一种盐酸小檗碱靶向纳米制剂及其制备方法和应用技术领域
本发明涉及生物制药技术领域，尤其涉及一种盐酸小檗碱靶向纳米制剂及其制备
方法和应用。
背景技术
盐酸小檗碱(Berberine hydrochloride，BH)是一种天然生物碱，已知的药理活性
包括抗炎、抗胆碱能、抗菌、抗高血压、抗氧化应激和抗包括鼻咽癌在内的多种类型肿瘤。
盐酸小檗碱作为抗肿瘤制剂应用于临床治疗各种晚期癌症的研究受到越来越多
关注，但盐酸小檗碱为季胺盐类生物碱，稳定性差，药物剂型及给药方式大多以片剂、静脉
滴注为主，易被胃肠道中的黏蛋白吸附而影响吸收，生物利用度低，难以达到其发挥药理作
用的有效浓度；剂量增大又易引起过敏性休克、药疹等不良反应，临床应用受到很大限制。
发明内容
本发明的目的在于提供一种盐酸小檗碱靶向纳米制剂及其制备方法和应用。本发
明的纳米制剂提升了盐酸小檗碱的稳定性和生物利用度，给药剂量、毒副作用低，对肿瘤组
织的靶向性高，缓控释性好。
本发明提供了一种盐酸小檗碱靶向纳米制剂，包括偶联叶酸的壳聚糖或其衍生物
纳米粒子，包覆在所述纳米粒子表面的盐酸小檗碱。
优选的是，所述偶联叶酸的壳聚糖或其衍生物纳米粒子与盐酸小檗碱的质量比为
1：(0.8～3)。
优选的是，所述纳米粒子的粒径为200～450nm。
优选的是，所述壳聚糖或其衍生物包括壳聚糖、壳聚糖季铵盐和羧甲基壳聚糖中
的一种。
本发明还提供了上述技术方案所述纳米制剂的制备方法，包括以下步骤：
1)将盐酸小檗碱溶解于无水乙醇中，得到盐酸小檗碱无水乙醇溶液；
2)将叶酸活性酯与壳聚糖或其衍生物在溶液体系中进行偶联反应，冷冻干燥后得
到叶酸-壳聚糖冻干粉；
3)将所述步骤2)得到的叶酸-壳聚糖冻干粉溶于醋酸溶液，得到叶酸-壳聚糖溶
液；
将所述叶酸-壳聚糖溶液与所述步骤1)中盐酸小檗碱无水乙醇溶液混合，向得到
的混合溶液中滴加三聚磷酸钠溶液，进行交联反应25～40min，得到盐酸小檗碱靶向纳米制
剂；
所述步骤1)和步骤2)之间没有时间顺序限制。
优选的是，所述步骤1)中盐酸小檗碱无水乙醇溶液的浓度为0.3～1g/L；
所述步骤3)中叶酸-壳聚糖溶液的浓度为0.2～1.2g/L。
优选的是，所述步骤3)中盐酸小檗碱无水乙醇溶液与三聚磷酸钠溶液的体积比为
1：(0.5～5)。
优选的是，所述步骤3)中的三聚磷酸钠溶液的浓度为0.3～0.8g/L。
本发明还提供了上述技术方案所述纳米制剂或上述技术方案所述制备方法制备
得到的纳米制剂在制备靶向肿瘤药物中的应用。
优选的是，所述药物为靶向治疗鼻咽癌的肿瘤药物。
本发明提供了一种盐酸小檗碱靶向纳米制剂，包括偶联叶酸的壳聚糖或其衍生物
纳米粒子，包覆在所述纳米粒子表面的盐酸小檗碱。通过将盐酸小檗碱包覆在所述纳米粒
子上，得到的纳米制剂临床稳定性高，能够实现对肿瘤组织的靶向性和缓控释性，生物利用
度高，且给药剂量、毒副作用低。实施例结果也表明：本申请制备得到的盐酸小檗碱靶向纳
米制剂形态圆整、大小均一；包封率和载药量分别达到(89.82±2.91)％和(9.16±1.01)％
(n＝3)；体内释放效果高，24h内累积释放分别为(90.92±5.21)％；盐酸小檗碱靶向纳米制
剂对细胞的抑制作用强、细胞凋亡率高。
附图说明
图1是本发明盐酸小檗碱靶向纳米制剂的合成原理图；
图2是本发明实施例1提供的叶酸-壳聚糖偶联产物、壳聚糖和叶酸的红外光谱图；
图3是本发明实施例4提供的盐酸小檗碱靶向纳米制剂的透射电镜图；
图4是本发明实施例4提供的盐酸小檗碱靶向纳米制剂的平均粒径分布；
图5是本发明实施例4提供的盐酸小檗碱靶向纳米制剂的Zeta电位图；
图6是本发明实施例6提供的盐酸小檗碱靶向纳米制剂的体外释放结果图；
图7是本发明实施例7提供的MTT法测定24h和48h时盐酸小檗碱靶向纳米制剂对
CNE-1的增殖抑制作用图；
图8是本发明实施例8提供的盐酸小檗碱靶向纳米制剂对CNE-1细胞迁移能力的影
响结果图；
图9是本发明实施例9提供的盐酸小檗碱靶向纳米制剂诱导的CNE-1细胞凋亡图。
具体实施方式
本发明提供了一种盐酸小檗碱靶向纳米制剂，包括偶联叶酸的壳聚糖或其衍生物
纳米粒子，包覆在所述纳米粒子表面的盐酸小檗碱。
在本发明中，所述偶联叶酸的壳聚糖或其衍生物纳米粒子与盐酸小檗碱的质量比
优选为1：(0.8～3)，更优选为1：1。
在本发明中，所述纳米粒子的粒径优选为200～450nm，更优选为250～300nm，最优
选为268nm。
在本发明中，所述壳聚糖或其衍生物包括壳聚糖、壳聚糖季铵盐和羧甲基壳聚糖
中的一种。本发明对所述壳聚糖、壳聚糖季铵盐和羧甲基壳聚糖的来源没有特殊的限定，采
用本领域技术人员熟知的壳聚糖、壳聚糖季铵盐和羧甲基壳聚糖的市售产品即可。
在本发明中，所述包覆层的厚度优选为100～300nm，更优选为150nm。所述包覆过
程为盐酸小檗碱在三聚磷酸钠的交联作用下与偶联叶酸的壳聚糖或其衍生物纳米粒子交
联，得到盐酸小檗碱靶向纳米制剂。
本发明还提供了上述技术方案所述纳米制剂的制备方法，包括以下步骤：
1)将盐酸小檗碱溶解于无水乙醇中，得到盐酸小檗碱无水乙醇溶液；
2)将叶酸活性酯与壳聚糖或其衍生物在溶液体系中进行偶联反应，冷冻干燥后得
到叶酸-壳聚糖冻干粉；
3)将所述步骤2)得到的叶酸-壳聚糖冻干粉溶于醋酸溶液，得到叶酸-壳聚糖溶
液；
将所述叶酸-壳聚糖溶液与所述步骤1)中盐酸小檗碱无水乙醇溶液混合，向得到
的混合溶液中滴加三聚磷酸钠溶液，进行交联反应25～40min，得到盐酸小檗碱靶向纳米制
剂；
所述步骤1)和步骤2)之间没有时间顺序限制。
所述盐酸小檗碱靶向纳米制剂的合成原理图如图1所示，其中FA-CTS表示叶酸-壳
聚糖偶联产物，BH/FA-CTS-NPs表示盐酸小檗碱靶向纳米制剂，TPP为三聚磷酸钠。
本发明将盐酸小檗碱溶解于无水乙醇中，得到盐酸小檗碱无水乙醇溶液。在本发
明中，所述溶解方式包括超声溶解或搅拌溶解，为了使盐酸小檗碱完全分散溶解。本发明对
所述超声和搅拌的条件没有特殊的限定，能够使盐酸小檗碱完全溶解即可。本发明对所述
盐酸小檗碱的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的盐酸小檗碱的市售产品即
可，如购自北京华清美恒天然产物技术开发有限公司的盐酸小檗碱。在本发明中，所述盐酸
小檗碱无水乙醇溶液的浓度优选为0.3～1g/L，更优选为0.5g/L。
本发明将叶酸活性酯与壳聚糖或其衍生物在溶液体系中进行偶联反应，冷冻干燥
后得到叶酸-壳聚糖冻干粉。在本发明中，所述叶酸活性酯与壳聚糖的用量比优选为(0.9～
2.5)：1，更优选为1:1。本发明对所述叶酸活性酯的来源没有特殊的限定，采用本领域技术
人员熟知的叶酸活性酯的制备方法即可，具体优选为：如将三乙胺加入DMSO中混合，加入叶
酸避光搅拌过夜，得到叶酸溶液；将DCC和NHS溶解在DMSO中，与上述叶酸溶液混合后避光搅
拌过夜；随后加入冰乙酸，继续反应3～6h后，除去多余DCC，静置冷藏0.5～1.5h，抽滤并收
集滤液得到叶酸活性酯。
在本发明中，所述三乙胺与DMSO的体积比优选为1：(8～12)，更优选为1：10；所述
叶酸与DMSO的质量体积比优选为1：(0.8～1.5)mg/mL，更优选为1：1mg/mL；所述DCC与DMSO
的质量体积比优选为(2～3)：1mg/mL，更优选为2.5：1mg/mL；所述NHS与DMSO的质量体积比
优选为(1～2)：1mg/mL，更优选为1.25：1mg/mL；所述混有DCC和NHS的DMSO溶液与叶酸溶液
的体积比优选为(1～3)：1，更优选为1：1；所述冰乙酸的添加量为3～6％，更优选为5％。
本发明对叶酸活性酯和壳聚糖或其衍生物的偶联反应没有特殊的限定，采用本领
域技术人员熟知的叶酸活性酯与壳聚糖上的氨基反应，制得叶酸偶联壳聚糖即可，具体优
选为：如将壳聚糖或其衍生物溶于醋酸，调节溶液pH值至5.5～6.8，更优选为6.0，得到壳聚
糖溶液；将叶酸活性酯溶于DMSO，得到叶酸活性酯溶液；将壳聚糖溶液滴加到叶酸活性酯溶
液中进行偶联反应，得到叶酸-壳聚糖偶联产物。
在本发明中，所述壳聚糖溶液的浓度优选为1.5～4mg/mL，更优选为2mg/mL，所述
叶酸活性酯的浓度优选为3～6mg/mL，更优选为5mg/mL，所述偶联反应优选在避光条件下进
行，搅拌转速优选为750～900r/min，更优选为800r/min，反应温度优选为10～25℃，更优选
为20℃。
所述偶联反应后，本发明将得到叶酸-壳聚糖偶联产物进行冷冻干燥，得到叶酸-
壳聚糖冻干粉。本发明冷冻干燥前优选将叶酸-壳聚糖的pH调为8.5～9.2，更优选为9.0。本
发明对所述冷冻干燥条件没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的冷冻干燥条件即
可。
得到叶酸-壳聚糖冻干粉后，本发明将所述叶酸-壳聚糖冻干粉溶于醋酸溶液，得
到叶酸-壳聚糖溶液。在本发明中，所述醋酸的作用为使叶酸-壳聚糖冻干粉充分溶解，所述
醋酸溶液的浓度优选为0.5～12％，更优选为1％。在本发明中，所述所述叶酸-壳聚糖溶液
的浓度优选为0.2～1.2g/L，更优选为1g/L。
得到叶酸-壳聚糖溶液和盐酸小檗碱无水乙醇溶液后，本发明将两溶液混合，向得
到的混合溶液中滴加三聚磷酸钠溶液，进行交联反应25～40min，得到盐酸小檗碱靶向纳米
制剂。在本发明中，所述交联反应过程优选在搅拌的条件下进行，交联反应时间更优选为
30min。所述交联反应的温度优选为10～25℃，更优选为15℃。本发明所述三聚磷酸钠主要
起交联作用。
在本发明中，所述三聚磷酸钠溶液的浓度优选为0.3～0.8g/L，更优选为0.5g/L。
在本发明中，所述步骤3)中盐酸小檗碱无水乙醇溶液与三聚磷酸钠溶液的体积比
优选为1：(0.5～2)，更优选为1：1。
本发明还提供了上述技术方案所述纳米制剂和上述技术方案所述制备方法制备
得到的纳米制剂在制备靶向肿瘤药物中的应用。
在本发明中，所述药物优选为靶向治疗鼻咽癌的肿瘤药物。
下面结合实施例，对本发明提供的盐酸小檗碱靶向纳米制剂及其制备方法和应用
进行详细的描述，但是不能将它们理解为对本申请保护范围的限定。
实施例1
叶酸活性酯的制备
取1mL三乙胺加入12mL DMSO中混合均匀，加入0.8mg叶酸避光搅拌过夜。次日，将
30mg DCC和10mg NHS溶解在10mL DMSO中，两溶液混合后暗处搅拌过夜。随后加入6％冰乙
酸，继续反应5h以除去多余DCC，静置冷藏1h，抽滤并收集滤液所得即为叶酸活性酯。
叶酸壳聚糖冻干粉的制备
称取75mg壳聚糖溶于50mL 1％的醋酸溶液中，逐滴滴加4.0mol/L的NaOH将溶液的
pH调到6.2。磁力搅拌下缓慢加入得到的叶酸活性酯的DMSO溶液，室温下避光搅拌过夜，得
到叶酸-壳聚糖偶联产物。反应结束后用4mol/L的NaOH溶液调节pH至8.5，离心并用蒸馏水
洗涤数遍，冷冻干燥，得到淡黄色固体粉末即为叶酸-壳聚糖冻干粉。
盐酸小檗碱靶向纳米制剂的制备
将叶酸-壳聚糖冻干粉溶于1.5％醋酸溶液中得0.8g/L叶酸-壳聚糖溶液。称取1mg
盐酸小檗碱溶于1ml无水乙醇中，超声至完全溶解，得盐酸小檗碱无水乙醇溶液。将两者混
合，室温持续搅拌下，缓慢加入三聚磷酸钠溶液，搅拌25min，得到盐酸小檗碱靶向纳米制
剂。
利用傅里叶变换红外光谱仪，将冷冻干燥的叶酸-壳聚糖偶联产物置于室温下KBr
压片。同样分别制备叶酸和壳聚糖样品作对比。叶酸-壳聚糖偶联产物、叶酸和壳聚糖的红
外光谱图如图2所示。叶酸-壳聚糖偶联产物是以壳聚糖分子链上质子化的氨基与叶酸分子
结构上脱质子化的羧基之间利用静电作用结合在一起。图中叶酸-壳聚糖偶联产物曲线上1
605、1 462cm-1出现类似芳环骨架伸缩导致的振动峰波，说明叶酸与壳聚糖偶联成功。叶酸
的1 706cm-1羰基峰(-COOH)消失可以说明壳聚糖中的氨基与叶酸分子的羧基是静电作用相
互结合在一起。
实施例2
叶酸活性酯的制备
取1mL三乙胺加入8mL DMSO中混合均匀，加入8mg叶酸避光搅拌过夜。次日，将16mg
DCC和12mg NHS溶解在8mL DMSO中，两溶液混合后暗处搅拌过夜。随后加入3％冰乙酸，继续
反应3h以除去多余DCC，静置冷藏1.5h，抽滤并收集滤液所得即为叶酸活性酯。
叶酸壳聚糖冻干粉的制备
称取150mg壳聚糖溶于50mL 5％的醋酸溶液中，逐滴滴加6.0mol/L的NaOH将溶液
的pH调到5.8。磁力搅拌下缓慢加入得到的叶酸活性酯的DMSO溶液，室温下避光搅拌过夜，
得到叶酸-壳聚糖偶联产物。反应结束后用6mol/L的NaOH溶液调节pH至9.2，离心并用蒸馏
水洗涤数遍，冷冻干燥，得到淡黄色固体粉末即为叶酸-壳聚糖冻干粉。
盐酸小檗碱靶向纳米制剂的制备
将叶酸-壳聚糖冻干粉溶于5％醋酸溶液中得1.2g/L叶酸-壳聚糖溶液。称取0.6mg
盐酸小檗碱溶于1ml无水乙醇中，超声至完全溶解，得盐酸小檗碱无水乙醇溶液。将两者混
合，室温持续搅拌下，缓慢加入三聚磷酸钠溶液，搅拌40min，得到盐酸小檗碱靶向纳米制
剂。
实施例3
叶酸活性酯的制备
取1mL三乙胺加入10mL DMSO中混合均匀，加入10mg叶酸避光搅拌过夜。次日，将
25mg DCC和12.5mg NHS溶解在10mL DMSO中，两溶液混合后暗处搅拌过夜。随后加入5％冰
乙酸，继续反应4h以除去多余DCC，静置冷藏0.5h，抽滤并收集滤液所得即为叶酸活性酯。
叶酸壳聚糖冻干粉的制备
称取100mg壳聚糖溶于50mL 10％的醋酸溶液中，逐滴滴加10.0mol/L的NaOH将溶
液的pH调到6.0。磁力搅拌下缓慢加入得到的叶酸活性酯的DMSO溶液，室温下避光搅拌过
夜，得到叶酸-壳聚糖偶联产物。反应结束后用10mol/L的NaOH溶液调节pH至9.0，离心并用
蒸馏水洗涤数遍，冷冻干燥，得到淡黄色固体粉末即为叶酸-壳聚糖冻干粉。
盐酸小檗碱靶向纳米制剂的制备
将叶酸-壳聚糖冻干粉溶于1％醋酸溶液中得1g/L叶酸-壳聚糖溶液。称取0.5mg盐
酸小檗碱溶于1ml无水乙醇中，超声至完全溶解，得盐酸小檗碱无水乙醇溶液。将两者混合，
室温持续搅拌下，缓慢加入三聚磷酸钠溶液，搅拌30min，得到盐酸小檗碱靶向纳米制剂。
壳聚糖代替叶酸-壳聚糖偶联产物后，同样的方法制备盐酸小檗碱-壳聚糖纳米制
剂。
实施例4
盐酸小檗碱靶向纳米制剂的形态学特征及粒径分布
将实施例3制备得到盐酸小檗碱靶向纳米制剂进行形态学和粒径分布研究。室温
下透射电镜(TEM)观察其形态，使用激光粒度分析仪测定其平均粒径、Zeta电位和粒径分散
指数(PDI)。所制得的盐酸小檗碱靶向纳米制剂形态圆整、大小均一，为球类粒子(盐酸小檗
碱靶向纳米制剂的透射电镜图如图3所示)，平均粒径为(282.4±4.5)nm(n＝6)(盐酸小檗
碱靶向纳米制剂的平均粒径分布如图4所示)，Zeta电位为(-17.3±1.2)mV(n＝6)(盐酸小
檗碱靶向纳米制剂的Zeta电位图如图5所示)，PDI为0.043±0.016(n＝6)，粒度分布均匀呈
单峰。
表1正交试验设计及结果
表2方差分析
F0.05(2,2)＝19.00 F0.01(2,2)＝99.00
实施例5
实施例3制得的盐酸小檗碱靶向纳米制剂包封率、载药量的测定
盐酸小檗碱特征吸收波长的选择
称取盐酸小檗碱对照品适量，蒸馏水溶解后紫外分光光度仪在200～800nm进行扫
描，得最大吸收波长在421nm处。
标准曲线的绘制
用蒸馏水配制0.5g/L的盐酸小檗碱标准溶液储备液。分别精密移取上述储备液
0.2、0.6、0.8、1.0、1.4、1.8mL，移入50mL量瓶中定容，即得质量浓度为2.0、6.0、8.0、10.0、
14.0、18.0mg/L的标准溶液供试液。在421nm波长处分别测定不同质量浓度盐酸小檗碱供试
液的吸光度(A)值，以A值对质量浓度进行线性回归，回归方程为A＝0.013 8C+0.015 2(R2
＝0.9996，n＝3)，当盐酸小檗碱质量浓度在2.21～19.31μg/mL时，线性关系良好。
盐酸小檗碱载药纳米粒的包封率、载药量的测定
将制备的盐酸小檗碱靶向纳米制剂水分散体系，在5000r/min超速离心20min。收
集上清，定容至50mL量瓶中，通过紫外可见光光度计测定421nm下的吸光度(A)值，带入标准
曲线计算游离盐酸小檗碱的量。盐酸小檗碱包封率与载药量分别按下式计算，结果包封率
和载药量分别为(89.82±2.91)％和(9.16±1.01)％(n＝3)。
包封率＝(盐酸小檗碱总量－游离盐酸小檗碱的量)/盐酸小檗碱总量
载药量＝(盐酸小檗碱总量－游离盐酸小檗碱的量)/纳米粒子的量
实施例6
实施例3制得的盐酸小檗碱靶向纳米制剂中盐酸小檗碱的体外释放
取盐酸小檗碱靶向纳米制剂悬液于透析袋中，采用转篮法测盐酸小檗碱的体外释
放。转速50r/min，温度(37.0±0.5)℃。释放介质：PBS缓冲液(pH 7.4)。间歇收集释放液
2mL，同时补充等量的释放介质。将收集的释放液稀释，其中盐酸小檗碱的定量测定方法见
实施例5。A值均以未载药微球同样条件下的释放介质为参比。盐酸小檗碱靶向纳米制剂的
体外释放(n＝3)结果见图6，可以看出盐酸小檗碱靶向纳米制剂中盐酸小檗碱有很好的缓
控释作用。盐酸小檗碱在最初的几小时内有一个快速释放，0.5h内累积释放分别为(32.91
±3.91)％，5h内累积释放为(80.32±3.24)％，吸附于纳米粒表面的药物释放有利于药物
的快速起效；中期的5h至24h间接近匀速释放，24h内累积释放分别为(90.92±5.21)％，说
明包裹在纳米粒内部的盐酸小檗碱通过纳米粒中孔隙的扩散；24h后释放非常缓慢，25h后
释放基本结束。
为了进一步探讨盐酸小檗碱纳米粒体外释放机制，采用Higuchi方程拟合其体外
释放曲线后发现，盐酸小檗碱靶向纳米制剂的体外释放标准曲线为Y＝0.653 5X+47.169，
R2＝0.3786，表明盐酸小檗碱从固体骨架剂载药体系中非匀速释放，遵循单位面积的释放
量与时间的平方根成直线关系，具有较好的缓释效果，符合水不溶性骨架的释药性能，适合
应用于缓控释药物制剂
实施例7
MTT法测定实施例3制得的盐酸小檗碱靶向纳米制剂对CNE-1细胞的抑制率
细胞培养
人鼻咽癌CNE-1细胞株培养于含10％胎牛血清的DMEM培养基中，置于5％CO2细胞
培养箱中，恒温37℃培养。每1～2d换液1次，使用0.25％胰蛋白酶消化传代，取对数生长期
的细胞进行实验。
MTT法测定盐酸小檗碱靶向纳米制剂对CNE-1细胞的抑制率
取处于对数生长期的CNE-1，胰酶消化后进行细胞计数并将细胞的浓度调整为1×
105个/mL，用新鲜培养液制备成单细胞悬液，按照每孔100μL接种于96孔板中，放置于37℃、
含5％CO2的二氧化碳培养箱中培养24h观察细胞贴壁情况，弃去原培养液，加入不同物质。
分组如下：
未处理组，只接种细胞；
空白对照孔，只加DMSO、MTT培养液，不接种细胞。
实验组1，接种细胞并每孔加入含盐酸小檗碱浓度为5、10、20、40μmol/L的盐酸小
檗碱混悬液50μL、培养液50μL，每组设3个复孔；
实验组2，接种细胞并加入含盐酸小檗碱浓度为5、10、20、40μmol/L的盐酸小檗碱-
壳聚糖纳米制剂50μL、培养液50μL，每组设3个复孔；
实验组3，接种细胞并加入含盐酸小檗碱浓度为5、10、20、40μmol/L的实施例3制得
的盐酸小檗碱靶向纳米制剂50μL、培养液50μL，每组设3个复孔。
同样条件培养24、48h，取出培养板，每孔加入10μL新鲜配制含5mg/mL MTT，继续培
养4h，弃上清液终止培养，每孔加150μL DMSO溶解，水平摇床上振荡混匀，空白对照空调零，
酶标仪测定波长为490nm时吸光度(A)值，用下面公式计算药物对各细胞的抑制率。MTT法测
定24h和48h时盐酸小檗碱靶向纳米制剂对CNE-1的增殖抑制作用结果见图7。
细胞增殖抑制率＝(对照组平均A值－给药组平均A值)/对照组平均A值
由结果可知，各组盐酸小檗碱制剂在不同时间作用于CNE-1细胞后，细胞的生长均
受到不同程度明显的抑制作用，随着制剂浓度增大，作用时间延长，细胞的生长抑制作用也
更为明显，可以看出盐酸小檗碱制剂对CNE-1细胞的生长抑制作用具有较明显的量效和时
效关系；不同盐酸小檗碱制剂对细胞抑制作用也具有明显差异，盐酸小檗碱靶向纳米制剂
对细胞的抑制作用强于盐酸小檗碱-壳聚糖纳米制剂和盐酸小檗碱原料药组，说明FA可以
与肿瘤细胞表面的FA受体特异性结合并增强盐酸小檗碱对CNE-1细胞的靶向性。
实施例8
实施例3制得的盐酸小檗碱靶向纳米制剂对CNE-1细胞迁移能力影响调整细胞浓
度为1×107个/mL，吸1mL细胞悬液接种于6孔板，加入DMEM培养6h，待细胞呈单层贴壁生长
状态时，用10μL Eppendorf Tip在细胞板上划痕，培养液洗细胞3次，依次加入含盐酸小檗
碱浓度为20μmol/L的盐酸小檗碱溶液、盐酸小檗碱-壳聚糖纳米制剂、盐酸小檗碱靶向纳米
制剂及0.05％DMSO(对照)组，另设未处理组，每组设3个复孔，放入37℃、5％CO2培养箱中培
养24h后，取样并拍照，用Image-Pro Plus 6.0软件测量划痕的距离，计算平均值与标准差。
以DMSO组为对照，进行组间比较。细胞的迁移能力以迁移率表示，盐酸小檗碱靶向纳米制剂
对CNE-1细胞迁移能力的影响结果见图8。
实验结果显示，未处理组、对照组以及20μmol/L的盐酸小檗碱溶液、盐酸小檗碱-
壳聚糖纳米制剂、盐酸小檗碱/FA-CTS-NPs处理组在0h时，划痕距离大体相同。24h后，未处
理组与对照组划痕距离明显缩短，两者相比，差异无统计学意义(P＞0.05)。而各20μmol/L
的盐酸小檗碱制剂处理组划痕距离增宽，与未处理组和DMSO组相比迁移率明显降低，差异
均有统计学意义(P＜0.05)。各盐酸小檗碱制剂组间相比较划痕距离差异也具有统计学意
义(P＜0.05)。
实施例9
实施例3制得的盐酸小檗碱靶向纳米制剂对CNE-1细胞凋亡的影响
分别收集含盐酸小檗碱浓度为20μmol/L的盐酸小檗碱、盐酸小檗碱-壳聚糖纳米
制剂、盐酸小檗碱靶向纳米制剂作用24h的CNE-1细胞，用胰酶消化，1 000r/min离心5min，4
℃预冷的PBS洗2次，1 000r/min离心5min，弃上清收集细胞。另设未处理和DMSO(对照)组。
加入250mL的Binding Buffer重悬细胞，取100μL的细胞悬液于5mL流式管中，加入
5μL Annexin V/FITC混匀后室温避光孵育5min。滴一滴上述细胞悬液于载玻片，盖玻片盖
上细胞并将盖玻片倒置后，于荧光显微镜下观察，盐酸小檗碱靶向纳米制剂诱导的CNE-1细
胞凋亡结果如图9所示。结果显示，各加药组的细胞凋亡率比未处理组和对照组明显增高(P
＜0.05)。在第24小时，未处理组与对照组细胞凋亡数量较少，两者相比，差异无统计学
意义(P＞0.05)，而各盐酸小檗碱制剂处理组凋亡细胞数量与对照组和DMSO组相
比明显增加，差异均有统计学意义(P＜0.05)。各盐酸小檗碱制剂组间相比较凋亡细胞数量
差异也具有统计学意义(P＜0.05)。且细胞凋亡率的程度与MTT结果一致，证明了实验的可
靠性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人
员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应
视为本发明的保护范围。