双环醇谷胱甘肽缀合物及其制备方法与应用.pdf

摘要
申请专利号：	CN201210378755.6	申请日：	2012.10.09
公开号：	CN102911251A	公开日：	2013.02.06
当前法律状态：	授权	有效性：	有权
法律详情：	授权\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):C07K 5/037申请日:20121009\|\|\|公开
IPC分类号：	C07K5/037; C07K1/06; A61K38/06; A61P1/16	主分类号：	C07K5/037
申请人：	南京工业大学; 南京英沛生物技术有限公司
发明人：	苏贤斌; 赵兴猛; 朱佳; 魏鹏; 楚遵雷
地址：	210009 江苏省南京市新模范马路5号
优先权：
专利代理机构：	南京苏高专利商标事务所(普通合伙) 32204	代理人：	肖明芳
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内容摘要

本发明公开了一种双环醇-谷胱甘肽缀合物及其制备方法。该缀合物抗病毒活性强、水溶性好、口服利用率高。本发明提供的双环醇-谷胱甘肽缀合物的制备方法将双环醇羟基与谷胱甘肽的一个羧基以酯键相连得双环醇-谷胱甘肽缀合物或将带保护的甘氨酸、半胱氨酸、谷氨酸依次接到双环醇上，操作简便、成本低、收率高，该化合物结构式如下：

权利要求书

权利要求书双环醇‑谷胱甘肽缀合物，其结构式如下：

一种双环醇‑谷胱甘肽缀合物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）使用巯基保护基保护谷胱甘肽的巯基，使用氨羧共保护剂保护谷胱甘肽上谷氨酸的氨基和α位羧基，得保护的谷胱甘肽；
（2）保护的谷胱甘肽与双环醇酯化反应，得保护的双环醇‑谷胱甘肽缀合物；
（3）保护的双环醇‑谷胱甘肽缀合物经脱保护基反应，即得双环醇‑谷胱甘肽缀合物。
根据权利要求2所述的一种双环醇‑谷胱甘肽缀合物的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所述巯基保护基选自4‑甲氧基苄基、2,4,6‑三甲氧基苄基、二苯甲基，三苯甲基和对甲氧苯基二苯甲基中的一种，其中，4‑甲氧基苄基的结构式为2,4,6‑三甲氧基苄基的结构式为二苯甲基的结构为三苯甲基的结构式为对甲氧苯基二苯甲基的结构式为
根据权利要求2所述的一种双环醇‑谷胱甘肽缀合物的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所述氨羧共保护剂选自三乙基硼烷和9‑硼双环[3.3.1]壬烷二聚物中的一种。
根据权利要求2所述的一种双环醇‑谷胱甘肽缀合物的制备方法，其特征在于：所述巯基保护基为对甲氧苯基二苯甲基，所述氨羧共保护剂为三乙基硼烷。
一种双环醇‑谷胱甘肽缀合物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）双环醇与保护的甘氨酸缩合反应，产物经脱保护基反应，得双环醇‑甘氨酸缀合物；
（2）甘氨酸‑双环醇缀合物与保护的半胱氨酸缩合反应，产物经脱保护基反应，得双环醇‑甘氨酸‑半胱氨酸缀合物；
（3）半胱氨酸‑甘氨酸‑双环醇缀合物与保护的谷氨酸缩合反应，产物经脱保护基反应，即得双环醇‑谷胱甘肽缀合物。
根据权利要求6所述的一种双环醇‑谷胱甘肽缀合物的制备方法，其特征在于：所述保护的甘氨酸选自Fmoc‑Gly‑OH或Boc‑Gly‑OH中的一种。
根据权利要求6所述的一种双环醇‑谷胱甘肽缀合物的制备方法，其特征在于：所述保护的半胱氨酸为Fmoc‑Cys(PG)‑OH，其中，所述PG选自4‑甲氧基苄基、2,4,6‑三甲氧基苄基、二苯甲基、三苯甲基和对甲氧苯基二苯甲基中的一种，其中其中，4‑甲氧基苄基的结构式为2,4,6‑三甲氧基苄基的结构式为二苯甲基的结构为三苯甲基的结构式为对甲氧苯基二苯甲基的结构式为
根据权利要求6所述的一种双环醇‑谷胱甘肽缀合物的制备方法，其特征在于：所述保护的谷氨酸为Boc‑Glu‑OtBu。
双环醇‑谷胱甘肽缀合物在制备治疗肝病损伤药物或抗肝炎药物中的应用。

说明书

说明书双环醇‑谷胱甘肽缀合物及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于药物化学领域，涉及一种双环醇‑谷胱甘肽缀合物及其制备方法与应用。
背景技术
双环醇，化学名为4,4′‑二甲氧基‑5,6,5′,6′‑二次甲二氧基‑2‑羟甲基‑2′‑
甲氧羰基联苯，其结构式为：

双环醇具有显著的保肝降酶和抗HBV活性的作用，是一种多功能多靶点的新型药物，主要用于治疗慢性乙型肝炎和慢性丙型肝炎，同时对肝纤维化、脂肪性肝炎、酒精性肝炎、药物性肝炎等均有一定的疗效。双环醇的保肝降酶机制主要是通过清除自由基，从而维持细胞的完整性，保护肝细胞不被破坏释放出转氨酶；双环醇对肝细胞线粒体损伤有保护作用，可以抗正常细胞凋亡及DNA降解从而抗肝细胞损伤；双环醇能增加肝药酶活性，促进肝脏毒物的代谢；双环醇可诱发人肝癌细胞株凋亡并影响甲胎蛋白分泌及基因的表达从而可清除病毒。然而，双环醇的水溶性较差，口服利用率不高，同时抗病毒能力不强，因此应用不广。
谷胱甘肽（GSH），分子量是307.33，熔点是189‑193°C，呈无色透明细长柱状晶体，溶于水、液氨、稀醇溶液，不溶于丙酮、醇和醚。谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成的三肽，其中谷氨酸的γ位羧基与半胱氨酸的氨基以肽键相连，同时谷胱甘肽又含有游离的巯基。谷胱甘肽还有另外一种存在形式，即两个还原型谷胱甘肽以二硫键相连，称为氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione)，用GSSG表示。谷胱甘肽及氧化型谷胱甘肽的结构如下：

氧化型谷胱甘肽是两分子的还原型谷胱甘肽通过氧化脱氢得到，固体的还原型谷胱甘肽较稳定，但其水溶液在空气中容易被氧化，而在动物体内起重要作用的主要是还原型谷胱甘肽。在提取谷胱甘肽时，为了避免谷胱甘肽被氧化，一般会在溶液中加入维生素C等具有强还原性的物质。
还原型谷胱甘肽是体内重要的抗氧化剂，它是细胞内非蛋白巯基团的重要组成部分，在组织中起到不可替代的重要生理功能作用：1)谷胱甘肽参与细胞内的氧化还原反应，是多种酶的辅基和辅酶，并对一些疏基酶有激活作用；2)还原型谷胱甘肽是体内主要的抗氧化剂，它提供还原性的巯基，从而可以使含巯基酶和蛋白质不容易被氧化稳定；3)还原性谷胱甘肽可以还原高价铁血红蛋白，促进对铁的吸收；4)谷胱甘肽可以清除体内的代谢物和有毒物质，如羟基过氧化物、自由基和亲电试剂等；5)还原型谷胱甘肽可以减少细胞紫外线照射下产生的活性氧及衍生物的氧化损害。谷胱甘肽是细胞抗损伤及代谢调节的关键物质之一。
谷胱甘肽具有保护肝脏、解毒、抗辐射病和辐射防护、抗过敏、养颜美容护肤、增加视力和治疗眼科疾病以及抗衰老的作用。谷胱甘肽临床上主要作为解毒、抗氧化作用的药物，同时谷胱甘肽还用于防止肿瘤病人化疗和药物性肝损伤、治疗慢性脂肪肝、辅助治疗病毒性肝炎和肝炎肝硬化以及联合果糖二磷酸钠辅助治疗慢性重型肝炎。
发明内容
发明目的：本发明的第一目的是提供一种抗病毒活性强、水溶性好、口服利用率高的双环醇‑谷胱甘肽缀合物。
本发明的第二目的是提供该双环醇‑谷胱甘肽缀合物的制备方法
本发明的第三目的是提供该双环醇‑谷胱甘肽缀合物的应用。
技术方案：本发明提供的双环醇‑谷胱甘肽缀合物，其结构式如下：

本发明还提供了该双环醇‑谷胱甘肽缀合物的制备方法，包括以下步骤：
（1）使用巯基保护基保护谷胱甘肽的巯基，使用氨羧共保护剂保护谷胱甘肽上谷氨酸的氨基和α位羧基，得保护的谷胱甘肽；
（2）保护的谷胱甘肽与双环醇酯化反应，得保护的双环醇‑谷胱甘肽缀合物；
（3）保护的双环醇‑谷胱甘肽缀合物经脱保护基反应，即得双环醇‑谷胱甘肽缀合物。
其中，步骤（1）中，所述巯基保护基选自4‑甲氧基苄基（Mob）、2,4,6‑三甲氧基苄基（Tmb）、二苯甲基（Dpm），三苯甲基（Trt）和对甲氧苯基二苯甲基（Mmt）中的一种，其中，4‑甲氧基苄基的结构式为2,4,6‑三甲氧基苄基的结构式为二苯甲基的结构为三苯甲基的结构式为对甲氧苯基二苯甲基的结构式为
所述氨羧共保护剂选自三乙基硼烷和9‑硼双环[3.3.1]壬烷二聚物中的一种。
作为本发明制备方法的一种优选，所述巯基保护基为对甲氧苯基二苯甲基，所述氨羧共保护剂为三乙基硼烷。
本发明还优化了反应条件：
步骤（1）中，巯基保护反应温度为5‑40℃，反应时间为2‑24h；氨羧基共保护反应温度为5‑40℃；反应时间为10‑20h；巯基保护基与谷胱甘肽的摩尔比为（1‑2）:1；氨羧共保护剂与巯基保护的谷胱甘肽的摩尔比为（1‑2）:1。
步骤（2）中，酯化反应温度为5‑40℃；反应时间为4‑10h；酯化反应体系中还包括二甲氨基吡啶（DMAP）和1‑(3‑二甲基氨基丙基)‑3‑乙基碳化二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）；双环醇与保护的谷胱甘肽的摩尔比为（0.8‑1.2）:1。
步骤（3）中，脱保护基反应温度为5‑40℃；反应时间为1‑2h；所述脱保护基反应体系为氯化氢气体，反应体系中还包括捕获剂三异丙基硅烷。
本发明还提供了另一种双环醇‑谷胱甘肽缀合物的制备方法，包括以下步骤：
（1）双环醇与保护的甘氨酸缩合反应，产物经脱保护基反应，得双环醇‑甘氨酸缀合物；
（2）甘氨酸‑双环醇缀合物与保护的半胱氨酸缩合反应，产物经脱保护基反应，得双环醇‑甘氨酸‑半胱氨酸缀合物；
（3）半胱氨酸‑甘氨酸‑双环醇缀合物与保护的谷氨酸缩合反应，产物经脱保护基反应，即得双环醇‑谷胱甘肽缀合物。
其中，保护的甘氨酸选自N‑芴甲氧羰基‑甘氨酸（Fmoc‑Gly‑OH）或N‑叔丁氧羰基‑甘氨酸（Boc‑Gly‑OH）中的一种；
其中，N‑芴甲氧羰基‑甘氨酸结构式为N‑叔丁氧羰基‑甘氨酸的结构式为
所述保护的半胱氨酸为巯基保护基（PG）保护的N‑芴甲氧羰基‑L‑半胱氨酸（Fmoc‑Cys(PG)‑OH），所述巯基保护基选自4‑甲氧基苄基（Mob）、2,4,6‑三甲氧基苄基（Tmb）、二苯甲基（Dpm），三苯甲基（Trt）和对甲氧苯基二苯甲基（Mmt）中的一种。其中，4‑甲氧基苄基的结构式为2,4,6‑三甲氧基苄基的结构式为二苯甲基的结构为三苯甲基的结构式为对甲氧苯基二苯甲基的结构式为
巯基保护基（PG）保护的N‑芴甲氧羰基‑L‑半胱氨酸（Fmoc‑Cys(PG)‑OH）的结构式为

所述保护的谷氨酸为N‑叔丁氧羰基‑L‑谷氨酸‑1‑叔丁酯（Boc‑Glu‑OtBu），其结构式为

本发明还优化了反应条件：
步骤（1）中，缩合反应温度为5‑40℃，反应时间为4‑16h；脱保护基反应温度为5‑40℃，反应时间为0.5‑2h；所述缩合反应体系中还包括1‑(3‑二甲基氨基丙基)‑3‑乙基碳化二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）和4‑二甲氨基吡啶（DMAP）的混合物，所述脱Fmoc保护基反应体系为哌啶和二氯甲烷（DCM）的混合物，脱Boc保护基反应体系为三氟乙酸和二氯甲烷（DCM）的混合物；
步骤（2）中，缩合反应温度为5‑40℃，反应时间为4‑16h；脱保护基反应温度为5‑40℃；反应时间为0.5‑2h；所述缩合反应体系中还包括1‑羟基苯并三唑（HOBt）、N，N‑二异丙基乙胺（DIPEA）和苯并三氮唑‑N,N,N',N’‑四甲基脲六氟磷酸盐（HBTU）的混合物，所述脱保护基反应体系中还包括哌啶和二氯甲烷（DCM）的混合物；
步骤（3）中，缩合反应温度为5‑40℃，反应时间为4‑16h；脱保护基反应温度为5‑40℃；反应时间为3‑7h；所述缩合反应体系中还包括HOBt、DIPEA和HBTU的混合物，所述脱保护基反应体系中为三氟乙酸和二氯甲烷（DCM）的混合物。
本发明还提供了双环醇‑谷胱甘肽缀合物在制备治疗肝病损伤药物或抗肝炎药物中的应用。药理实验表明该化合物能显著减轻D‑氨基半乳糖胺诱导的大鼠急性肝损伤程度。
有益效果：本发明提供的双环醇‑谷胱甘肽缀合物抗病毒活性强、水溶性好、口服利用率高。双环醇具有显著的保肝降酶和一定的抗病毒能力，同时谷胱甘肽也是保肝类药物，以双环醇为基本结构与谷胱甘肽缀合。该缀合物既克服了双环醇水溶性不好的缺陷，同时药理实验表明该化合物抗病毒活性强、水溶性好、口服利用率高。
本发明提供的双环醇‑谷胱甘肽缀合物的制备方法将双环醇羟基与谷胱甘肽的一个羧基以酯键相连得双环醇‑谷胱甘肽缀合物或将带保护的甘氨酸、半胱氨酸、谷氨酸依次接到双环醇上，操作简便、成本低、收率高。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1双环醇‑谷胱甘肽缀合物的制备。
（1）谷胱甘肽巯基的保护
谷胱甘肽(5g,16.27mmol)加入50mL DMF中，再加入Mmt‑Cl(5.6g,18.1mmol)，室温搅拌反应12h。蒸干反应液，用二氯甲烷、石油醚重结晶，过滤，得7.1g白色固体，即化合物12。[M‑H]‑=578.1。

（2）巯基保护的谷胱甘肽α位羧基和氨基的共保护
将化合物12(5.95g,10mmol)溶于50mL THF中，氮气保护，加入20mL 1mol/L的Et3B(20mmol)溶液，反应15h。蒸干反应液，用乙腈、二氯甲烷重结晶，过滤，得（6.50）g白色固体，即为化合物13。

（3）酯化反应
称取1.99g化合物13(3.0mmol)溶于20mL DCM中,冰浴冷却，加入40mg 4‑二甲氨基吡啶（DMAP）和750mg1‑(3‑二甲基氨基丙基)‑3‑乙基碳化二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）(3.9mmol)，搅拌10min，加入1.17g双环醇(3.0mmol)，反应6h。反应液中加入100mL DCM，依次用1mol/L HCl、饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液洗涤，干燥，硅胶柱梯度洗脱，流动相为PE:EA=4:1‑1:1，得白色固体2.82g，即为保护的双环醇‑谷胱甘肽缀合物14，HPLC分析纯度大于98％，收率为90％。

（4）脱保护基反应
称取1.03g保护的双环醇‑谷胱甘肽缀合物14(1.0mmol)溶于20mL DCM，加入0.7mL三异丙基硅烷，通入HCl气体，室温反应1‑2h，浓缩，加入乙醚，析出白色固体，DCM洗涤，过滤，得固体530mg，即为双环醇‑谷胱甘肽缀合物。
MS(ESI+)m/z:680.2[M+H]+。产率78％。
反应式如下：
实施例2双环醇‑谷胱甘肽缀合物的制备。
（1）谷胱甘肽巯基的保护
取10mmol谷胱甘肽加入50mL DMF中，再加入12mmol Mob‑Cl，5℃搅拌反应24h。蒸干反应液，用二氯甲烷、石油醚重结晶，过滤，得白色固体，即巯基保护的谷胱甘肽。
（2）谷胱甘肽α位羧基和氨基的共保护
取5mmol巯基保护的谷胱甘肽溶于50mL THF中，氮气保护，加入5mmol的Et3B，5℃反应20h。蒸干反应液，用乙腈、二氯甲烷重结晶，过滤，得白色固体，即为保护的谷胱甘肽。
（3）酯化反应
称取3mmol保护的谷胱甘肽溶于20mL DCM中,冰浴冷却，加入40mg 4‑二甲氨基吡啶（DMAP）和750mg1‑(3‑二甲基氨基丙基)‑3‑乙基碳化二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）(3.9mmol)，搅拌10min，加入2.4mmol双环醇，5℃反应10h。反应液中加入100mLDCM，依次用1mol/L HCl、饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液洗涤，干燥，硅胶柱梯度洗脱，流动相为PE:EA=4:1‑1:1，得白色固体，即为保护的双环醇‑谷胱甘肽缀合物。
（4）脱保护基反应
称取1mmol保护的双环醇‑谷胱甘肽缀合物溶于10mL DCM中，加入0.7mL三异丙基硅烷，通入HCl气体，5℃反应2h，浓缩，加入乙醚，析出白色固体，DCM洗涤，过滤，即为双环醇‑谷胱甘肽缀合物。
实施例3双环醇‑谷胱甘肽缀合物的制备。
（1）谷胱甘肽巯基的保护
取10mmol谷胱甘肽加入50mL DMF中，再加入12mmol Tmb‑Cl，40℃搅拌反应2h。蒸干反应液，用二氯甲烷、石油醚重结晶，过滤，得白色固体，即为巯基保护的谷胱甘肽。
（2）谷胱甘肽α位羧基和氨基的共保护
取5mmol巯基保护的谷胱甘肽溶于50mL THF中，氮气保护，加入7.5mmol的9‑硼双环[3.3.1]壬烷二聚物(25mmol)溶液，40℃反应10h。蒸干反应液，用乙腈、二氯甲烷重结晶，过滤，得白色固体，即为保护的谷胱甘肽。
（3）酯化反应
称取3mmol保护的谷胱甘肽溶于20mL DCM中,冰浴冷却，加入40mg 4‑二甲氨基吡啶（DMAP）和750mg1‑(3‑二甲基氨基丙基)‑3‑乙基碳化二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）(3.9mmol)，搅拌10min，加入3.6mmol双环醇，40℃反应4h。反应液中加入100mLDCM，依次用1mol/L HCl、饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液洗涤，干燥，硅胶柱梯度洗脱，流动相为PE:EA=4:1‑1:1，得白色固体，即为保护的双环醇‑谷胱甘肽缀合物。
（4）脱保护基反应
称取1mmol保护的双环醇‑谷胱甘肽缀合物溶于20mL DCM中，加入0.7mL三异丙基硅烷，通入HCl气体，40℃反应1h，浓缩，加入乙醚，析出白色固体，DCM洗涤，过滤，即为双环醇‑谷胱甘肽缀合物。
实施例4
本实施例的制备方法与实施例1基本相同，不同之处仅在于：所述巯基保护基为三苯甲基（Trt）。
实施例5
本实施例的制备方法与实施例1基本相同，不同之处仅在于：所述巯基保护基为4‑甲氧苯基（Dpm）。
实施例6双环醇‑谷胱甘肽缀合物的制备。
（1）双环醇与保护的甘氨酸缩合反应，产物脱保护基，得甘氨酸‑双环醇缀合物；
（1.1）氨基保护的甘氨酸（Fmoc‑Gly‑OH）与双环醇缀合

称取1.0080g Fmoc‑Gly‑OH(3.3904mmol)溶于20mL二氯甲烷(DCM)中,冰浴冷却，加入40mg 4‑二甲氨基吡啶（DMAP）和750mg 1‑(3‑二甲基氨基丙基)‑3‑乙基碳化二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）(3.9120mmol)，搅拌10min，加入1.0118g双环醇(2.6080mmol)，反应6h。反应液中加入100mL二氯甲烷(DCM)，依次用1mol/L盐酸溶液、饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液洗涤，干燥，硅胶柱梯度洗脱，流动相为PE:EA=4:1‑1:1，得白色固体1.58g，即为化合物22，HPLC分析纯度大于98％，收率为91％。
（1.2）脱甘氨酸氨基Fmoc保护基

称取1.0532g化合物22（1.5728mmol)溶于10mL 50％哌啶/DCM混合体系中，室温反应30min，TLC检测反应完全。加入50mL乙酸乙酯，依次用饱和氯化钠溶液、PH值为5.5磷酸盐缓冲溶液洗涤，干燥，得到淡黄色固体，即为化合物23。
（2）甘氨酸‑双环醇缀合物与保护的半胱氨酸缩合反应，产物脱保护基，得半胱氨酸‑甘氨酸‑双环醇缀合物；
（2.1）与保护的半胱氨酸的缩合

称取1.1996g化合物23(2.0446mmol)，2mmol保护的半胱氨酸，276.3mg HOBt(2.0446mmol)溶于18mL DMF中，冰浴冷却，加入0.8mL DIPEA，搅拌5min后，加入775.4mg HBTU(2.0446mmol)，反应15min后，升至室温，反应12h后，向反应液中加入50mL乙酸乙酯，依次用1mol/L HCl、饱和氯化钠水溶液洗涤，干燥，得油状产物。产物过硅胶柱，流动相为PE:EA=4:1‑1:1，得到产物1.05g，两步反应收率为66％。
（2.2）脱半胱氨酸氨基Fmoc保护基

称取0.7567g化合物24(0.7438mmol)溶于10mL 50％哌啶/DCM混合体系中，室温反应30min，TLC检测反应完全。加入50mL乙酸乙酯，依次用饱和氯化钠溶液、pH值为5.5的磷酸盐缓冲溶液洗涤，干燥，得到淡黄色固体，即为化合物25。
（3）半胱氨酸‑甘氨酸‑双环醇缀合物与保护的谷氨酸缩合反应，产物脱保护基，即得双环醇‑谷胱甘肽缀合物
（3.1）与保护的谷氨酸缩合

将270.8mg化合物25(0.8926mmol)，1mmol保护的谷氨酸和120.6mg HOBt(0.8926mmol)溶于15mL DMF中，冰浴冷却，加入0.3mL DIPEA，搅拌5min后，加入338.5mg HBTU(0.8926mmol)，反应15min后，升至室温，反应10h后，向反应液中加入100mL乙酸乙酯，以此用1mol/L盐酸溶液、饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液洗涤，干燥，得红色油状产物。产物过硅胶柱，流动相为PE:EA=3:1‑2:3，得到固体573mg，即为化合物26，两步总收率为72％。MS(ESI+)m/z:1100.5[M+Na]+.
（3.2）全脱保护

称取340mg化合物26(0.315mmol)，加入7mL三氟乙酸，0.7mL三异丙基硅烷，室温反应5h，浓缩，加入乙醚，析出白色固体，DCM洗涤，过滤，得固体151mg，即为双环醇‑谷胱甘肽缀合物，产率为70.5％。
1H‑NMR(500MHz，DMSO)δ:7.27(s,1H,ArH);6.72(s,1H,ArH);5.91‑6.10(m,4H,OCH2O);4.41‑4.43(m,3H,ArCH2O and CH);3.97(s,2H,CH2);3.94(s,3H,‑OCH3);3.83(s,3H,‑OCH3);3.62(s,3H,‑COOCH3);3.36(s,1H,CH);3.19(dd,1H,CH2);2.94(dd,1H,CH2);
2.34(m,2H,CH2);2.02(m,2H,CH),
MS(ESI+)m/z:680.2[M+H]+。
实施例7双环醇‑谷胱甘肽缀合物的制备。
（1）双环醇与保护的甘氨酸缩合反应，产物脱保护基，得甘氨酸‑双环醇缀合物；
（1.1）氨基保护的甘氨酸（Boc‑Gly‑OH）与双环醇缀合
取10mmol Boc‑Gly‑OH溶于20mL二氯甲烷(DCM)中,冰浴冷却，加入1mmol 4‑二甲氨基吡啶（DMAP）和1mmol1‑(3‑二甲基氨基丙基)‑3‑乙基碳化二亚胺盐酸盐（EDC·HCl），搅拌10min，加入20mmol双环醇，40℃反应4h。反应液中加入100mL二氯甲烷(DCM)，依次用1mol/L盐酸溶液、饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液洗涤，干燥，硅胶柱梯度洗脱，流动相为PE:EA=4:1‑1:1，得白色固体，即为保护的甘氨酸‑双环醇缀合物。
（1.2）脱甘氨酸氨基Boc保护基
取6mmol保护的甘氨酸‑双环醇缀合物溶于10mL TFA/DCM混合体系中，室温反应0.5h，TLC检测反应完全。旋干，乙醚洗涤，干燥，得到淡黄色固体，即为甘氨酸‑双环醇缀合物。
（2）甘氨酸‑双环醇缀合物与保护的半胱氨酸缩合反应，产物脱保护基，得半胱氨酸‑甘氨酸‑双环醇缀合物；
（2.1）与保护的半胱氨酸Fmoc‑Cys(Mob)‑OH的缩合
称取5mmol甘氨酸‑双环醇缀合物、10mmol保护的半胱氨酸Fmoc‑Cys(Mob)‑OH、1mmol HOBt溶于18mL DMF中，冰浴冷却，加入0.8mL DIPEA，搅拌5min后，加入1mmol HBTU，40℃反应4h后，向反应液中加入50mL乙酸乙酯，依次用1mol/L HCl、饱和氯化钠水溶液洗涤，干燥，得油状产物。产物过硅胶柱，流动相为PE:EA=4:1‑1:1，得保护的半胱氨酸‑甘氨酸‑双环醇缀合物。
（2.2）脱半胱氨酸氨基Fmoc保护基
取3mmol保护的半胱氨酸‑甘氨酸‑双环醇缀合物溶于10mL 50％哌啶/DCM混合体系中，40℃反应0.5h，TLC检测反应完全。加入50mL乙酸乙酯，依次用饱和氯化钠溶液、pH值为5.5的磷酸盐缓冲溶液洗涤，干燥，得到淡黄色固体，即为半胱氨酸‑甘氨酸‑双环醇缀合物。
（3）半胱氨酸‑甘氨酸‑双环醇缀合物与保护的谷氨酸缩合反应，产物脱保护基，即得双环醇‑谷胱甘肽缀合物
（3.1）与保护的谷氨酸Boc‑Glu‑OtBu缩合
将2mmol半胱氨酸‑甘氨酸‑双环醇缀合物、4mmol保护的谷氨酸和1mmol HOBt溶于15mL DMF中，冰浴冷却，加入0.3mL DIPEA，搅拌5min后，加入1mmol HBTU，反应15min后，40℃反应4h，向反应液中加入100mL乙酸乙酯，以此用1mol/L盐酸溶液、饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液洗涤，干燥，得红色油状产物。产物过硅胶柱，流动相为PE:EA=3:1‑2:3，得保护的双环醇‑谷胱甘肽缀合物。
（3.2）全脱保护
取1mmol保护的双环醇‑谷胱甘肽缀合物，加入7mL三氟乙酸，0.7mL三异丙基硅烷，40℃反应3h，浓缩，加入乙醚，析出白色固体，DCM洗涤，过滤，得双环醇‑谷胱甘肽缀合物。
实施例8双环醇‑谷胱甘肽缀合物的制备。
（1）双环醇与保护的甘氨酸缩合反应，产物脱保护基，得甘氨酸‑双环醇缀合物；
（1.1）氨基保护的甘氨酸（Fmoc‑Gly‑OH）与双环醇缀合
取20mmol Fmoc‑Gly‑OH溶于20mL二氯甲烷(DCM)中,冰浴冷却，加入1mmol 4‑二甲氨基吡啶（DMAP）和1mmol1‑(3‑二甲基氨基丙基)‑3‑乙基碳化二亚胺盐酸盐（EDC·HCl），搅拌10min，加入10mmol双环醇，5℃反应16h。反应液中加入100mL二氯甲烷(DCM)，依次用1mol/L盐酸溶液、饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液洗涤，干燥，硅胶柱梯度洗脱，流动相为PE:EA=4:1‑1:1，得白色固体，即为保护的甘氨酸‑双环醇缀合物。
（1.2）脱甘氨酸氨基保护基
取8mmol保护的甘氨酸‑双环醇缀合物溶于10mL 50％哌啶/DCM混合体系中，5℃反应2h，TLC检测反应完全。加入50mL乙酸乙酯，依次用饱和氯化钠溶液、PH值为5.5磷酸盐缓冲溶液洗涤，干燥，得到淡黄色固体，即为甘氨酸‑双环醇缀合物。
（2）甘氨酸‑双环醇缀合物与保护的半胱氨酸缩合反应，产物脱保护基，得半胱氨酸‑甘氨酸‑双环醇缀合物；
（2.1）与保护的半胱氨酸Fmoc‑Cys(Mmt)‑OH的缩合
称取6mmol甘氨酸‑双环醇缀合物、3mmol保护的半胱氨酸、1mmol HOBt溶于18mLDMF中，冰浴冷却，加入0.8mL DIPEA，搅拌5min后，加入1mmol HBTU，5℃反应16h后，向反应液中加入50mL乙酸乙酯，依次用1mol/L HCl、饱和氯化钠水溶液洗涤，干燥，得油状产物。产物过硅胶柱，流动相为PE:EA=4:1‑1:1，得保护的半胱氨酸‑甘氨酸‑双环醇缀合物。
（2.2）脱半胱氨酸氨基保护基
取3mmol保护的半胱氨酸‑甘氨酸‑双环醇缀合物溶于10mL 50％哌啶/DCM混合体系中，5℃反应2h，TLC检测反应完全。加入50mL乙酸乙酯，依次用饱和氯化钠溶液、pH值为5.5的磷酸盐缓冲溶液洗涤，干燥，得到淡黄色固体，即为半胱氨酸‑甘氨酸‑双环醇缀合物。
（3）半胱氨酸‑甘氨酸‑双环醇缀合物与保护的谷氨酸缩合反应，产物脱保护基，即得双环醇‑谷胱甘肽缀合物
（3.1）与保护的谷氨酸Boc‑Glu‑OtBu缩合
将3mmol半胱氨酸‑甘氨酸‑双环醇缀合物、1.5mmo保护的谷氨酸和1mmol HOBt溶于15mL DMF中，冰浴冷却，加入0.3mL DIPEA，搅拌5min后，加入1mmol HBTU，反应15min后，5℃反应16h，向反应液中加入100mL乙酸乙酯，以此用1mol/L盐酸溶液、饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液洗涤，干燥，得红色油状产物。产物过硅胶柱，流动相为PE:EA=3:1‑2:3，得保护的双环醇‑谷胱甘肽缀合物。
（3.2）全脱保护
取1mmol保护的双环醇‑谷胱甘肽缀合物，加入7mL三氟乙酸，0.7mL三异丙基硅烷，5℃反应7h，浓缩，加入乙醚，析出白色固体，DCM洗涤，过滤，得双环醇‑谷胱甘肽缀合物。
实施例9
本实施例的制备方法与实施例6基本相同，不同之处仅在于：所述保护的半胱氨酸为Fmoc‑Cys(Tmb)‑OH。
实施例10
本实施例的制备方法与实施例6基本相同，不同之处仅在于：所述保护的半胱氨酸为Fmoc‑Cys(Dpm)‑OH。
实施例11双环醇‑谷胱甘肽缀合物对大鼠D‑氨基半乳糖胺肝损伤模型的影响。
1.实验材料
1.1动物
SPF级SD大鼠，体重180g～220g，雌雄各半，由南京军区总医院比较医学中心提供。实验动物生产许可证号：SCXK(军)2007‑012，实验动物使用许可证号：SYXK(军)2007‑029。
随机分为5组，每组10只，即(1)空白对照组，(2)模型对照组，(3)双环醇组，(4)还原态谷胱甘肽组，(5)双环醇‑谷胱甘肽缀合物组。
1.2药物
实施例2的双环醇‑谷胱甘肽缀合物，还原态谷胱甘肽及双环醇。
1.3药物配制、剂量及分组
实验分五组，包括：
(1)空白对照组；
(2)模型对照组；
(3)双环醇组：给药双环醇，剂量为6.75mg/kg（按照临床人日服用量75mg按体表
面积折算成大鼠给药剂量）；
(4)还原态谷胱甘肽组：给药还原态谷胱甘肽，剂量为6.75mg/kg；
(5)双环醇‑谷胱甘肽缀合物组：给药双环醇‑谷胱甘肽缀合物，剂量为6.75mg/kg。
空白对照组，模型组给予等容积溶媒，上述各组药物使用时用DMSO溶解，调节浓度至6.75mg/ml,用含10％β‑环糊精的PBS 1:10稀释后灌胃。给药体积为1.0mL/100g体重。
1.4试剂
D‑氨基半乳糖胺，南京博源医药科技有限公司，批号：2011092605。
β‑cyclodextrin，中国医药集团上海化学试剂公司。
丙氨酸氨基转移酶(ALT)IFCC法检测试剂盒，四川迈克科技有限责任公司，批号：
0611041。
门冬氨酸氨基转移酶（AST）IFCC法检测试剂盒，四川迈克科技有限责任公司，批
号：0611051。
1.5仪器
DK‑8D型恒温水浴槽，上海精宏实验设备有限公司；
Sartorius电子天平，德国Sartorius公司；
OLYMPUS AU2700全自动生化分析仪。
2实验方法
2.1实验步骤
建模：除空白对照组外，其余各组大鼠腹腔注射D‑氨基半乳糖胺600mg/kg，注射体积为1.0mL/100g体重；空白组注射等量生理盐水。
给药：各组大鼠每天灌胃分别按剂量给药一次，连续给药七天。
检测：于第七次给药24小时后，称体重，眼眶采血并分离血清，测定谷丙转氨酶、谷草转氨酶活性。颈椎脱臼处死大鼠后，进行尸检，取肝、脾、胸腺，称量并计算脏器系数（脏器重量/体重×100％），并对肝脏组织进行病理组织学检查。
2.2数据处理
对所有数据使用Microsoft Excel软件进行数据处理，对病理学评分采用秩和检测，并统计分析结果。
3实验结果
3.1受试双环醇‑谷胱甘肽缀合物对D‑氨基半乳糖胺诱导的大鼠急性肝损伤血清生化指标的影响
从表1可以看出，D‑氨基半乳糖胺模型对照组大鼠血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶显著升高（P＜0.01），表明D‑氨基半乳糖胺可造成大鼠急性肝损伤。双环醇‑谷胱甘肽缀合物给药后能显著性降低急性实验性肝损伤大鼠谷丙转氨酶及谷草转氨酶（P＜0.05或P＜0.01）。
表1不同药物对D‑氨基半乳糖胺诱导的大鼠急性肝损伤血清生化指标的影响（
n＝10）

与模型组比较，*P＜0.05,**P＜0.01；与空白对照组比较，ΔΔP＜0.01。
3.2双环醇‑谷胱甘肽缀合物对D‑氨基半乳糖胺诱导的大鼠急性肝损伤病理组织学检查的影响
受试双环醇‑谷胱甘肽缀合物对D‑氨基半乳糖胺诱导的大鼠急性肝脏损伤的组织病理组织学研究表明，本实验中D‑氨基半乳糖胺引起的大鼠肝损伤模型主要表现为（1）肝细胞明显脂变；（2）出现较多的嗜酸性小体；（3）肝小叶内有多灶性炎细胞浸润，肝窦淤血。四种化合物应用后，光镜下均有减轻上述肝损伤的作用，与模型组相比具有统计学显著性差异，根据病变由轻到重的程度标记为0.5分（轻微），1分（轻度），2分（中度），3分（重度），0分（基本正常），累加所有分数，并计算出每组每例动物的均分（表2）。
表2不同药物对大鼠D‑氨基半乳糖胺肝损伤影响的病变评分结果

注：各组与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01
4结论
对D‑氨基半乳糖胺诱导的大鼠急性肝损伤模型，不同受试药物应用后均能一定程度减轻肝脏损伤程度，其效果按由高到低的顺序依次为双环醇‑谷胱甘肽缀合物、双环醇、还原型谷胱甘肽，与模型组相比具有统计学显著性差异。
实施例12双环醇‑谷胱甘肽缀合物抗病毒活性测试。
1.实验分组：
空白对照组；
双环醇治疗组：给予35μg/ml的双环醇；
双环醇‑谷胱甘肽缀合物治疗组：给予35μg/ml的双环醇‑谷胱甘肽缀合物。
2.实验方法：
将HBV‑DNA转染的2.2.15细胞株在10％牛血清培养液中培养，分成三个实验组。当生长达到70％培养面积时，改用2％的牛血清培养液培养，并分别对各组给药。
每两天更换培养液，并分别补充相同浓度的药物，共培养10天，隔天测定培养液中乙型肝炎表面抗体（HbsAg）的含量。
表1培养液中HbsAg的浓度（μg/ml）
天数0246810空白对照组2.02.12.32.42.52.7双环醇‑谷胱甘肽缀合物治疗组2.01.51.41.31.31.2双环醇治疗组2.01.81.71.71.61.6
由上表可知，空白对照组培养液中HbsAg浓度随时间延长持续增加，其他各治疗组HbsAg浓度有所下降或被控制，显示各治疗组药物均具有抗HBV病毒作用。双环醇‑谷胱甘肽缀合物治疗组的培养液中HbsAg的浓度降低与双环醇治疗组相比降低较快，显示双环醇‑谷胱甘肽缀合物的抗HBV病毒活性更好。

资源描述

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1、(10)申请公布号 CN 102911251 A (43)申请公布日 2013.02.06 CN 102911251 A *CN102911251A* (21)申请号 201210378755.6 (22)申请日 2012.10.09 C07K 5/037(2006.01) C07K 1/06(2006.01) A61K 38/06(2006.01) A61P 1/16(2006.01) (71)申请人南京工业大学地址 210009 江苏省南京市新模范马路 5 号申请人南京英沛生物技术有限公司 (72)发明人苏贤斌赵兴猛朱佳魏鹏楚遵雷 (74)专利代理机构南京苏高专利商标事。

2、务所 ( 普通合伙 ) 32204 代理人肖明芳 (54) 发明名称双环醇 - 谷胱甘肽缀合物及其制备方法与应用 (57) 摘要本发明公开了一种双环醇 - 谷胱甘肽缀合物及其制备方法。该缀合物抗病毒活性强、水溶性好、口服利用率高。本发明提供的双环醇-谷胱甘肽缀合物的制备方法将双环醇羟基与谷胱甘肽的一个羧基以酯键相连得双环醇 - 谷胱甘肽缀合物或将带保护的甘氨酸、半胱氨酸、谷氨酸依次接到双环醇上，操作简便、成本低、收率高，该化合物结构式如下： (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页说明书 15 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明。

3、专利申请权利要求书 2 页说明书 15 页 1/2 页 2 1. 双环醇 - 谷胱甘肽缀合物，其结构式如下： 2. 一种双环醇 - 谷胱甘肽缀合物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）使用巯基保护基保护谷胱甘肽的巯基，使用氨羧共保护剂保护谷胱甘肽上谷氨酸的氨基和位羧基，得保护的谷胱甘肽；（2）保护的谷胱甘肽与双环醇酯化反应，得保护的双环醇 - 谷胱甘肽缀合物；（3）保护的双环醇 - 谷胱甘肽缀合物经脱保护基反应，即得双环醇 - 谷胱甘肽缀合物。 3. 根据权利要求 2 所述的一种双环醇 - 谷胱甘肽缀合物的制备方法，其特征在于：步骤（1。

4、）中，所述巯基保护基选自 4- 甲氧基苄基、 2,4,6- 三甲氧基苄基、二苯甲基，三苯甲基和对甲氧苯基二苯甲基中的一种，其中， 4- 甲氧基苄基的结构式为 2,4,6- 三甲氧基苄基的结构式为二苯甲基的结构为三苯甲基的结构式为对甲氧苯基二苯甲基的结构式为 4. 根据权利要求 2 所述的一种双环醇 - 谷胱甘肽缀合物的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所述氨羧共保护剂选自三乙基硼烷和 9- 硼双环 3.3.1 壬烷二聚物中的一种。 5. 根据权利要求 2 所述的一种双环醇 - 谷胱甘肽缀合物的制备方法，其特征在于：所述巯基保护基为对甲氧苯基二苯甲基，所述。

5、氨羧共保护剂为三乙基硼烷。 6. 一种双环醇 - 谷胱甘肽缀合物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）双环醇与保护的甘氨酸缩合反应，产物经脱保护基反应，得双环醇 - 甘氨酸缀合物；（2）甘氨酸 - 双环醇缀合物与保护的半胱氨酸缩合反应，产物经脱保护基反应，得双环醇 - 甘氨酸 - 半胱氨酸缀合物；（3）半胱氨酸 - 甘氨酸 - 双环醇缀合物与保护的谷氨酸缩合反应，产物经脱保护基反应，即得双环醇 - 谷胱甘肽缀合物。 7. 根据权利要求 6 所述的一种双环醇 - 谷胱甘肽缀合物的制备方法，其特征在于：所权利要求书 CN 102911。

6、251 A 2 2/2 页 3 述保护的甘氨酸选自 Fmoc-Gly-OH 或 Boc-Gly-OH 中的一种。 8. 根据权利要求 6 所述的一种双环醇 - 谷胱甘肽缀合物的制备方法，其特征在于：所述保护的半胱氨酸为 Fmoc-Cys(PG)-OH，其中，所述 PG 选自 4- 甲氧基苄基、 2,4,6- 三甲氧基苄基、二苯甲基、三苯甲基和对甲氧苯基二苯甲基中的一种，其中其中， 4- 甲氧基苄基的结构式为2,4,6- 三甲氧基苄基的结构式为二苯甲基的结构为三苯甲基的结构式为对甲氧苯基二苯甲基的结构式为 9. 根据权利要求 6 所述的一种双环醇 - 谷胱甘肽缀合物的制备。

7、方法，其特征在于：所述保护的谷氨酸为 Boc-Glu-OtBu。 10. 双环醇 - 谷胱甘肽缀合物在制备治疗肝病损伤药物或抗肝炎药物中的应用。权利要求书 CN 102911251 A 3 1/15 页 4 双环醇 - 谷胱甘肽缀合物及其制备方法与应用技术领域 0001 本发明属于药物化学领域，涉及一种双环醇 - 谷胱甘肽缀合物及其制备方法与应用。背景技术 0002 双环醇，化学名为 4,4 - 二甲氧基 -5,6,5 ,6 - 二次甲二氧基 -2- 羟甲基 -2 - 0003 甲氧羰基联苯，其结构式为： 0004 0005 双环醇具有显著的保肝降酶和抗 HB。

8、V 活性的作用，是一种多功能多靶点的新型药物，主要用于治疗慢性乙型肝炎和慢性丙型肝炎，同时对肝纤维化、脂肪性肝炎、酒精性肝炎、药物性肝炎等均有一定的疗效。双环醇的保肝降酶机制主要是通过清除自由基，从而维持细胞的完整性，保护肝细胞不被破坏释放出转氨酶；双环醇对肝细胞线粒体损伤有保护作用，可以抗正常细胞凋亡及 DNA 降解从而抗肝细胞损伤；双环醇能增加肝药酶活性，促进肝脏毒物的代谢；双环醇可诱发人肝癌细胞株凋亡并影响甲胎蛋白分泌及基因的表达从而可清除病毒。然而，双环醇的水溶性较差，口服利用率不高，同时抗病毒能力不强，因此应用不广。 0006。

9、谷胱甘肽（GSH），分子量是 307.33，熔点是 189-193 C，呈无色透明细长柱状晶体，溶于水、液氨、稀醇溶液，不溶于丙酮、醇和醚。谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成的三肽，其中谷氨酸的位羧基与半胱氨酸的氨基以肽键相连，同时谷胱甘肽又含有游离的巯基。谷胱甘肽还有另外一种存在形式，即两个还原型谷胱甘肽以二硫键相连，称为氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione)，用GSSG表示。谷胱甘肽及氧化型谷胱甘肽的结构如下： 0007 说明书 CN 102911251 A 4 2/15 页 5 0008 氧化型谷胱甘肽是。

10、两分子的还原型谷胱甘肽通过氧化脱氢得到，固体的还原型谷胱甘肽较稳定，但其水溶液在空气中容易被氧化，而在动物体内起重要作用的主要是还原型谷胱甘肽。在提取谷胱甘肽时，为了避免谷胱甘肽被氧化，一般会在溶液中加入维生素 C 等具有强还原性的物质。 0009 还原型谷胱甘肽是体内重要的抗氧化剂，它是细胞内非蛋白巯基团的重要组成部分，在组织中起到不可替代的重要生理功能作用： 1) 谷胱甘肽参与细胞内的氧化还原反应，是多种酶的辅基和辅酶，并对一些疏基酶有激活作用； 2) 还原型谷胱甘肽是体内主要的抗氧化剂，它提供还原性的巯基，从而可以使含巯基酶和蛋白质不容易被氧化稳定；。

11、 3) 还原性谷胱甘肽可以还原高价铁血红蛋白，促进对铁的吸收； 4) 谷胱甘肽可以清除体内的代谢物和有毒物质，如羟基过氧化物、自由基和亲电试剂等； 5) 还原型谷胱甘肽可以减少细胞紫外线照射下产生的活性氧及衍生物的氧化损害。谷胱甘肽是细胞抗损伤及代谢调节的关键物质之一。 0010 谷胱甘肽具有保护肝脏、解毒、抗辐射病和辐射防护、抗过敏、养颜美容护肤、增加视力和治疗眼科疾病以及抗衰老的作用。谷胱甘肽临床上主要作为解毒、抗氧化作用的药物，同时谷胱甘肽还用于防止肿瘤病人化疗和药物性肝损伤、治疗慢性脂肪肝、辅助治疗病毒性肝炎和肝炎肝硬化以及联合果糖二磷酸钠辅助。

12、治疗慢性重型肝炎。发明内容 0011 发明目的：本发明的第一目的是提供一种抗病毒活性强、水溶性好、口服利用率高的双环醇 - 谷胱甘肽缀合物。 0012 本发明的第二目的是提供该双环醇 - 谷胱甘肽缀合物的制备方法 0013 本发明的第三目的是提供该双环醇 - 谷胱甘肽缀合物的应用。 0014 技术方案：本发明提供的双环醇 - 谷胱甘肽缀合物，其结构式如下： 0015 0016 本发明还提供了该双环醇 - 谷胱甘肽缀合物的制备方法，包括以下步骤：说明书 CN 102911251 A 5 3/15 页 6 0017 （1）使用巯基保护基保护谷胱甘肽的巯基，使用氨羧。

13、共保护剂保护谷胱甘肽上谷氨酸的氨基和位羧基，得保护的谷胱甘肽； 0018 （2）保护的谷胱甘肽与双环醇酯化反应，得保护的双环醇 - 谷胱甘肽缀合物； 0019 （3）保护的双环醇-谷胱甘肽缀合物经脱保护基反应，即得双环醇-谷胱甘肽缀合物。 0020 其中，步骤（1）中，所述巯基保护基选自 4- 甲氧基苄基（Mob）、 2,4,6- 三甲氧基苄基（Tmb）、二苯甲基（Dpm），三苯甲基（Trt）和对甲氧苯基二苯甲基（Mmt）中的一种，其中， 4- 甲氧基苄基的结构式为2,4,6- 三甲氧基苄基的结构式为二苯甲基的结构为三苯甲基的结构式为对甲氧。

14、苯基二苯甲基的结构式为 0021 所述氨羧共保护剂选自三乙基硼烷和 9- 硼双环 3.3.1 壬烷二聚物中的一种。 0022 作为本发明制备方法的一种优选，所述巯基保护基为对甲氧苯基二苯甲基，所述氨羧共保护剂为三乙基硼烷。 0023 本发明还优化了反应条件： 0024 步骤（1）中，巯基保护反应温度为 5-40，反应时间为 2-24h ；氨羧基共保护反应温度为 5-40；反应时间为 10-20h ；巯基保护基与谷胱甘肽的摩尔比为（1-2） :1 ；氨羧共保护剂与巯基保护的谷胱甘肽的摩尔比为（1-2） :1。 0025 步骤（2）中，酯化反应温度为 5-4。

15、0 ；反应时间为 4-10h ；酯化反应体系中还包括二甲氨基吡啶（DMAP）和 1-(3- 二甲基氨基丙基 )-3- 乙基碳化二亚胺盐酸盐（EDCHCl）；双环醇与保护的谷胱甘肽的摩尔比为（0.8-1.2） :1。 0026 步骤（3）中，脱保护基反应温度为 5-40；反应时间为 1-2h ；所述脱保护基反应体系为氯化氢气体，反应体系中还包括捕获剂三异丙基硅烷。 0027 本发明还提供了另一种双环醇 - 谷胱甘肽缀合物的制备方法，包括以下步骤： 0028 （1）双环醇与保护的甘氨酸缩合反应，产物经脱保护基反应，得双环醇 - 甘氨酸缀合物； 0029。

16、（2）甘氨酸 - 双环醇缀合物与保护的半胱氨酸缩合反应，产物经脱保护基反应，得双环醇 - 甘氨酸 - 半胱氨酸缀合物； 0030 （3）半胱氨酸-甘氨酸-双环醇缀合物与保护的谷氨酸缩合反应，产物经脱保护基反应，即得双环醇 - 谷胱甘肽缀合物。说明书 CN 102911251 A 6 4/15 页 7 0031 其中，保护的甘氨酸选自 N- 芴甲氧羰基 - 甘氨酸（Fmoc-Gly-OH）或 N- 叔丁氧羰基 - 甘氨酸（Boc-Gly-OH）中的一种； 0032 其中， N- 芴甲氧羰基 - 甘氨酸结构式为N- 叔丁氧羰基 - 甘氨酸的结构式为 003。

17、3 所述保护的半胱氨酸为巯基保护基（PG）保护的 N- 芴甲氧羰基 -L- 半胱氨酸（Fmoc-Cys(PG)-OH），所述巯基保护基选自 4- 甲氧基苄基（Mob）、 2,4,6- 三甲氧基苄基（Tmb）、二苯甲基（Dpm），三苯甲基（Trt）和对甲氧苯基二苯甲基（Mmt）中的一种。其中， 4-甲氧基苄基的结构式为2,4,6- 三甲氧基苄基的结构式为二苯甲基的结构为三苯甲基的结构式为对甲氧苯基二苯甲基的结构式为 0034 巯基保护基（PG）保护的 N- 芴甲氧羰基 -L- 半胱氨酸（Fmoc-Cys(PG)-OH）的结构式为 0035 003。

18、6 所述保护的谷氨酸为 N- 叔丁氧羰基 -L- 谷氨酸 -1- 叔丁酯（Boc-Glu-OtBu），其结构式为 0037 说明书 CN 102911251 A 7 5/15 页 8 0038 本发明还优化了反应条件： 0039 步骤（1）中，缩合反应温度为 5-40，反应时间为 4-16h ；脱保护基反应温度为 5-40，反应时间为 0.5-2h ；所述缩合反应体系中还包括 1-(3- 二甲基氨基丙基 )-3- 乙基碳化二亚胺盐酸盐（EDC HCl）和 4- 二甲氨基吡啶（DMAP）的混合物，所述脱 Fmoc 保护基反应体系为哌啶和二氯甲烷（DCM）。

19、的混合物，脱 Boc 保护基反应体系为三氟乙酸和二氯甲烷（DCM）的混合物； 0040 步骤（2）中，缩合反应温度为 5-40，反应时间为 4-16h ；脱保护基反应温度为 5-40；反应时间为 0.5-2h ；所述缩合反应体系中还包括 1- 羟基苯并三唑（HOBt）、 N， N- 二异丙基乙胺（DIPEA）和苯并三氮唑 -N,N,N,N - 四甲基脲六氟磷酸盐（HBTU）的混合物，所述脱保护基反应体系中还包括哌啶和二氯甲烷（DCM）的混合物； 0041 步骤（3）中，缩合反应温度为 5-40，反应时间为 4-16h ；脱保护基反应温度为。

20、5-40；反应时间为 3-7h ；所述缩合反应体系中还包括 HOBt、 DIPEA 和 HBTU 的混合物，所述脱保护基反应体系中为三氟乙酸和二氯甲烷（DCM）的混合物。 0042 本发明还提供了双环醇 - 谷胱甘肽缀合物在制备治疗肝病损伤药物或抗肝炎药物中的应用。药理实验表明该化合物能显著减轻 D- 氨基半乳糖胺诱导的大鼠急性肝损伤程度。 0043 有益效果：本发明提供的双环醇 - 谷胱甘肽缀合物抗病毒活性强、水溶性好、口服利用率高。双环醇具有显著的保肝降酶和一定的抗病毒能力，同时谷胱甘肽也是保肝类药物，以双环醇为基本结构与谷胱甘肽缀合。该缀合物既克服了双环。

21、醇水溶性不好的缺陷，同时药理实验表明该化合物抗病毒活性强、水溶性好、口服利用率高。 0044 本发明提供的双环醇 - 谷胱甘肽缀合物的制备方法将双环醇羟基与谷胱甘肽的一个羧基以酯键相连得双环醇 - 谷胱甘肽缀合物或将带保护的甘氨酸、半胱氨酸、谷氨酸依次接到双环醇上，操作简便、成本低、收率高。具体实施方式 0045 根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。 0046 实施例 1 双环醇 - 谷胱甘肽缀合物的制备。 0。

22、047 （1）谷胱甘肽巯基的保护 0048 谷胱甘肽 (5g,16.27mmol) 加入 50mL DMF 中，再加入 Mmt-Cl(5.6g,18.1mmol)，室温搅拌反应 12h。蒸干反应液，用二氯甲烷、石油醚重结晶，过滤，得 7.1g 白色固体，即化合物 12。M-H-=578.1。 0049 说明书 CN 102911251 A 8 6/15 页 9 0050 （2）巯基保护的谷胱甘肽位羧基和氨基的共保护 0051 将化合物 12(5.95g,10mmol) 溶于 50mL THF 中，氮气保护，加入 20mL 1mol/L 的 Et3B(20mmol。

23、) 溶液，反应 15h。蒸干反应液，用乙腈、二氯甲烷重结晶，过滤，得（6.50） g 白色固体，即为化合物 13。 0052 0053 （3）酯化反应 0054 称取 1.99g 化合物 13(3.0mmol) 溶于 20mL DCM 中 , 冰浴冷却，加入 40mg 4- 二甲氨基吡啶（DMAP）和 750mg1-(3- 二甲基氨基丙基 )-3- 乙基碳化二亚胺盐酸盐（EDCHCl） (3.9mmol)，搅拌 10min，加入 1.17g 双环醇 (3.0mmol)，反应 6h。反应液中加入 100mL DCM，依次用 1mol/L HCl、饱和碳酸氢钠。

24、水溶液、饱和氯化钠水溶液洗涤，干燥，硅胶柱梯度洗脱，流动相为PE:EA=4:1-1:1，得白色固体2.82g，即为保护的双环醇-谷胱甘肽缀合物14， HPLC 分析纯度大于 98，收率为 90。 0055 0056 （4）脱保护基反应说明书 CN 102911251 A 9 7/15 页 10 0057 称取 1.03g 保护的双环醇 - 谷胱甘肽缀合物 14(1.0mmol) 溶于 20mL DCM，加入 0.7mL 三异丙基硅烷，通入 HCl 气体，室温反应 1-2h，浓缩，加入乙醚，析出白色固体， DCM 洗涤，过滤，得固体 530mg，即为双环。

25、醇 - 谷胱甘肽缀合物。 0058 MS(ESI+)m/z:680.2M+H+。产率 78。 0059 反应式如下： 0060 实施例 2 双环醇 - 谷胱甘肽缀合物的制备。 0061 （1）谷胱甘肽巯基的保护 0062 取 10mmol 谷胱甘肽加入 50mL DMF 中，再加入 12mmol Mob-Cl， 5搅拌反应 24h。蒸干反应液，用二氯甲烷、石油醚重结晶，过滤，得白色固体，即巯基保护的谷胱甘肽。 0063 （2）谷胱甘肽位羧基和氨基的共保护 0064 取5mmol巯基保护的谷胱甘肽溶于50mL THF中，氮气保护，加入5mmol的Et3B， 5 反应 2。

26、0h。蒸干反应液，用乙腈、二氯甲烷重结晶，过滤，得白色固体，即为保护的谷胱甘肽。 0065 （3）酯化反应 0066 称取 3mmol 保护的谷胱甘肽溶于 20mL DCM 中 , 冰浴冷却，加入 40mg 4- 二甲氨基吡啶（DMAP）和 750mg1-(3- 二甲基氨基丙基 )-3- 乙基碳化二亚胺盐酸盐（EDCHCl） (3.9mmol)，搅拌 10min，加入 2.4mmol 双环醇， 5反应 10h。反应液中加入 100mLDCM，依次用 1mol/L HCl、饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液洗涤，干燥，硅胶柱梯度洗脱，流动相为 PE:EA。

27、=4:1-1:1，得白色固体，即为保护的双环醇 - 谷胱甘肽缀合物。 0067 （4）脱保护基反应 0068 称取 1mmol 保护的双环醇 - 谷胱甘肽缀合物溶于 10mL DCM 中，加入 0.7mL 三异丙基硅烷，通入 HCl 气体， 5反应 2h，浓缩，加入乙醚，析出白色固体， DCM 洗涤，过滤，即为双环醇 - 谷胱甘肽缀合物。 0069 实施例 3 双环醇 - 谷胱甘肽缀合物的制备。 0070 （1）谷胱甘肽巯基的保护 0071 取 10mmol 谷胱甘肽加入 50mL DMF 中，再加入 12mmol Tmb-Cl， 40搅拌反应 2h。蒸干反应液，。

28、用二氯甲烷、石油醚重结晶，过滤，得白色固体，即为巯基保护的谷胱甘肽。 0072 （2）谷胱甘肽位羧基和氨基的共保护 0073 取 5mmol 巯基保护的谷胱甘肽溶于 50mL THF 中，氮气保护，加入 7.5mmol 的 9- 硼双环 3.3.1 壬烷二聚物 (25mmol) 溶液， 40反应 10h。蒸干反应液，用乙腈、二氯甲烷重结晶，过滤，得白色固体，即为保护的谷胱甘肽。 0074 （3）酯化反应 0075 称取 3mmol 保护的谷胱甘肽溶于 20mL DCM 中 , 冰浴冷却，加入 40mg 4- 二甲氨说明书 CN 102911251 A 。

29、10 8/15 页 11 基吡啶（DMAP）和 750mg1-(3- 二甲基氨基丙基 )-3- 乙基碳化二亚胺盐酸盐（EDCHCl） (3.9mmol)，搅拌 10min，加入 3.6mmol 双环醇， 40反应 4h。反应液中加入 100mLDCM，依次用 1mol/L HCl、饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液洗涤，干燥，硅胶柱梯度洗脱，流动相为 PE:EA=4:1-1:1，得白色固体，即为保护的双环醇 - 谷胱甘肽缀合物。 0076 （4）脱保护基反应 0077 称取 1mmol 保护的双环醇 - 谷胱甘肽缀合物溶于 20mL DCM 中，加入 0.7m。

30、L 三异丙基硅烷，通入HCl气体， 40反应1h，浓缩，加入乙醚，析出白色固体， DCM洗涤，过滤，即为双环醇 - 谷胱甘肽缀合物。 0078 实施例 4 0079 本实施例的制备方法与实施例 1 基本相同，不同之处仅在于：所述巯基保护基为三苯甲基（Trt）。 0080 实施例 5 0081 本实施例的制备方法与实施例 1 基本相同，不同之处仅在于：所述巯基保护基为 4- 甲氧苯基（Dpm）。 0082 实施例 6 双环醇 - 谷胱甘肽缀合物的制备。 0083 （1）双环醇与保护的甘氨酸缩合反应，产物脱保护基，得甘氨酸 - 双环醇缀合物； 0084。

31、（1.1）氨基保护的甘氨酸（Fmoc-Gly-OH）与双环醇缀合 0085 0086 称取 1.0080g Fmoc-Gly-OH(3.3904mmol) 溶于 20mL 二氯甲烷 (DCM) 中 , 冰浴冷却，加入 40mg 4- 二甲氨基吡啶（DMAP）和 750mg 1-(3- 二甲基氨基丙基 )-3- 乙基碳化二亚胺盐酸盐（EDCHCl） (3.9120mmol)，搅拌 10min，加入 1.0118g 双环醇 (2.6080mmol)，反应 6h。反应液中加入 100mL 二氯甲烷 (DCM)，依次用 1mol/L 盐酸溶液、饱和碳酸氢钠水溶液、饱。

32、和氯化钠水溶液洗涤，干燥，硅胶柱梯度洗脱，流动相为 PE:EA=4:1-1:1，得白色固体 1.58g，即为化合物 22， HPLC 分析纯度大于 98，收率为 91。 0087 （1.2）脱甘氨酸氨基 Fmoc 保护基 0088 说明书 CN 102911251 A 11 9/15 页 12 0089 称取 1.0532g 化合物 22（1.5728mmol) 溶于 10mL 50哌啶 /DCM 混合体系中，室温反应 30min， TLC 检测反应完全。加入 50mL 乙酸乙酯，依次用饱和氯化钠溶液、 PH 值为 5.5 磷酸盐缓冲溶液洗涤，干燥，得到淡黄色固体，。

33、即为化合物 23。 0090 （2）甘氨酸 - 双环醇缀合物与保护的半胱氨酸缩合反应，产物脱保护基，得半胱氨酸 - 甘氨酸 - 双环醇缀合物； 0091 （2.1）与保护的半胱氨酸的缩合 0092 0093 称取 1.1996g 化合物 23(2.0446mmol)， 2mmol 保护的半胱氨酸， 276.3mg HOBt(2.0446mmol) 溶于 18mL DMF 中，冰浴冷却，加入 0.8mL DIPEA，搅拌 5min 后，加入 775.4mg HBTU(2.0446mmol)，反应 15min 后，升至室温，反应 12h 后，向反应液。

34、中加入 50mL 乙酸乙酯，依次用 1mol/L HCl、饱和氯化钠水溶液洗涤，干燥，得油状产物。产物过硅胶柱，流动相为 PE:EA=4:1-1:1，得到产物 1.05g，两步反应收率为 66。 0094 （2.2）脱半胱氨酸氨基 Fmoc 保护基 0095 0096 称取0.7567g化合物24(0.7438mmol)溶于10mL 50哌啶/DCM混合体系中，室温反应 30min， TLC 检测反应完全。加入 50mL 乙酸乙酯，依次用饱和氯化钠溶液、 pH 值为 5.5 的磷酸盐缓冲溶液洗涤，干燥，得到淡黄色固体，即为化合物 25。说明书 CN 10291。

35、1251 A 12 10/15 页 13 0097 （3）半胱氨酸 - 甘氨酸 - 双环醇缀合物与保护的谷氨酸缩合反应，产物脱保护基，即得双环醇 - 谷胱甘肽缀合物 0098 （3.1）与保护的谷氨酸缩合 0099 0100 将 270.8mg 化合物 25(0.8926mmol)， 1mmol 保护的谷氨酸和 120.6mg HOBt(0.8926mmol) 溶于 15mL DMF 中，冰浴冷却，加入 0.3mL DIPEA，搅拌 5min 后，加入 338.5mg HBTU(0.8926mmol)，反应 15min 后，升至室温，反应 10h 后，向。

36、反应液中加入 100mL 乙酸乙酯，以此用 1mol/L 盐酸溶液、饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液洗涤，干燥，得红色油状产物。产物过硅胶柱，流动相为 PE:EA=3:1-2:3，得到固体 573mg，即为化合物 26，两步总收率为 72。MS(ESI+)m/z:1100.5M+Na+. 0101 （3.2）全脱保护 0102 0103 称取 340mg 化合物 26(0.315mmol)，加入 7mL 三氟乙酸， 0.7mL 三异丙基硅烷，室温反应 5h，浓缩，加入乙醚，析出白色固体， DCM 洗涤，过滤，得固体 151mg，即为双环醇 - 谷胱甘。

37、肽缀合物，产率为 70.5。 0104 1H-NMR(500MHz， DMSO):7.27(s,1H,ArH);6.72(s,1H,ArH);5.91-6.10(m,4H,OC H2O);4.41-4.43(m,3H,ArCH2O and CH);3.97(s,2H,CH2);3.94(s,3H,-OCH3);3.83(s,3H,-O CH3);3.62(s,3H,-COOCH3);3.36(s,1H,CH);3.19(dd,1H,CH2);2.94(dd,1H,CH2); 0105 2.34(m,2H,CH2);2.02(m,2H,CH), 0106 MS(ESI+)m/z:680.2M+。

38、H+。 0107 实施例 7 双环醇 - 谷胱甘肽缀合物的制备。 0108 （1）双环醇与保护的甘氨酸缩合反应，产物脱保护基，得甘氨酸 - 双环醇缀合物； 0109 （1.1）氨基保护的甘氨酸（Boc-Gly-OH）与双环醇缀合 0110 取 10mmol Boc-Gly-OH 溶于 20mL 二氯甲烷 (DCM) 中 , 冰浴冷却，加入 1mmol 4- 二甲氨基吡啶（DMAP）和 1mmol1-(3- 二甲基氨基丙基 )-3- 乙基碳化二亚胺盐酸盐（EDC HCl），搅拌 10min，加入 20mmol 双环醇， 40反应 4h。反应液中加入 100mL 二氯甲烷。

39、说明书 CN 102911251 A 13 11/15 页 14 (DCM)，依次用 1mol/L 盐酸溶液、饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液洗涤，干燥，硅胶柱梯度洗脱，流动相为 PE:EA=4:1-1:1，得白色固体，即为保护的甘氨酸 - 双环醇缀合物。 0111 （1.2）脱甘氨酸氨基 Boc 保护基 0112 取 6mmol 保护的甘氨酸 - 双环醇缀合物溶于 10mL TFA/DCM 混合体系中，室温反应 0.5h， TLC 检测反应完全。旋干，乙醚洗涤，干燥，得到淡黄色固体，即为甘氨酸 - 双环醇缀合物。 0113 （2）甘氨酸 - 双环醇。

40、缀合物与保护的半胱氨酸缩合反应，产物脱保护基，得半胱氨酸 - 甘氨酸 - 双环醇缀合物； 0114 （2.1）与保护的半胱氨酸 Fmoc-Cys(Mob)-OH 的缩合 0115 称取 5mmol 甘氨酸 - 双环醇缀合物、 10mmol 保护的半胱氨酸 Fmoc-Cys(Mob)-OH、 1mmol HOBt溶于18mL DMF中，冰浴冷却，加入0.8mL DIPEA，搅拌5min后，加入1mmol HBTU， 40反应 4h 后，向反应液中加入 50mL 乙酸乙酯，依次用 1mol/L HCl、饱和氯化钠水溶液洗涤，干燥，得油状产物。产物过硅胶柱，流动相为。

41、PE:EA=4:1-1:1，得保护的半胱氨酸 - 甘氨酸 - 双环醇缀合物。 0116 （2.2）脱半胱氨酸氨基 Fmoc 保护基 0117 取3mmol保护的半胱氨酸-甘氨酸-双环醇缀合物溶于10mL 50哌啶/DCM混合体系中， 40反应 0.5h， TLC 检测反应完全。加入 50mL 乙酸乙酯，依次用饱和氯化钠溶液、 pH 值为 5.5 的磷酸盐缓冲溶液洗涤，干燥，得到淡黄色固体，即为半胱氨酸 - 甘氨酸 - 双环醇缀合物。 0118 （3）半胱氨酸 - 甘氨酸 - 双环醇缀合物与保护的谷氨酸缩合反应，产物脱保护基，即得双环醇 - 谷胱甘肽缀合物 0119 （3。

42、.1）与保护的谷氨酸 Boc-Glu-OtBu 缩合 0120 将 2mmol 半胱氨酸 - 甘氨酸 - 双环醇缀合物、 4mmol 保护的谷氨酸和 1mmol HOBt 溶于 15mL DMF 中，冰浴冷却，加入 0.3mL DIPEA，搅拌 5min 后，加入 1mmol HBTU，反应 15min 后， 40反应 4h，向反应液中加入 100mL 乙酸乙酯，以此用 1mol/L 盐酸溶液、饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液洗涤，干燥，得红色油状产物。产物过硅胶柱，流动相为 PE:EA=3:1-2:3，得保护的双环醇 - 谷胱甘肽缀合物。 0121 （3.2。

43、）全脱保护 0122 取 1mmol 保护的双环醇 - 谷胱甘肽缀合物，加入 7mL 三氟乙酸， 0.7mL 三异丙基硅烷， 40反应 3h，浓缩，加入乙醚，析出白色固体， DCM 洗涤，过滤，得双环醇 - 谷胱甘肽缀合物。 0123 实施例 8 双环醇 - 谷胱甘肽缀合物的制备。 0124 （1）双环醇与保护的甘氨酸缩合反应，产物脱保护基，得甘氨酸 - 双环醇缀合物； 0125 （1.1）氨基保护的甘氨酸（Fmoc-Gly-OH）与双环醇缀合 0126 取 20mmol Fmoc-Gly-OH 溶于 20mL 二氯甲烷 (DCM) 中 , 冰浴冷却，加入 1。

44、mmol 4- 二甲氨基吡啶（DMAP）和 1mmol1-(3- 二甲基氨基丙基 )-3- 乙基碳化二亚胺盐酸盐（EDC HCl），搅拌 10min，加入 10mmol 双环醇， 5反应 16h。反应液中加入 100mL 二氯甲烷 (DCM)，依次用 1mol/L 盐酸溶液、饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液洗涤，干燥，硅胶柱梯度洗脱，流动相为 PE:EA=4:1-1:1，得白色固体，即为保护的甘氨酸 - 双环醇缀合物。说明书 CN 102911251 A 14 12/15 页 15 0127 （1.2）脱甘氨酸氨基保护基 0128 取8mmol保护的甘氨。

45、酸-双环醇缀合物溶于10mL 50哌啶/DCM混合体系中， 5 反应 2h， TLC 检测反应完全。加入 50mL 乙酸乙酯，依次用饱和氯化钠溶液、 PH 值为 5.5 磷酸盐缓冲溶液洗涤，干燥，得到淡黄色固体，即为甘氨酸 - 双环醇缀合物。 0129 （2）甘氨酸 - 双环醇缀合物与保护的半胱氨酸缩合反应，产物脱保护基，得半胱氨酸 - 甘氨酸 - 双环醇缀合物； 0130 （2.1）与保护的半胱氨酸 Fmoc-Cys(Mmt)-OH 的缩合 0131 称取 6mmol 甘氨酸 - 双环醇缀合物、 3mmol 保护的半胱氨酸、 1mmol HOBt 溶于 18mLDMF 。

46、中，冰浴冷却，加入 0.8mL DIPEA，搅拌 5min 后，加入 1mmol HBTU， 5反应 16h 后，向反应液中加入 50mL 乙酸乙酯，依次用 1mol/L HCl、饱和氯化钠水溶液洗涤，干燥，得油状产物。产物过硅胶柱，流动相为 PE:EA=4:1-1:1，得保护的半胱氨酸 - 甘氨酸 - 双环醇缀合物。 0132 （2.2）脱半胱氨酸氨基保护基 0133 取3mmol保护的半胱氨酸-甘氨酸-双环醇缀合物溶于10mL 50哌啶/DCM混合体系中， 5反应 2h， TLC 检测反应完全。加入 50mL 乙酸乙酯，依次用饱和氯化钠溶液、 pH 值为 5。

47、.5 的磷酸盐缓冲溶液洗涤，干燥，得到淡黄色固体，即为半胱氨酸 - 甘氨酸 - 双环醇缀合物。 0134 （3）半胱氨酸 - 甘氨酸 - 双环醇缀合物与保护的谷氨酸缩合反应，产物脱保护基，即得双环醇 - 谷胱甘肽缀合物 0135 （3.1）与保护的谷氨酸 Boc-Glu-OtBu 缩合 0136 将 3mmol 半胱氨酸 - 甘氨酸 - 双环醇缀合物、 1.5mmo 保护的谷氨酸和 1mmol HOBt 溶于 15mL DMF 中，冰浴冷却，加入 0.3mL DIPEA，搅拌 5min 后，加入 1mmol HBTU，反应 15min 后， 5反应 16h，向反应液。

48、中加入 100mL 乙酸乙酯，以此用 1mol/L 盐酸溶液、饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液洗涤，干燥，得红色油状产物。产物过硅胶柱，流动相为 PE:EA=3:1-2:3，得保护的双环醇 - 谷胱甘肽缀合物。 0137 （3.2）全脱保护 0138 取 1mmol 保护的双环醇 - 谷胱甘肽缀合物，加入 7mL 三氟乙酸， 0.7mL 三异丙基硅烷， 5反应 7h，浓缩，加入乙醚，析出白色固体， DCM 洗涤，过滤，得双环醇 - 谷胱甘肽缀合物。 0139 实施例 9 0140 本实施例的制备方法与实施例 6 基本相同，不同之处仅在于：所述保护的半胱氨酸为 Fmoc-Cys(Tmb)-OH。 0141 实施例 10 0142 本实施例的制备方法与实施例 6 基本相同，不同之处仅在于：所述保护的半胱氨酸为 Fmoc-Cys(Dpm)-OH。 0143 实施例 11 双环醇 - 谷胱甘肽缀合物对大鼠 D- 氨基半乳糖胺肝损伤模型的影响。 0144 1. 实验材料 0145 1.1 动物 0146 SPF 级 SD 大鼠，体重 180g 220g，雌雄各半，由南京军区总医院。

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