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1、(10)申请公布号 CN 102899328 A (43)申请公布日 2013.01.30 CN 102899328 A *CN102899328A* (21)申请号 201210374619.X (22)申请日 2012.09.28 C12N 15/12(2006.01) C12N 15/79(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12N 5/10(2006.01) A01K 67/027(2006.01) C12R 1/19(2006.01) C12R 1/91(2006.01) (71)申请人 南京农业大学 地址 210095 江苏省南京市玄武区卫岗 1 号 (72)。
2、发明人 庾庆华 朱立麒 杨倩 林建 (74)专利代理机构 南京天华专利代理有限责任 公司 32218 代理人 徐冬涛 傅婷婷 (54) 发明名称 山羊葡萄糖转运载体 4 基因及其重组表达载 体和应用 (57) 摘要 本发明属于基因工程领域， 涉及山羊葡萄糖 转运载体 4 基因及其重组表达载体和应用。葡萄 糖转运载体基因 GLUT1， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO.1 所示。含有本发明所述的 GLUT4 基因的真核 表达载体 pCDNA3.1-GLUT4。本发明葡萄糖转运载 体基因可以提高山羊乳腺上皮细胞的葡萄糖的吸 收和乳糖的合成。因此可在提高哺乳动物乳腺细 胞葡萄糖吸收和 / 或乳糖合。
3、成中应用。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 6 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 6 页 附图 3 页 1/1 页 2 1. 一种葡萄糖转运载体基因 GLUT1， 其特征在于其核苷酸序列如 SEQ ID NO.1 所示。 2. 根据权利要求 1 所述的基因 GLUT4， 其特征在于该基因的编码序列如序列表 SEQID NO.1 中第 144-1673 位所示核昔酸。 3. 含有权利要求 1 所述的 GLUT4 基因的真核表达载体 pCDNA3.1-GLUT4。 4.含有权。
4、利要求3所述的真核表达载体pCDNA3.1-GLUT4的大肠杆菌(E.coli)受体细 胞 JM109/pCDNA3.1-GLUT4。 5. 权利要求 3 所述真核表达载体 pCDNA3.1-GLUT4 稳定转染的山羊乳腺上皮细胞株 GMGE/pCDNA3.1-GLUT4。 6.权利要求1所述的葡萄糖转运载体基因GLUT4在提高哺乳动物乳腺细胞葡萄糖吸收 和 / 或乳糖合成中的应用。 7. 权利要求 3 所述的真核表达载体 pCDNA3.1-GLUT4 在提高哺乳动物乳腺细胞葡萄糖 吸收和 / 或乳糖合成中的应用。 权 利 要 求 书 CN 102899328 A 2 1/5 页 3 山羊葡萄。
5、糖转运载体 4 基因及其重组表达载体和应用 技术领域 0001 本发明属于基因工程领域， 涉及山羊葡萄糖转运载体 4 基因及其重组表达载体和 应用。 背景技术 0002 葡萄糖是一种极性分子， 需要借助于胞膜上的运载蛋白进入细胞内。在哺乳类细 胞内有两类葡萄糖转运载体 ： Na+葡萄糖协同转运蛋白和易化葡萄糖转运蛋白 (Glut)。参 与人体葡萄糖转运的主要的是易化葡萄糖转运蛋白。至今在哺乳类动物体内已发现 13 种 Glut， 其中 Glut4 是一个主要的研究热点。 0003 由于葡萄糖是乳腺上皮细胞合成乳糖的主要前体， 所以给泌乳动物的乳腺提供葡 萄糖是新陈代谢的重点。因为乳糖维持着乳的。
6、渗透压， 所以乳糖合成速率是影响产奶量的 主要原因。 另外， 葡萄糖除了是重要的乳糖合成前体， 还可以产生ATP、 尼克酰胺腺嘌呤二核 苷酸磷酸， 也是合成蛋白质、 脂肪和核苷酸的前体。一头泌乳牛每产 1kg 牛奶需要 72g 葡萄 糖。因此， 一头日产奶量 40kg 的奶牛， 它的乳腺每天需要摄入 3kg 的葡萄糖。事实如此， 乳 腺摄入的葡萄糖是血糖总量的 60 85。 0004 Glut4 是胰岛素依赖型蛋白， 主要存在于胰岛素敏感的组织中 ： 骨骼肌， 心肌和脂 肪组织， Glut4 是这些组织中的主要的葡萄糖运载体。近年来由于葡萄糖钳夹技术的应用， 已经证实细胞外膜上葡萄糖载体的含量。
7、与细胞葡萄糖最大转运能力呈正相关关系， 葡萄糖 跨膜转运是骨骼肌利用葡萄糖的主要限速过程。基础状态和胰岛素刺激状态下， 葡萄糖利 用分别占全身的 20和 70 85。Glut4 在促进葡萄糖的吸收和利用上起了关键限速 的作用。尤其是在胰岛素状态下， Glut4 起决定性作用。 0005 通过增加细胞 GLUT4 的表达， 可以达到促进细胞吸收葡萄糖， 增加细胞能量代谢 和合成代谢的目的。 0006 本发明提供了山羊葡萄糖转运载体 4 基因 GLUT4 序列及其相应的氨基酸序列。提 供了含有山羊葡萄糖转运载体 4 基因的真核表达载体 pCDNA3.1-GLUT4 和含有这种载体 的大肠杆菌 (E。
8、.coli) 细胞 JMI09/pCDNA3.1-GLUT4 以及稳定转染的山羊乳腺上皮细胞株 GMGE/pCDNA3.1-GLUT4。利用本发明成果， 可以用于构建转基因整合载体， 提高山羊乳腺对 葡萄糖的摄取能力， 增加产奶量。 发明内容 0007 本发明的目的在于针对现有技术的上述不足， 提供一种山羊葡萄糖转运载体 4 基 因。 0008 本发明的另一目的是提供含有该基因的重组表达载体。 0009 本发明的又一目的是提供该基因的应用。 0010 本发明的目的可通过如下技术方案实现 ： 0011 一种葡萄糖转运载体基因 GLUT1， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO.1 所示。 说 明 。
9、书 CN 102899328 A 3 2/5 页 4 0012 所述的基因 GLUT4， 该基因的编码序列如序列表 SEQ ID NO ： 1 中第 144-1673 位所 示核昔酸。 0013 含有本发明所述的 GLUT4 基因的真核表达载体 pCDNA3.1-GLUT4。 0014 含有真核表达载体 pCDNA3.1-GLUT4 的大肠杆菌 (E.coli) 受体细胞 JM109/ pCDNA3.1-GLUT4。 0015 本发明所述真核表达载体 pCDNA3.1-GLUT4 稳定转染的山羊乳腺上皮细胞株 GMGE/pCDNA3.1-GLUT4。 0016 本发明所述的葡萄糖转运载体基因 。
10、GLUT4 在提高哺乳动物乳腺细胞葡萄糖吸收 和 / 或乳糖合成中的应用。 0017 本发明所述的真核表达载体 pCDNA3.1-GLUT4 在提高哺乳动物乳腺细胞葡萄糖吸 收和 / 或乳糖合成中的应用。 0018 有益效果 0019 葡萄糖转运载体基因可以提高山羊乳腺上皮细胞的葡萄糖的吸收和乳糖的 合成。体外转染山羊乳腺上皮细胞的荧光定量 PCR 结果显示， 稳定转染组 （只转染 pCDNA3.1-GLUT4）的 GLUT4 表达量高于对照组 （正常培养的山羊乳腺上皮细胞）接近 55 倍。通过测定培养 24h 和 48h 的培养基中葡萄糖的含量， 24h 转染组葡萄糖的吸收量 达到 1.99。
11、00.0141g/g 蛋白， 显著高于对照组的 1.7710.00346g/g 蛋白 ； 48h 转染组葡萄糖的吸收量达到 9.2870.278g/g 蛋白， 极显著的高于对照组细胞 （1.990.014g/g 蛋白） 。48h 转染组乳糖合成量达到 178.67932.968ng/g 蛋白显 著高于对照组细胞 (49.9264.192ng/g 蛋白 )。 附图说明 0020 图 1 ： 真核表达载体 pCDNA3.1-GLUT4 的质粒图谱 0021 图 2 ： GLUT4 基因的克隆图片 0022 图 3 ： NheI/HindIII 双酶切 pCDNA3.1-GLUT4 鉴定图 0023。
12、 图 4 ： 转染 GLUT4 基因的山羊乳腺上皮细胞 GLUT4 基因相对表达量 0024 图 5 ： 转染 GLUT4 基因的山羊乳腺上皮细胞对葡萄糖吸收的变化 0025 图 6 ： 转染 GLUT4 基因的山羊乳腺上皮细胞乳糖合成量的变化 具体实施方式 0026 下述实施例中所用方法如无特别说明， 均为常规方法。 0027 具体涉及的材料和试剂如下 ： 0028 羊肌肉组织来自于无感染病史的萨能奶山羊 （购自南京溧水种山羊养殖场） ， 将组 织于液氮冷冻， 骨架载体 pCDNA3.1（+） （Company ： Invitrogen ； Catalog Number ： V79020 ；。
13、 Product ： pCDNA3.1（+） Vector） ； 山羊乳腺上皮细胞 （实验室分离） ； E.coli JM109（购自大 连宝生物， Takara） 。 0029 试 剂 TRizol， MLV- 反 转 录 酶， rTaq 酶， pMD19-T 载 体， Agarose Gel DNA Purification Kit， TaKaRa DNA Ligation Kit 内切酶 Xho I， Not I， KpnI， Cla I 等 均 购 自 TAKARA 公司 ； OMEGA 无内毒素质粒提取试剂盒购自 OMEGA 公司 ； 脂质 体 说 明 书 CN 102899328 。
14、A 4 3/5 页 5 Lipofectamine2000， 胎牛血清购自 Invitrogen 公司 ； DMEM/F12 培养基 （货号 ： C12430） 购自 Gibco 公司 ； 青链双抗 （购自碧云天） ； 胰岛素、 催乳素、 氢化可的松 （购自南京生 兴生物有限公司） ； 进口葡萄糖检测试剂盒 （Company ： Biovisin Catalog Number ： K606-100Product ： Glucose Assay Kit）乳糖检测试剂盒 （Company ： Biovisin Catalog Number ： K624-100Product ： Lactose A。
15、ssay Kit） ， 其他试剂均为国产或进口分析纯级。 0030 实施例 1 载体 pCDNA3.1-GLUT4 的构建及酶切验证 0031 1.1GLUT4 基因的克隆 0032 首先匀浆器匀浆肌肉组织样品， 然后 TRizol 法提取总 RNA。以萨能奶山羊肌肉织 的总 RNA 为模板， 以 oligod （T） 18 引物采用 invirtrogen 公司的 M-MLV 反转录酶合成 cDNA 第一链。 0033 引物设计和合成 ： 参照 NCBI 上的牛 GLUT4 基因全序列 （Bos taurus solute carrier family2(facilitated glucos。
16、e transporter),member4(SLC2A4),mRNA） 登录号 ： NM174604。用 DNASTAR 做限制性内切酶分析， 用 primer5.0 设计引物扩增 GLUT4 基因的 CDS 区。 0034 引物设计如下 ： GLUT4 引物 0035 上游引物 GLUT4-F ： 5-TCTCGCCAGACTCGCACTC-3（SEQ ID NO.3） ； 0036 下游引物 GLUT4-R ： 5-TGCTCAGACCACCGTTCCCT-3（SEQ ID NO.4） 0037 反应条件为 ： 94预变性5min ； 94变性30s， 55复性30s， 72延伸2min。
17、， 共30 个循环 ； 然后 72延伸 10min， 4终止。 0038 1.2 将 GLUT4 基因克隆到 pMD19-T 载体上 0039 将 PCR 扩增的目的条带经胶回收纯化后， 与 pMD19-T 载体连接得到质粒 pMD19-T-GLUT4， 转化 E.coli JM109 感受态， 挑取菌落做菌落 PCR 鉴定筛选阳性克隆 ； 筛选 出阳性克隆， 提质粒 pMD19-T-GLUT4， 酶切、 PCR 鉴定， 送交上海生工测序。测序结果生物信 息学分析显示 ： 1837bp 的序列包含了 GLUT4 中的 CDS 部分。 0040 1.3 将 GLUT4 插入到骨架载体 pCDNA。
18、3.1（+） 的 Nhe 和 HindIII 之间 0041 GLUT4 基因酶切连接引物 0042 上游引物 F ： 5-GCTAGCATGCCGTCGGGCTTCCAACA-3（SEQ ID NO.5） 0043 下游引物 R ： 5-AAGCTTTCAGTCATTCTCATCCGGCCCT-3（SEQ ID NO.6） 0044 提取步骤 1.3 中含有质粒 pMD19-T-GLUT4 的大肠杆菌的质粒， 使用 Nhe 和 HindIII 内切酶分别酶切质粒 pMD19-T-GLUT4 和 pCDNA3.1（+） 。经切胶回收后， 将 GLUT4 片段与骨架载体 pCDNA3.1（+） 。
19、用 T4 连接酶相连接， 如 （图 2） 。 0045 1.4 重组质粒 pCDNA3.1-GLUT4 的鉴定 0046 用克隆 GLUT4 基因 CDS 区的引物分别进行 PCR 扩增检验。同时使用内切酶 Nhe 和 HindIII 对质粒进行酶切鉴定。由图可知载体 pCDNA3.1-GLUT4 经 Nhe 和 HindIII 酶 切后， 切出大小 1539p 和 5428bp 的片段， 与预期结果一致 （图 3） 。同时进行 PCR 验证。以上 鉴定证实 pCDNA3.1-GLUT4 载体构建成功。 0047 1.5 转染质粒 pCDNA3.1-GLUT4 的提取和纯化 0048 将重组质。
20、粒 pCDNA3.1-GLUT4 用 OMIGA 无内毒素质粒提取试剂盒提取和纯化质 粒， -20保存， 用于细胞转染。 说 明 书 CN 102899328 A 5 4/5 页 6 0049 实施例 2. 山羊乳腺上皮细胞的分离和培养 0050 （1） 准备材料 ： 高压后的眼科剪刀 （一大一小） ， 刮毛刀， 镊子各两把， 小的术齿镊一 把， 无菌培养皿 2 个， 小青瓶两个。2% 的碘酊 1 瓶， 75% 的酒精 1 瓶 , 加双抗的 PBS 两瓶。 DMEM/F12 培养基， 添加 15% 的胎牛血清， EGF10ng/ml， 200ug/ml 的双抗。 0051 （2） 实验步骤 ：。
21、 0052 、 取材 ： 选取两个月左右的小羊， 尽量挑选耳组织上血管组织较少的部位用刮毛 刀刮毛， 先用 2的碘酊棉球擦拭要切取部位， 1 分钟后用 75的酒精擦拭， 用高压消毒后 的眼科剪刀， 剪取 1cm2左右的耳部组织， 放人含 250u/ml 的青链双抗的 PBS 中， 4 度浸泡， 立 即带回实验室 （四小时之内） 。 0053 、 处理 ： 将样品移入超净台中， 将山羊的皮肤置于无菌培养皿中， 用含 500IUmL-1 双抗的 PBS 洗涤 2 次， 剪除毛茬， 轻轻刮去表皮组织和皮下组织， 保留真皮层， 将剩余组织在 70乙醇中浸泡 30s， 再含 200ug/ml 的双抗 P。
22、BS 洗涤组织 3 5 次， 然后剪 成 1mm3大小的组织块， 移入组织培养瓶的底壁上， 用吸管将组织块均匀地铺开， 小心翻转培 养瓶， 置于 37 度、 5 CO2培养箱中静置 4 6h。在组织块周围开始变干以前加入 DMEM 培 养液， 浸没组织块， 过夜， 第 2 天补加入 2 3mL DMEM 培养液， 每隔 2 3d 观察并换液。原 代细胞采用DMEM添加15胎牛血清进行贴壁培养， 细胞长成致密单层后， 用0.25胰酶消 化， 待大部分细胞变圆时， 加培养液终止消化， 并反复吹打。因为成纤维细胞消化脱壁比上 皮细胞快， 在前 3 代传代经酶消化， 待细胞刚变圆即终止消化， 只收集脱。
23、壁细胞， 这样便可 得到纯化的成纤维细胞。当细胞生长至 70 80汇合状态时即可冷冻保存， 以备细胞特 性分析以及基因转染使用。 0054 实施例 3. 山羊乳腺上皮细胞的转染及稳定转染细胞株的筛选 0055 将山羊乳腺上皮细胞接种于 60mm 孔培养板中， 每个板用 5ml 培养基进行培养， 转染前 1d， 待细胞铺满培养皿底的 70% 80% 时， 改用无血清、 无抗生素的 DMEM/F12 培 养基洗涤细胞 2 次， 用不含血清的 DMEM/F12 培养基培养 24 小时后转染。次日转染按 Lipofectamine2000 说明书进行转染， 脂质体 （uL） 与质粒 （ug） 的比例为。
24、 3 2。细胞培养 6h 后弃去混合液， 加入体积分数 10% 胎牛血清、 不含抗生素的 DMEM/F12 培养基继续培养。 第 2 天， 想培养基中加入 700g/ml 的 G418 药物， 筛选 14 天。挑去单克隆汇集到 24 孔培 养板中， 将 G418 的浓度降至 400g/ml， 继续培养和传代， 直至 6 孔培养板。 0056 乳腺上皮细胞的转染效率比较低， 瞬时转染后检测葡萄糖和乳糖的变化不明显， 并且受转染时细胞状态的影响较大。 所以我们筛选了稳定转染的山羊乳腺上皮细胞用于检 测培养上清中葡萄糖和乳糖的变化。 0057 实施例 4pCDNA3.1-GLUT4 稳定转染的山羊乳。
25、腺上皮细胞 GLUT4 基因的表达检测 0058 细胞诱导表达及样品处理 ： 山羊乳腺上皮细胞和 pCDNA3.1-GLUT4 稳定转染的山 羊乳腺上皮细胞分别大量繁殖后， 以 1105的密度接种 6 孔培养板， 分别培养， 在细胞涨 至 50% 时加诱导培养基。诱导培养基成分 ： DMEM+10% 胎牛血清、 胰岛素 （10g/mL） 、 催乳 素 （1g/mL） 、 氢化可的松 （20g/mL） 和 1% 青链双抗。在诱导后 4 天， 用 TRizol 提取每孔 细胞的总 RNA， 用 MLV- 反转录酶反转录成 cDNA， 进行荧光定量 PCR 检测 GLUT4 基因表达量 的变化， 使。
26、用的荧光定量 PCR 仪为 ABI7500， 使用的试剂为 TAKARA 公司的 SYBR Premix Ex Taq II(TlRNaseH Plus)。荧光定量 PCR 结果显示， 稳定转染组 （只转染 pCDNA3.1-GLUT4） 说 明 书 CN 102899328 A 6 5/5 页 7 的 GLUT4 表达量高于对照组 （正常培养的山羊乳腺上皮细胞） 接近 55 倍 （图 4） 。 0059 实施例 5. 稳定转染的山羊乳腺上皮细胞培养液中葡萄糖吸收和乳糖合成的检测 0060 细胞诱导表达及样品处理 ： 山羊乳腺上皮细胞和 pCDNA3.1-GLUT4 稳定转染的山 羊乳腺上皮细。
27、胞分别大量繁殖后， 以 1105的密度接种 6 孔培养板， 分别培养， 在细胞涨 至 50% 时加诱导培养基。诱导培养基成分 ： DMEM+10% 胎牛血清、 胰岛素 （10g/mL） 、 催乳素 （1g/mL） 、 氢化可的松 （20g/mL） 和 1% 青链双抗。在诱导后 4 天更换新鲜培养基， 并在之 后的 24h 和 48h 分别收细胞培养液上清和细胞蛋白， 使用葡萄糖检测试剂盒和乳糖检测试 剂盒分别检测培养液上清中的葡萄糖含量和乳糖含量 ； 测定细胞蛋白用于矫正细胞数量。 0061 结 果 显 示， 24h 转 染 组 葡 萄 糖 的 吸 收 量 达 到 1.9900.0141g/g。
28、 蛋 白， 显著高于对照组的 1.7710.00346g/g 蛋白 ； 48h 转染组葡萄糖的吸收量达到 9.2870.278g/g 蛋白， 极显著的高于对照组细胞 （1.99+0.014g/g 蛋白） （图 5） 。而 48h 转染组乳糖合成量达到 178.67932.968ng/g 蛋白显著高于对照组细胞 (49.9264.192ng/g 蛋白 )（图 6） 。 说 明 书 CN 102899328 A 7 1/6 页 8 0001 0002 序 列 表 CN 102899328 A 8 2/6 页 9 0003 序 列 表 CN 102899328 A 9 3/6 页 10 0004 序 列 表 CN 102899328 A 10 4/6 页 11 0005 序 列 表 CN 102899328 A 11 5/6 页 12 0006 序 列 表 CN 102899328 A 12 6/6 页 13 序 列 表 CN 102899328 A 13 1/3 页 14 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102899328 A 14 2/3 页 15 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102899328 A 15 3/3 页 16 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 102899328 A 16 。