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1、(10)申请公布号 CN 102911929 A (43)申请公布日 2013.02.06 CN 102911929 A *CN102911929A* (21)申请号 201210392005.4 (22)申请日 2012.10.16 C12N 15/09(2006.01) C12N 15/87(2006.01) C12N 5/04(2006.01) (71)申请人 福建农林大学 地址 350002 福建省福州市仓山区建新镇金 山学区 (72)发明人 高三基 米尔科夫艾瑞克 陈如凯 林艺华 付为林 傅华英 陈永武 (74)专利代理机构 福州元创专利商标代理有限 公司 35100 代理人 蔡学俊。
2、 (54) 发明名称 一种甘蔗转基因瞬时表达叶片受体材料的制 备方法 (57) 摘要 本发明涉及一种甘蔗转基因瞬时表达叶片受 体材料的制备方法， 包括甘蔗叶片外植体田间采 样、 甘蔗叶片外植体表面消毒、 甘蔗叶片外植体制 备和甘蔗叶片外植体预培养。本发明的方法取代 了传统的甘蔗愈伤组织为外植体， 建立了快速、 高 效、 简便的甘蔗叶片受体材料制备技术， 可广泛应 用于高通量的外源基因表达、 启动子活性分析、 基 因沉默等方面的甘蔗转基因瞬时表达研究。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书。
3、 1 页 说明书 4 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一种甘蔗转基因瞬时表达叶片受体材料的制备方法， 其特征在于操作步骤如下 ： （1） 甘蔗叶片外植体田间采样 ： 取生长正常且无病虫害的甘蔗植株梢部， 去除老叶和生 长出来的上部叶片 ； （2） 甘蔗叶片外植体表面消毒 ： 去除梢部叶片和蔗茎， 留 20-30 厘米长的叶片组织， 用 体积比 75% 酒精溶液消毒后， 移入无菌的超净工作台 ； （3） 甘蔗叶片外植体制备 ： 剥去 -1 和 -2 叶及以外的叶片， 取 -3 和 -4 嫩叶， 去除中脉 后将基部幼嫩叶片切成 2 厘米 2 厘米的小方块， 平铺于的 MS0.6 固体培养基。
4、上， 上表面朝 下 ； 所述MS0.6固体培养基为 ： 改良MS+0.5 g/L水解酪蛋白+0.6 mg/L 2,4-D+30 g/L蔗糖 +6.0 g/L 琼脂粉 ； 所述改良 MS 培养基的配方如表 1 所示 ； 表 1 改良 MS 培养基配方 （4） 甘蔗叶片外植体预培养 ： 小方块幼嫩叶片在 28 条件下暗培养 3-5 天后， 即可作 为甘蔗转基因瞬时表达叶片受体材料。 2. 由权利要求 1 的方法制备的甘蔗转基因瞬时表达叶片受体材料， 在甘蔗外源基因表 达、 启动子分析、 基因沉默研究中的应用。 权 利 要 求 书 CN 102911929 A 2 1/4 页 3 一种甘蔗转基因瞬时。
5、表达叶片受体材料的制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种植物转基因受体材料的制备方法， 具体涉及一种甘蔗转基因瞬时 表达叶片受体材料的制备方法。 背景技术 0002 转基因研究是植物基因功能鉴定的一种重要途径， 通常以烟草或拟南芥为模式植 物。烟草或拟南芥转基因稳定表达研究技术已趋成熟， 近年来， 农杆菌 (Agroinfilration) 介导的瞬时表达系统广泛地应用在本生烟 （Nicotiana benthamian） 及其转基因系 16C 上。 通过农杆菌混合注射将报告基因和 RNA 沉默抑制子导入本生烟或 16C 的植株叶片细胞， 分 析报告基因的表达情况， 从而鉴定出植物病毒编。
6、码的 RNA 沉默抑制子活性。 0003 甘蔗是一种单子叶禾本科糖料作物， 与转基因模式植物或其它作物 （如水稻、 玉 米） 相比， 转基因研究相对落后， 这是由于甘蔗转基因稳定表达研究存在遗传转化效率低、 周期长、 成本高的缺点， 且受甘蔗不同品种基因型的限制。 瞬时表达研究是解析基因功能的 一种重要辅助手段。至今， 开展甘蔗转基因瞬时表达主要以愈伤组织为受体材料， 但是， 愈 伤组织材料的准备需要 1-2 个月， 时间长， 效率低， 成本高。甘蔗叶片组织是一种开展转基 因瞬时表达研究的理想外植体， 不受季节限制， 制备简便， 叶片表面平坦， 便于报告基因表 达情况的观察， 且不受品种基因型。
7、的影响。 本发明采用甘蔗新叶基部幼嫩叶片， 经过暗培养 后即可作为外源基因表达、 启动子分析、 基因沉默等转基因瞬时表达研究的受体材料。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一种甘蔗转基因瞬时表达叶片受体材料的制备方法。 本发明 的方法提供了一种快速、 高效、 简便的甘蔗转基因瞬时表达研究所需的受体材料的制备方 法， 克服现有以甘蔗愈伤组织为受体材料的转基因瞬时表达研究体系存在的时间长， 效率 低， 成本高的问题。 0005 本发明的目的是通过以下方法实现的。 0006 本发明的一种甘蔗转基因瞬时表达叶片受体材料的制备方法， 包括甘蔗叶片外植 体田间采样、 甘蔗叶片外植体表面消毒、 甘蔗叶片。
8、外植体制备和甘蔗叶片外植体预培养 ； 其 特征在于操作步骤如下 ： 1、 甘蔗叶片外植体田间采样取生长正常且无病虫害的甘蔗植株梢部， 去除老叶和生长 出来的上部叶片 ； 2、 甘蔗叶片外植体表面消毒进一步去除梢部叶片和蔗茎， 留 20-30 厘米长的叶片组 织， 用体积比 75% 酒精溶液消毒后， 移入无菌的超净工作台 ； 3、 甘蔗叶片外植体制备剥去 -1 和 -2 叶及以外的叶片， 取 -3 和 -4 嫩叶， 去除中脉后将 基部幼嫩叶片切成 2 厘米 2 厘米的小方块， 平铺于的 MS0.6 固体培养基上， 上表面朝下 ； 所述MS0.6固体培养基为 ： 改良MS+0.5 g/L水解酪蛋白。
9、+0.6 mg/L 2,4-D+30 g/L蔗糖+6.0 g/L 琼脂粉 ； 所述改良 MS 培养基的配方如表 1 所示 ； 所述 -1、 -2、 -3 和 -4 叶为甘蔗植株最 说 明 书 CN 102911929 A 3 2/4 页 4 高可见肥厚带叶之上依次未完全展开的第 1、 2、 3、 4 叶 ； 表 1 改良 MS 培养基配方 ： 4、 甘蔗叶片外植体预培养 小方块幼嫩叶片在 28 条件下暗培养 3-5 天后， 即可作为甘蔗转基因瞬时表达叶片 受体材料。 0007 本发明还保护由上述方法制备的甘蔗转基因瞬时表达叶片受体材料， 在甘蔗外源 基因表达、 启动子分析、 基因沉默研究中的应。
10、用。 0008 本发明使用的所有化学试剂为分析纯。 0009 本发明的优点是， 能够短时间内快速制备大量的适合于基因枪轰击的外植体， 甘 蔗嫩叶组织生理状态较为一致、 表面平整， 为甘蔗外源基因表达、 启动子活性分析、 基因沉 说 明 书 CN 102911929 A 4 3/4 页 5 默等转基因瞬时表达研究提供理想的实验材料。 附图说明 0010 图 1 是 pPr4-GUS-Nos（Pr4 是启动子） 质粒转化后， GUS 基因在甘蔗叶片上的瞬时 表达。 0011 图 2 是 pUbi-GUS-Nos（Ubi 是启动子） 质粒转化后， GUS 基因在甘蔗叶片上的瞬时 表达。 0012 图。
11、 3 是 p35S-GUS-Nos（35S 是启动子） 质粒转化后， GUS 基因在甘蔗叶片上的瞬时 表达。 0013 图 4 是 pUbi-EYFP-Nos 和 pUbi-P19-Nos （P19 是番茄丛矮病毒编码的 RNA 沉默抑 制子） 质粒转化后， EYFP 基因在甘蔗叶片上的瞬时表达， 标尺为 0.5 mm。 0014 图 5 是 pUbi-EYFP-Nos 和 pUbi-b-Nos （b 是大麦条纹花叶病毒编码的 RNA 沉 默抑制子） 质粒转化后， EYFP 基因在甘蔗叶片上的瞬时表达， 标尺为 0.5 mm。 0015 图 6 是 pUbi-EYFP-Nos 和 pUbi-N。
12、os （不含任何沉默抑制子的空载体） 质粒转化后， EYFP 基因在甘蔗叶片上的瞬时表达， 标尺为 0.5 mm。 具体实施方式 0016 为了进一步阐明本发明而不是限制本发明， 以下结合实施例加以说明。 0017 实施例一 ： 以甘蔗品种 CP72-1210 植株叶片为受体材料， 以 GUS 为报告基因， 研究 不同启动子的活性。 0018 1、 外源基因瞬时表达 1.1 钨粉准备 ： 1.1.1 称取 30 mg 钨粉 （1.1 m， Bio-Rad 公司） 放入灭菌过的 1.5 mL Eppendorf 管 中。 0019 1.1.2 加入 500 L 的无水乙醇。 0020 1.1.3。
13、 在涡旋仪上蜗旋 1 min， 然后 8000 g 离心 1 min。 0021 1.1.4 除无水乙醇上清液。 0022 1.1.5 重复 1.1.2 至 1.1.4 步骤。 0023 1.1.6 加入 500 L 无菌水， 清洗 2 次。 0024 1.1.7 加入 500 L 无菌水， 钨粉溶液终浓度为 60 ng/L。 0025 1.2 外源基因 DNA 包被 （每个试验处理按 10 次的轰击量计算） 1.2.1 吸取 83.3 L 含有钨粉溶液放入灭菌过的 1.5 mL Eppendorf 管中。 0026 1.2.2 在涡旋仪上涡旋， 保持振荡的同时依次迅速加入 （按处理 10 个。
14、样品的用 量） ： 20L pUbi-GUS-Nos 或 pPr4-GUS-Nos 或 p35S-GUS-Nos 质粒 DNA （1 g/l） ， 50 L 2.5M 的 CaCl2， 20 L 0.1M 的亚精胺。 0027 1.2.3 将混合物振荡涡旋 1 min， 然后冰浴静置 5 min， 弃上清。 0028 1.2.4 用 800L 的无水乙醇漂洗沉淀 2 次， 弃上清。 0029 1.2.5 最后加入 140 L 的无水乙醇重新悬浮颗粒， 混匀备用。 0030 1.3 基因枪 （Bio-Rad） 轰击 说 明 书 CN 102911929 A 5 4/4 页 6 将本发明的甘蔗转基。
15、因瞬时表达叶片受体材料， 暗培养 3-5 天后的小方块幼嫩叶片转 移到新鲜的 MS0.6 固体培养基。吸取 10 L 已包被好质粒的钨粉乙醇混合液涂膜于微粒 载片， 利用高压氦气将质粒导入甘蔗幼嫩叶片细胞。 轰击参数为氦气压力1300 psi， 轰击距 离 6 cm。 0031 1.4 GUS 组织化学染色 转导后的甘蔗幼嫩叶片在28 条件下暗培养24 h后， 浸泡于事先配制好的X-Gluc染 色液中， 于 37 保温 24 h。用体积比为 70% 乙醇脱色后在显微镜下 （15 倍） 观察并拍照保 存。如图 1、 图 2、 图 3 所示， 根据显微镜视野内 GUS 表达量和表达强度， 可定性或。
16、定量评价 不同启动子的活性， 表现为启动子活性高低依次为 Pr4、 Ubi、 35S， 可见视野下 GUS 表达数量 平均分别为 250、 63、 4 个。 0032 所述 X-Gluc 染色液 ： 含 5- 溴 -4 氯 -3- 吲哚葡萄糖苷 （X-Gluc） 1.0 mg/mL， Triton-100 0.1%（V/V） ， 0.1 mol/L 磷酸缓冲液 pH 7.2。 0033 实施例二 ： 以甘蔗品种CP72-1210植株叶片为受体材料， 以EYFP为报告基因， 研究 不同植物编码的 RNA 沉默抑制子 （P19、 b） 的活性。 0034 1、 外源基因瞬时表达 1.1 钨粉准备 。
17、（方法如实施例一的钨粉准备） ； 1.2 外源基因 DNA 包被 （方法如实施例一的外源基因 DNA 包被） ； 1.3 基因枪 （Bio-Rad） 轰击 ： 将本发明的甘蔗转基因瞬时表达叶片受体材料， 暗培养 3-5 天后的小方块幼嫩叶片转 移到新鲜的 MS0.6 固体培养基。吸取 10 L 已包被好质粒的钨粉乙醇混合液涂膜于微粒 载片， 利用高压氦气将质粒导入甘蔗幼嫩叶片细胞。 轰击参数为氦气压力1300 psi， 轰击距 离 6 cm。 0035 1.4 EYFP 荧光表达分析。 0036 转导后的甘蔗新叶 28 下暗培养， 每隔 12 小时在荧光显微镜下 （YFP 荧光滤片） （10 倍） 观察并拍照保存。采用 ImageJ 软件 （http:/rsbweb.nih.gov/ij/） 计算 EYFP 荧光 表达量和表达强度， 如图 4、 图 5、 图 6 所示， 可定性评价不同 RNA 沉默抑制子的活性， 表现为 P19 和 b 平均分别提高外源基因 EYFP 荧光表达量 57.4%、 37.6%， 提高表达强度 1.8、 1.2 倍。 说 明 书 CN 102911929 A 6 1/1 页 7 图 1图 2 图 3 图 4 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 102911929 A 7 。