17mM KCl、 0.43mM CaCl2和 0.33mM MgSO4。 0009 上述方法中， 斑马鱼胚胎通过如下方法选择 ： 0010 采卵前一天将性成熟的斑马鱼， 按雌雄为12的比例放入配缸内并隔开， 次日 说 明 书 CN 102899384 A 3 2/5 页 4 上午 9:00 自然交配并收集受精卵， 用胚胎培养液清洗两次收集得到的受精卵， 并去除杂质 和坏卵， 之后后置于胚胎培养液中， 29.3进行控光培养 ； 当 2hpf 时， 在显微镜下挑选来自。
11、 同一亲本、 正常发育比率达 85以上且发育时期一致的斑马鱼胚胎。 0011 上述方法中， 培养斑马鱼胚胎的方法如下 ： 将斑马鱼胚胎用胚胎培养液清洗两次， 然后移入 24 孔板的样孔中， 每孔 20 枚， 每孔滴加加入了有机溶剂的胚胎培养液， 每孔 3ml， 随后加盖封闭， 置于培养箱中， 在 29.3培养斑马鱼胚胎。 0012 上述方法中， 观察记录的时间是培养后第 4、 6、 8、 12 小时， 记录畸形率和死亡率。 0013 上述方法中， pH 为 7.0-7.8， 优选地， pH 为 7.2。 0014 畸形是指斑马鱼体型与正常的相同培养时间单用胚胎培养液培养的斑马鱼体型 有差异。 。
12、0015 死亡是指用搅拌棒触碰斑马鱼尾部时斑马鱼没有任何反应。上述方法中， 所述的 有机溶剂为任何需要测量其对生物的毒性有机溶剂， 优选地， 有机溶剂为二甲基甲酰胺、 丙 酮、 甲醇和乙醇中任意一种。 0016 本发明配制胚胎培养液所用的氯化钠、 氯化钾、 氯化钙、 硫酸镁以及弱碱性水等均 为市购， 其中无机盐均为 AR 级 ； 0017 本发明试验用溶剂分别为 ： 0018 二甲基甲酰胺 ： Sigma-Aldrich(Cat#D1435-1L) ； 0019 丙酮 ： 广州化学试剂厂 AR 级 ； 0020 甲醇 ： 广州化学试剂厂 AR 级 ； 0021 乙醇 ： 广州化学试剂厂 AR 。
13、级。 0022 需要特别说明的是， 弱碱性水可以采用任何通过光电催化电解水获得的弱碱性 水， 该弱碱性水的 pH 为 6.7-8.5， 可以通过市场上的弱碱性水制备装置制备， 也可以自行通 过电解的方式制备， 需要注意的是本发明的弱碱性水并不是通过在水中加入化学物质制备 得到的弱碱性水， 任何通过加入化学物质到水中制备的弱碱性水不是本发明所说的弱碱性 水。弱碱性水的 pH 可以在制备中调节， 而不是通过加入化学物质调节 pH。 0023 本发明的有益效果 ： 0024 本发明使用弱碱性水配制的胚胎培养液来作为测试有机溶剂毒性的培养液， 其不 仅因为培养液中的水为弱碱性水， 还因为培养液中的无机。
14、盐的特定组成， 使得斑马鱼胚胎 能够快速测试有机溶剂的毒性， 缩短了检测周期。 附图说明 0025 图 1 ： 正常斑马鱼 ； 0026 图 2 ： 二甲基甲酰胺处理时畸形的斑马鱼 ； 0027 图 3 ： 丙酮处理时畸形的斑马鱼 ； 0028 图 4 ： 甲醇处理时畸形的斑马鱼 ； 0029 图 5 ： 乙醇处理时畸形的斑马鱼 ； 具体实施方式 0030 为了理解本发明， 下面以实施例进一步说明本发明， 但本发明并不限制于此。 说 明 书 CN 102899384 A 4 3/5 页 5 0031 实施例 1 最佳胚胎培养液的筛选 0032 1.1 不同配方的胚胎培养液的配制及培养斑马鱼的效。
15、果 0033 A用普通水配制包含以下浓度无机盐的胚胎培养液， 调节pH为7.2， 培养斑马鱼胚 胎 72 小时， 观察斑马鱼的透明度和存活率。具体结果见表 1 ： 0034 表 1 普通水配制的胚胎培养液对斑马鱼胚胎的影响 0035 0036 0037 B用通过电解纯水制备的pH为7.2的弱碱性水配制包含以下浓度无机盐的胚胎培 养液， 培养斑马鱼胚胎 72 小时， 观察斑马鱼的透明度和存活率。具体结果见表 2 ： 0038 表 2 弱碱性水配制的胚胎培养液对斑马鱼胚胎的影响 0039 0040 通过普通水和弱碱性水配制的不同浓度比例的培养液可以看出， A1 和 B1 的培养 液对斑马鱼的培养效。
16、果最好。这证明本发明采用的无机盐浓度作为培养液是优选的。 0041 实施例 2 斑马鱼毒性测定 0042 分别用上述编号 A1 和 B1 的胚胎培养液配制梯次浓度的有机溶液， 并对所述溶液 进行斑马鱼毒性测定， 其中每一处理重复 5 次， 取平均值， 对照为未加溶剂的胚胎培养液 A1 和 B1。主要通过以下步骤进行测定 ： 0043 1) 斑马鱼的培养 ： 0044 取性成熟 AB 系普通斑马鱼雌雄分缸， 饲养于流水循环养殖系统， 照明 14h/ 黑暗 10h 交替进行， 水温保持在 28， 定时喂以人工孵育 24h 的丰年虾 ； 0045 2) 胚胎挑选 ： 说 明 书 CN 1028993。
17、84 A 5 4/5 页 6 0046 采卵前一天将性成熟的斑马鱼， 按雌雄为12的比例放如配缸内并隔开， 次日 上午9:00自然交配并收集受精卵， 用胚胎培养液B1清洗两次收集得到的受精卵， 并去除杂 质和坏卵， 之后后置于胚胎培养液B1中， 29.3进行控光培养 ； 当2hpf时， 在显微镜下挑选 来自同一亲本、 正常发育比率达 85以上且发育时期一致的胚胎， 用胚胎培养液 B1 清洗两 次后移入 24 孔板的样孔中， 每孔 20 枚 ； 0047 3) 溶剂处理 ： 0048 吸走样孔中的胚胎培养液 B1， 且将配制好的含有梯次浓度的有机溶剂胚胎培养液 和不含有机溶剂的培养液A1和B1分。
18、别迅速加入样孔中， 每孔3ml， 随后加盖封闭， 置于培养 箱 29.3培养 ； 0049 4) 观察胚胎和记录 ： 0050 定期在显微镜下观察并记录胚胎的畸形率 ( 取 5 次平行试验的平均值 ) 和死亡率 ( 取 5 次平行试验的平均值 )。 0051 结果， 见表 3 ： 0052 表 3 含梯次浓度有机溶剂的胚胎培养液处理结果 0053 0054 通过对斑马鱼胚胎的 A1 培养液和 B1 培养液的试验发现， A1 和 B1 胚胎培养液本 身对斑马鱼胚胎的影响是相同， 培养液本身并没有对斑马鱼胚胎的生长产生影响， 但是如 果加入有机溶剂发现， 同样在 3的二甲基甲酰胺的培养液中培养斑马。
19、鱼， 可以发现 B1 的 培养液对斑马鱼胚胎的影响是迅速的， 能够在培养 4 小时就见到明显效果， 培养 12 小时就 说 明 书 CN 102899384 A 6 5/5 页 7 能够达到含有相同有机溶剂量的 A1 的培养到 48 小时候才能够看到的效果， 所以说 B1 培养 液中测试有机溶剂对斑马鱼胚胎的影响是快速的， 也就是说用斑马鱼胚胎测试有机溶剂的 影响， 用B1的胚胎培养液效果明显， 时间短， 反应迅速。 B1胚胎培养液的特点是用弱碱性水 配制培养液， 其中的无机盐能够与弱碱性水共同实现斑马鱼测试有机溶剂的毒性的作用。 0055 根据实施例 2 的方法， 测试丙酮、 甲醇和乙醇对斑。
20、马鱼的毒性， 能够产生同样的效 果。含有 1丙酮的 B1 培养液在 6 小时能够达到 1丙酮的 A1 培养液在 24 小时达到的畸 形率和死亡率之和的 92.6， 含有 2.5甲醇的 B1 培养液在 8 小时能够达到 2.5甲醇的 A1 培养液在 48 小时达到的畸形率和死亡率之和的 96.1， 含有 2乙醇的 B1 培养液在 12 小时能够达到 2乙醇的 A1 培养液在 72 小时达到的畸形率和死亡率之和的 95.9。 0056 所以说应用弱碱性水配制的5mM NaCl、 0.17mM KCl、 0.43mM CaCl2和0.33mM MgSO4 的培养液能够使得斑马鱼胚胎快速检测出有机溶剂的毒性。 不同溶剂导致斑马鱼胚胎发育 的畸形状态参见图 2-5。争产的斑马鱼发育参见图 1。 说 明 书 CN 102899384 A 7 1/2 页 8 图 1 图 2 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102899384 A 8 2/2 页 9 图 5 说 明 书 附 图 CN 102899384 A 9 。