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1、(10)申请公布号 CN 102952852 A (43)申请公布日 2013.03.06 CN 102952852 A *CN102952852A* (21)申请号 201110244530.7 (22)申请日 2011.08.25 C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 华中农业大学 地址 430070 湖北省武汉市洪山区狮子山街 1 号 (72)发明人 刘榜 翟珊莉 陶晨雨 张庆德 (74)专利代理机构 武汉宇晨专利事务所 42001 代理人 张红兵 (54) 发明名称 一种适用于转人乙肝表面抗原基因山羊的快 速简便检测方法 (57) 摘要 本发明属于转基因动物中转基因成分。
2、的分子 检测技术领域， 具体涉及提供一种适用于转人乙 肝表面抗原山羊的快速简便检测方法， 本发明利 用环介导等温扩增法原理， 准确快速检测出转基 因山羊中的人乙肝表面抗原基因。本发明不需要 特殊设备， 为基层检测人员提供一种快速简便的 方法， 本发明的方法同时也为转基因生物及其产 品安全评价和管理提供了实用的分子检测方法。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表 2 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表 2 页 附图 4 页 1/1 页 2 1. 一种适用于转人乙肝表面抗原基因山羊的。
3、快速、 简便检测方法， 其步骤包括 ： (1) 引物设计及合成 ： 根据人乙肝表面抗原基因的序列设计特异性引物， 所述引物的 DNA 序列如下所示 ： FIP ： 5 -CGAAAGCCCAGGATGATGGGAT-(AAGCTT)-TGCTGTACAAAACCTTCGGA-3 ， BIP ： 5 -AGATTCCTATGGGAGTGGGCCT-(AAGCTT)-CGAACCACTGAACAAATGGC-3 ； F3 ： 5 -TCCTGCTCAAGGAACCTCTA-3 ， B3 ： 5 -AAACAGTGGGGGAAAGCC-3 ； (2) 环介导等温扩增反应 ： 以 FIP、 BIP 为。
4、内引物， F3、 B3 为外引物对人乙肝表面抗原基因进行恒温扩增， 其反应 体系为 ： 1M 甜菜碱， 400M dNTPs， 2.5l 10Bst Buffer， Mg2+ 1mM， 6.4U Bst DNA 聚合 酶， 1l 模板， 外引物 F3 和 B3 各 0.2M， 内引物 FIP 和 BIP 各 1.6M， 补双蒸水至 25l， 将上述除酶以外的所有试剂混匀置于 200l EP 管中， 于 90反应 5min， 反应后立即冰浴 1-2min， 再加入 6.4U Bst DNA 聚合酶， 于 63反应 60min， 80下反应 5min 后终止反应 ； (3) 环介导恒温扩增产物分析。
5、 ： 1) 琼脂糖凝胶电泳 ： 取 2l 扩增产物， 加入 1l 上样缓冲液， 该缓冲液包含浓度为 40的甘油、 0.2溴酚蓝和 59.8 0.25M Tris-HCl， 混匀， 再按质量体积计加 2琼脂糖 凝胶， 于 5V/cm 下电泳 30min， 得到凝胶成像， 观察是否有梯形条带出现 ； 2) 将 SYBR Green I 荧光染料稀释 100 倍后作为工作液， 取 5l 的环介导等温扩增产 物， 再加 0.5lSYBRGreen I 的工作液， 在日光下用肉眼观察结果。 权 利 要 求 书 CN 102952852 A 2 1/7 页 3 一种适用于转人乙肝表面抗原基因山羊的快速简便。
6、检测方 法 技术领域 0001 本发明属于转基因成分的检测技术领域， 具体涉及适用于转人乙肝表面抗原基因 转基因山羊的快速简便检测方法。 背景技术 0002 转基因生物的安全评价是转基因生物及其产品市场化和商品化的前提， 在安全评 价中转基因成分的检测是一项重要内容， 建立转基因生物快速、 简便、 准确的检测方法为安 全评价和管理奠定基础。 0003 乙型肝炎 (Hepatitis B) 是世界上分布最广泛的传染病之一， 是由乙型肝炎病毒 (Hepatitis B virus， HBV) 引起的。而乙肝表面抗原 (Hepatitis B surface antigen， HBsAg)是HBV包。
7、膜蛋白的组分， 具有良好的免疫原性， 且HBV的保护性抗原表位主要集中于 HBsAg， 目前所研制的所有乙肝基因工程疫苗都是由 HbsAg 组成。我国已经研制出了转人乙 肝表面抗原转基因山羊， 转基因动物及其产品市场化是将来发展的必然趋势， 因此建立一 种快速、 简便的检测转人乙肝表面抗原的转基因检测的方法， 具有必要性和紧迫性。 0004 综合目前各国对转基因产品的检测技术， 根据检测目标， 可将其分为以下三个水 平 ： 插入的外源基因的检测 ； 插入外源基因的表达产物 (RNA 或者蛋白质 ) 的检测 ； 插入的 外源基因对受体生物基因表达的影响 ( 外源基因的插入对位点附近的基因的影响从。
8、而对 整个生物体的代谢的影响 ) 的研究， 而其中核酸水平的检测应用更为广泛。 0005 核酸水平的检测， 主要采用的方法是 PCR 扩增， 即依据转入外源基因的启动子、 目 的基因、 终止子及表达(重组)载体信息， 设计特异性引物， 进行聚合酶链式反应， 依据产物 的有无或多少判断是否为转基因产品。 PCR检测转基因产品， 通常涉及以下技术 ： 定性PCR、 定量 PCR、 巢式 PCR、 多重 PCR、 热不对称交错 PCR 等。 0006 PCR 反应具有高灵敏度、 高特异性、 高效性的特点， 是转基因产品初筛阶段的主要 检测方法， 需要进行 PCR 扩增和电泳检测两个环节， 但必须依赖。
9、 PCR 仪和电泳仪等仪器设 备， 检测费用高， 对检测人员有较高的技术要求， 无法在条件较差的基层或现场进行。研发 一种不需要设备， 是与基层和现场快速检测转基因动物的方法具有重要意义和应用前景。 发明内容 0007 本发明的目的在于克服现有技术的局限性， 提供适用于转人乙肝表面抗原基因山 羊的快速简便检测方法， 利用环介导等温扩增法原理建立外源基因的快速检测方法， 能准 确快速检测出转基因山羊中人乙肝表面抗原基因。本发明不需要特殊设备， 为基层检测人 员提供一种快速简便的方法， 本发明的方法同时也为转基因生物及其产品安全评价和管理 提供借鉴。 0008 实现本发明的技术方案如下 ： 000。
10、9 (1) 引物设计及合成 ： 根据人乙肝表面抗原 (HBsAg) 基因 ( 登录号 ： Genbank ： 说 明 书 CN 102952852 A 3 2/7 页 4 AF223961) 设计特异性引物， 所述引物的 DNA 序列如下所示 ： 0010 FIP ： 5 -CGAAAGCCCAGGATGATGGGAT-(AAGCTT)-TGCTGTACAAAACCTTCGGA-3， 0011 BIP ： 5 -AGATTCCTATGGGAGTGGGCCT-(AAGCTT)-CGAACCACTGAACAAATGGC-3 ； 0012 F3 ： 5 -TCCTGCTCAAGGAACCTCTA-3。
11、， 0013 B3 ： 5 -AAACAGTGGGGGAAAGCC-3 ； 0014 (2) 环介导等温扩增反应 0015 以 FIP、 BIP 为内引物， F3、 B3 为外引物对人乙肝表面抗原基因进行恒温扩增， 其反 应体系为 ： 1M甜菜碱， 400M dNTPs， 2.5l 10Bst Buffer， Mg2+ 1mM， 6.4U Bst DNA聚合 酶， 1l 模板， 外引物 F3 和 B3 各 0.2M， 内引物 FIP 和 BIP 各 1.6M， 补双蒸水至 25l， 将上述除酶以外的所有试剂混匀置于 200lEP 管中， 于 90反应 5min， 反应后立即冰浴 1-2min，。
12、 再加入 6.4U Bst DNA 聚合酶， 于 63反应 60min， 80下反应 5min 后终止反应 ； 0016 (3) 环介导恒温扩增产物分析 0017 1) 琼脂糖凝胶电泳 ： 取 2.5l 扩增产物， 加入 1l 上样缓冲液 ( 浓度为 40的 甘油， 0.2溴酚蓝， 59.8 0.25M Tris-HCl)， 混匀， 再于 2琼脂糖凝胶中电泳 30min， 得 到凝胶成像， 观察是否有阶梯型条带， 若有阶梯型条带则判定为含有人乙肝表面抗原基因 ( 即含有转基因成分 )， 若没有阶梯型条带则判定为不含人乙肝表面抗原基因。 0018 2) 荧光染料染色 ： 将 SYBR Green。
13、 I 荧光染料稀释 100 倍 ( 按体积计 ) 后作为工 作液， 取 5l 的环介导等温扩增产物， 再加 0.5lSYBR Green I 的工作液， 在日光下用肉 眼观察结果。若加入 SYBR Green I 工作液后， 扩增产物变为黄绿色， 则判定为含有人乙肝 表面抗原基因， 若加入 SYBR Green I 工作液后， 扩增产物为棕黄色则判定为不含有人乙肝 表面抗原基因。 0019 本发明成功建立了对转人乙肝表面抗原基因快速、 灵敏、 特异而又简单实用的检 测方法。与其它传统 PCR 方法相比该发明有以下优点 ： 0020 1. 本发明经济实用 ： 反应是在恒温的条件下进行， 所以不需。
14、要昂贵的 PCR 仪， 只需 要一台可以提供恒温的设备， 例如水浴锅即可。 0021 2. 本发明的灵敏度高 ： 采用本方法可以检测下限至 10 个拷贝的转人乙肝表面抗 原基因， 比普通的 PCR 的灵敏度高 10 倍。 0022 3. 本发明的特异性强 ： 本发明采用设计了 4 条引物， 可识别 6 个特异性区域， 增加 了与目的基因结合的特异性。 0023 4. 本发明的检出率高 ： 对 5 头转人乙肝表面抗原基因的转基因山羊进行检测， 均 检测出转基因成分， 检出率为 100， 对 15 个人的 DNA 样品进行了 LAMP 扩增， 结果表示， 检 出率为 100。 0024 5. 本发。
15、明检测简单 ： 直接肉眼观察反应产物经 SYBR Green I 染色后的颜色变化 来定性判断靶序列扩增与否。 附图说明 0025 序列表 SEQ ID NO ： 1 是扩增的人乙肝表面抗原 (HBsAg) 基因 ( 登录号 ： Genbank ： AF223961) 的部分核苷酸序列， 序列长度为 194bp。序列表 SEQ ID NO ： 2-5 分别是设计的引 物序列 ( 序列编号依次为 ： FIP ； BIP ； F3 和 B3)。 说 明 书 CN 102952852 A 4 3/7 页 5 0026 图 1 ： 本发明扩增的人乙肝表面抗原基因的特异片段， 片段全长为 194p， 序。
16、列线条 标记部分为引物所处位置， 序列中方框所示位置为限制性内切酶 HaeIII 识别的酶切位点。 0027 图 2 ： PCR 扩增人乙肝表面抗原基因电泳图， 图中 ： M ： DL2000 DNA marker ； 1-3 ： 模 板为人基因组 DNA ； 4 ： 模板为非转基因山羊基因组 DNA ； 5 ： 水。 ： 0028 图3 ： LAMP扩增人乙肝表面抗原基因电泳图， 图中 ： M ： DL2000 DNA marker ； 1-3 ： 模 板为人基因组 DNA ； 4 ： 模板为非转基因山羊基因组 DNA ； 5 ： 水。 0029 图 4 ： LAMP 扩增人乙肝表面抗原基因。
17、可视化结果， 图中 1-3 ： 模板为人基因组 DNA ； 4 ： 模板为非转基因山羊基因组 DNA ； 5 ： 水。 0030 图 5 ： LAMP 扩增人乙肝表面抗原基因产物酶切组成图， 图中方框所示部分为酶切 后产物组成。 0031 图 6 ： LAMP 扩增人乙肝表面抗原基因产物酶切验证电泳图， 图中 ： M ： DL2000 DNA marker ； 1 ： LAMP 扩增产物 ； 2 ： 酶切后的 LAMP 扩增产物。 0032 图 7 ： 是本发明构建的 pMD18T-HbsAg 的结构图， 图中显示了插入 HBsAg( 人乙肝表 面抗原 ) 基因片段。 0033 图 8 ： L。
18、AMP 与 PCR 扩增人乙肝表面抗原基因检出限比较， 图中 ： M ： DL2000 DNA marker ； 1-7 ： pMD18T-HBsAg 质粒拷贝数依次 106， 105， 104， 103， 102， 10、 5 拷贝 ； 8 ： 非转基因 山羊 ； 9 ： 水。 0034 图 9 ： LAMP 扩增人乙肝表面抗原基因检出限试验可视化结果， 图中 ： 1-7 ： pMD18T-HBsAg 质粒拷贝数依次 106， 105， 104， 103， 102， 10、 5 拷贝 ； 8 ： 非转基因山羊 ； 9 ： 水。 0035 图 10 ： LAMP 检测转人乙肝表面抗原基因转基因。
19、山羊， 图中 ： M ： DL2000 DNA marker ； 1-5 ： 转人乙肝表面抗原基因转基因山羊 ； 6 ： 阳性对照， pMD18T-HBsAg 质粒 ； 7 ： 阴 性对照， 非转基因山羊基因组 DNA ； 8 ： 水。 0036 图 11 ： LAMP 检测转人乙肝表面抗原基因转基因山羊可视化结果， 图中 ： 1-5 ： 转 人乙肝表面抗原基因转基因山羊 ； 6 ： 阳性对照， pMD18T-HBsAg 质粒 ； 7 ： 阴性对照， 非转基因 山羊基因组 DNA ； 8 ： 水。 0037 图12 ： LAMP扩增人乙肝表面抗原基因电泳图， 图中 ： M ： DL2000 D。
20、NA marker ； 1-15 ： 模板为人基因组 DNA ； 16 ： 模板为阳性对照质粒 ； 17 ： 模板为非转基因山羊基因组 DNA ； 18 ： 水。 0038 图 13 ： LAMP 扩增人乙肝表面抗原基因可视化结果， 图中 1-15 ： 模板为人基因组 DNA ； 16 ： 模板为阳性对照质粒 ； 17 ： 模板为非转基因山羊基因组 DNA ； 18 ： 水。 具体实施方式 0039 实施例 1 ： 对人乙肝表面抗原基因目的片段进行扩增 0040 1、 样品的获得 0041 1) 转人乙肝表面抗原 ( 简称 HBsAg) 转基因山羊基因组 DNA 的耳组织样品由中国 农业大学农。
21、业生物技术国家重点实验室提供。按照 TIANGEN 的血液、 细胞、 组织基因组 DNA 提取试剂盒及其说明书操作 ( 试剂盒购自天根生化科技 ( 北京 ) 有限公司 ) 进行提取转基 因山羊 DNA。 0042 2)人的血液样品(采自中国湖北省武汉市)， 用于提取基因组DNA， 构建阳性质粒， 说 明 书 CN 102952852 A 5 4/7 页 6 验证检出率。按照常规方法采集人血样， 采用报道的酚 - 氯仿抽提法 ( 参照萨姆布鲁克， 黄 培堂译 . 分子克隆实验指南 M. 科学出版社 . 北京 ： 2005 版方法 ) 抽提人基因组 DNA， 得 到人基因组 DNA。 0043 2。
22、. 常规 PCR 扩增 0044 用常规的 PCR 扩增方法 ( 萨姆布鲁克， 黄培堂译 . 分子克隆实验指南 M. 科学出 版社 . 北京 ： 2005) 以两条外引物即编号为 F3、 B3 的引物扩增人基因组 DNA 中人乙肝表面 抗原基因的目的片段 ( 其核苷酸序列见 SEQ ID NO ： 1 和图 1 所示， 序列全长 194bp)。同时 以非转基因山羊样品作为阴性对照。 0045 1) 反应体系 ： 上游引物 F3 0.2M， 下游引物 B3 0.2M， 1l PCR buffer， 1.5mM MgCl2， 75M dNTPs， 0.5UDNA 聚合酶， 人基因组 DNA 1L，。
23、 用双蒸水补齐至 10L。 0046 2) 反应程序 ： 0047 95， 5min ； 34 个循环 ： 95 1min， 58 1min， 72 20s ； 72， 5min。 0048 3) 结果判定 ： 取 2.5l 扩增产物， 加入 1l 上样缓冲液 ( 配方 ： 浓度为 40的 (v/v) 甘油， 60 (v/v)0.25MTris-HCl， 0.2 (w/v) 溴酚蓝 )， 混匀， 然后在 2的琼脂糖凝 胶中电泳 30min 后， 通过凝胶成像系统成像， 可见长度为 194bp 大小的扩增片段， 结果如图 2 所示。 0049 3、 LAMP 扩增 0050 以引物 FIP、 引。
24、物 BIP 的核苷酸序列为内引物， 以引物 F3、 引物 B3 所示的引物为外 引物对人基因组 DNA 进行恒温扩增， 同时以非转基因山羊基因组 DNA 作为阴性对照。 0051 1) 反应体系 ： 试剂组成如下 ： 1M 甜菜碱， 400M dNTPs， 2.5l 10Bst Buffer， Mg2+ 1mM， 6.4U BstDNA 聚合酶， 1l 模板， 外引物 F3 和 B3 各 0.2M， 内引物 FIP 和 BIP 各 1.6M， 补双蒸水至 25l。 0052 2) 反应程序 ： 将上述反应体系中除酶以外的所有试剂混匀置于 200l EP 管中， 于 95反应 5min， 立即冰。
25、浴 1-2min， 再加入 6.4U Bst DNA 聚合酶， 于 63反应 60min ； 然 后置 80下 5min 终止反应。 0053 3) 结果分析与判定 0054 琼脂糖凝胶电泳 ： 取 2.5l 扩增产物， 加入 1l 上样缓冲液 ( 配方 ： 40 (v/ v) 甘油， 60 (V/V)0.25MTris-HCl， 0.2 (w/v) 溴酚蓝 )， 混匀， 再于 2琼脂糖凝胶中电 泳 30min， 在凝胶系统下成像， 观察是否有阶梯型条带出现， 若有阶梯型条带则判定为含有 人乙肝表面抗原基因， 若没有阶梯型条带则判定不含有人乙肝表面抗原基因。 0055 荧光染料染色 ： SYB。
26、R Green I 荧光染料稀释 100 倍后作为工作液， 取 5l 的环 介导等温扩增产物， 再加 0.5lSYBR Green I 的工作液， 在日光下用肉眼观察结果。若加 入SYBR Green I工作液后， 扩增产物变为黄绿色， 则判定含有人乙肝表面抗原基因， 若加入 SYBR Green I 工作液后， 扩增产物为棕黄色则判定为不含有人乙肝表面抗原基因。 0056 结果判定 ： 在上述分析方法中， 在凝胶成相系统的紫外灯下， 模板为人基因组 DNA， 即含有人乙肝表面抗原基因时， 可以观察到阶梯型条带， 而模板为非转基因山羊基因 组 DNA 时， 则观察不到阶梯型条带， 其结果如图 。
27、3 所示。在上述分析步骤中， 当模板为人 的基因组 DNA， 即含有人乙肝表面抗原基因时， 扩增产物变为黄绿色， 当模板为非转基因山 羊基因组 DNA 时， 扩增产物为棕黄色， 其结果如 4 所示。 说 明 书 CN 102952852 A 6 5/7 页 7 0057 4)LAMP 扩增产物特异性检验 ： 对 LAMP 扩增产物进行酶切验证 0058 LAMP 扩增产物在电泳检测不是呈现一条带， 而是呈现出由多条带组成的阶梯型条 带， 这是因为这种方法在扩增过程中形成以目的片段， 连接在一起的长短不一的开环产物 所造成。 0059 本发明中人乙肝表面抗原基因目的片段 ( 其核苷酸序列见图 1。
28、 所示 ) 大小为 194bp， 在120bp处存在限制性内切酶HaeIII所识别的酶切位点， 在酶切位点处切开的产物 分别由图 5 中所示方框部分组成， 酶切后的两段长度应分别是 55bp 和 106bp。因此可使用 HaeIII 对 LAMP 扩增产物进行酶切， 验证 LAMP 扩增得到的阶梯型条带是否由人乙肝表面抗 原基因目的片段所组成， 0060 酶切反应体系 ： 取3lLAMP扩增产物， 加入0.8l限制性内切酶HaeIII(购自 Fermentas 公司 ) 和 1lbuffer， 双蒸水补至 10l。 0061 反应程序 ： 于 37恒温培养箱中酶切 6 小时。 0062 结果判。
29、定 ： 取 2.5l 扩增产物， 加入 1l 上样缓冲液 ( 配方 ： 浓度为 40 (v/ v) 甘油， 60 (v/v)0.25MTris-HCl， 0.2 (w/v) 溴酚蓝 )， 混匀， 再于 2琼脂糖凝胶中电 泳 30min， 在凝胶系统下成像， 观察到酶切以后的 LAMP 扩增产物不再有阶梯型条带， 结果如 图 6 所示。结果说明本发明中 LAMP 扩增所得到的产物是人乙肝表面抗原基因。 0063 实施例 2 ： 人乙肝表面抗原基因 LAMP 检测方法灵敏度试验 0064 用含目的基因的质粒pMD18T-HBsAg作模板， 验证基因LAMP检测方法的检出限， 并 与 PCR 方法的。
30、检出限作对比。具体步骤如下 ： 0065 1、 质粒 pMD18T-HBsAg 的构建 0066 1) 人乙肝表面抗原基因目的片段 PCR 产物的回收纯化 0067 用 PCR 方法以两条外引物即引物 F3( 其序列见 SEQ ID NO ： 4)、 引物 B3( 其序列见 SEQ ID NO ： 5) 扩增人基因组 DNA。反应体系 ： 上游引物 F3 0.2M， 下游引物 B3 0.2M， 1l PCR buffer， 1.5mMMgcl2， 75M dNTPs， 0.5U DNA 聚合酶， 人基因组 DNA 1L， 用双蒸 水补齐至 10L。反应程序 ： 95， 5min ； 34 个循。
31、环 ： 95 1min， 58 1min， 72 20s， 72， 5min。 0068 取 50L PCR 产物在 2琼脂糖凝胶中电泳 30min， 凝胶成相系统上成像。可以看 到 194bp 大小的片段， 结果如图 2 所示。将扩增的目的基因从琼脂糖凝胶上切下， 使用琼脂 糖凝胶回收试剂盒 ( 购自北京原平皓生物技术有限公司 ) 回收 DNA。 0069 2) 目的片段 PCR 产物与 pMD18-T 载体连接 ： 将回收产物与 pMD18-T 载体 ( 购自武 汉大风生物科技有限公司 ) 连接， 连接体系为 ： 0.5L pMD-18T 载体， 3.5L solution I， 3L 回。
32、收产物， 将上述试剂混匀后 4连接过夜。pMD18T-HbsAg 的结构图如图 7 所示。 0070 3) 连接产物的转化、 pMD18T-HBsAg 质粒的鉴定及提取 ： 取 5L 连接产物加 入 100L 大肠杆菌 DH5 感受态细胞中， 冰浴 30min， 42循环水中热击 90s， 快速冰浴 1-2min 使细胞冷却， 加入 500L LB 液体培养基， 37摇床上培育 45min， 在 4000rpm 离 心 5min， 弃去 500L 上清液， 将余下液体吹打均匀， 吸取 100L 涂布于含氨苄青霉素 (100g/ml) 的 LB 琼脂平皿上， 37培养 12h。用经高压蒸汽灭菌 。
33、(121， 灭菌 30min) 的 10L移液器头挑取菌落置于800L含氨苄青霉素(100g/ml)的LB液体培养基中， 37 摇床震荡培养 4h， 然后通过菌液 PCR 挑选阳性菌液， 然后送上海生工生物工程技术有限公 说 明 书 CN 102952852 A 7 6/7 页 8 司测序， 测序结果经比对确认以后， 用质粒小提试剂盒 ( 购自 TIANGEN 公司， 按照试剂盒的 说明书介绍的方法操作 ) 提取质粒， 并测定质粒浓度。 0071 4) 计算质粒拷贝数 0072 计算质粒拷贝数， 其公式为 ： 0073 (6.231023拷贝 /mol)( 浓度 g/ml) 碱基数 (660 。
34、道尔顿 / 碱基 ) 拷 贝数 /ml 0074 用双蒸水将质粒pMD18T-HBsAg进行倍比稀释， 使其终浓度为106拷贝/l， 105拷 贝 /l， 104拷贝 /l， 103拷贝 /l， 102拷贝 /l， 101拷贝 /l， 5 拷贝 /l。 0075 2、 LAMP 方法检测检出限试验 ： 0076 利用本实施例中所稀释好的质粒 pMD18T-HBsAg 为模板， 采用 LAMP 方法和 PCR 方 法进行检测的灵敏度试验。 0077 1)LAMP 方法扩增不同拷贝数的质粒 pMD18T-HbsAg 0078 以引物 FIP、 BIP 为内引物， 以引物 F3、 B3 为外引物对本。
35、实施例中步骤 1 得到的质 粒 pMD18T-HBsAg 进行 LAMP 扩增， 使体系中含质粒拷贝数依次为 ： 106个， 105个， 104个， 103 个， 102个， 10， 5 个。 0079 反应体系 ： 试剂组成如下 ： 1M 甜菜碱， 400M dNTPs， 2.5l 10Bst Buffer， Mg2+ 1mM， 6.4U Bst DNA聚合酶， 1l模板， 外引物F3和B3各0.2M， 内引物FIP和BIP各 1.6M， 补双蒸水至 25l。 0080 反应程序 ： 将上述反应体系中除酶以外的所有试剂混匀置于 200l EP 管中， 于 95反应 5min， 立即冰浴 1-。
36、2min， 再加入 6.4U Bst DNA 聚合酶， 于 63反应 60min ； 然 后置 80下 5min 终止反应。 0081 2)PCR 方法扩增不同拷贝数的质粒 pMD18T-HBsAg 0082 同时以两条外引物 F3、 B3 进行 PCR 扩增， 使体系中含质粒拷贝数依次为 ： 106个， 105个， 104个， 103个， 102个， 10 个， 5 个 . 0083 反应体系 ： 上游引物 F3 0.2M， 下游引物 B3 0.2M， 1l PCR buffer， 1.5mM Mgcl2， 75MdNTPs， 0.5U DNA 聚合酶， 人基因组 DNA 1L， 用双蒸水补。
37、齐至 10L。 0084 反应程序 ： 95， 5min ； 34 个循环 ： 95 1min， 58 1min， 72 20s ； 72， 5min。 0085 2) 结果分析 ： 0086 经琼脂糖凝胶电泳后得到结果 ： 当 pMD18T-HBsAg 质粒为 102个拷贝时， PCR 方法 能扩增出特异性条带， 当 pMD18T-HBsAg 质粒为 10 个拷贝时， PCR 方法未能扩增出特异性条 带， 因此判定 PCR 方法对 pMD18T-HBsAg 质粒的扩增下限为 102个拷贝 ； 当 pMD18T-HBsAg 质 粒为 10 个拷贝时， LAMP 方法能扩增出阶梯型条带， 而当 。
38、pMD18T-HBsAg 质粒为 5 个拷贝时， LAMP 方法未能扩增出阶梯型条带， 因此判定 LAMP 对 pMD18T-HBsAg 质粒的扩增下限为 10 个拷贝， PCR 与 LAMP 比较的结果如图 8 所示。LAMP 扩增产物中， 取 5l 加入 0.5lSYBR Green I工作液， 在日光下用肉眼观察结果， 结果 ： 质粒拷贝数依次为 ： 106个， 105个， 104个， 103个， 102个， 10 个时， 扩增产物变为黄绿色， 而质粒拷贝数为 5 时， 扩增产物则为棕黄色， 结果如图 9 所示。 0087 本实施例中， LAMP 方法灵敏度高， 采用本方法可以检测下限至。
39、 10 个拷贝的人乙肝 表面抗原目的基因， 是普通 PCR 灵敏度高 10 倍。 说 明 书 CN 102952852 A 8 7/7 页 9 0088 实施例 3 ： 对转人乙肝表面抗原基因的转基因山羊及人基因组 DNA 进行 LAMP 检测 0089 对 5 头转人乙肝表面抗原的转基因山羊 DNA 样品及 15 个人基因组 DNA 样品进行 LAMP 检测， 试验中所用转基因山羊的基因组 DNA 以及人的基因组 DNA 样品， 均稀释到 20ng/ l。 0090 1)LAMP 扩增过程 ： 0091 以 FIP、 BIP 为内引物， F3、 B3 为外引物对人乙肝表面抗原基因进行恒温扩增。
40、， 其反 应体系为 ： 1M甜菜碱， 400M dNTPs， 2.5l 10Bst Buffer， Mg2+ 1mM， 6.4U Bst DNA聚合 酶， 1l 模板， 外引物 F3 和 B3 各 0.2M， 内引物 FIP 和 BIP 各 1.6M， 补双蒸水至 25l， 将上述除酶以外的所有试剂混匀置于 200l EP 管中， 于 90反应 5min， 反应后立即冰浴 1-2min， 再加入 6.4U Bst DNA 聚合酶， 于 63反应 60min， 80下反应 5min 后终止反应 ； 0092 2) 结果分析 ： 0093 琼脂糖凝胶电泳 ： 取2.5l扩增产物， 加入1l上样缓冲。
41、液(40(v/v)甘油， 60(v/v)0.25M Tris-HCl， 0.2(w/v)溴酚蓝)， 混匀， 再于2琼脂糖凝胶中电泳30min， 得到凝胶成像， 观察是否有阶梯型条带， 若有阶梯型条带则含有人乙肝表面抗原基因， 若没 有阶梯型条带则不含人乙肝表面抗原基因。 0094 荧光染料染色 ： 将SYBR Green I荧光染料稀释100倍后作为工作液， 取5l的 环介导等温扩增产物， 再加 0.5lSYBR Green I 的工作液， 在日光下用肉眼观察结果。若 加入SYBR Green I工作液后， 扩增产物变为黄绿色， 则判定为含有人乙肝表面抗原基因， 若 加入 SYBR Green。
42、 I 工作液后， 扩增产物为棕黄色则判定为不含有人乙肝表面抗原基因。 0095 结果判定 ： 本实施例的 LAMP 检测方法检测出了转人乙肝表面抗原基因山羊的 人乙肝表面抗原基因成分， 如图10、 图11及人DNA样品中的人乙肝表面抗原基因成分， 如图 12、 图 13。 说 明 书 CN 102952852 A 9 1/2 页 10 0001 0002 序 列 表 CN 102952852 A 10 2/2 页 11 序 列 表 CN 102952852 A 11 1/4 页 12 图 1 图 2 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102952852 A 12 2/4 页 13 图 5 图 6 图 7 说 明 书 附 图 CN 102952852 A 13 3/4 页 14 图 8 图 9 图 10 图 11 说 明 书 附 图 CN 102952852 A 14 4/4 页 15 图 12 图 13 说 明 书 附 图 CN 102952852 A 15 。