一种新的甜味绞股蓝甜味素制备及其应用技术领域
本发明属于天然产物提取技术领域，具体涉及从甜味绞股蓝中提取、分离、纯化甜味素制备方法结构表征及其应用。
背景技术
绞股蓝又称天堂草、福音草、超人参、公罗锅底、遍地生根、七叶胆、五叶参和七叶参等，拉丁文名：Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino 葫芦科、绞股蓝属草质攀援植物，茎细弱，具分枝，具纵棱及槽，无毛或疏被短柔毛。日本称之甘蔓茶。绞股蓝喜阴湿温和的气候，多野生在林下、小溪边等荫蔽处，多年生攀援草本。在中国主要分布在陕西平利、甘肃康县、湖南、湖北，云南、广西等省，号称“南方人参”，生长在南方的绞股蓝药用含量比较高，民间称其为神奇的“不老长寿药草”，具有降血脂，调血压防治血栓，防治心血管疾患，调节血糖，促睡眠，缓衰老，防抗癌，提高免疫力，调节人体生理机能等作用功效。1986年，国家科委在“星火计划”中，把绞股蓝列为待开发的“名贵中药材”之首位，2002年3月5日国家卫生部将其列入保健品名单。绞股蓝新品种“恩五叶蜜”、“恩七叶甜”，2008年获得湖北省科技进步二等奖，含有其它品种绞股蓝和其它植物没有的新型的天然非糖甜味物质。
目前绞股蓝主要作为茶饮料，由于其中含有皂苷、甜味素、蛋白和多糖等多种成分，各种成分的作用亦不同，作为保健品长期饮用，对部分人可能会产生恶心呕吐、腹胀腹泻（或便秘）、头晕、眼花、耳鸣等一些副作用。因而提取其中有效成分对于研究其疗效和保健作用显得十分重要。
非专利文献《绞股蓝甜味物质分离鉴定》（刘金龙 ,孙东发等，食品科学,2007, 28（10）：480-483）报道，采用超声波、ZTC1+1除杂剂、G-10凝胶层析等提取分离技术，得到甜味物质，其分子量 251，分子式估计为C13H19N2O3，与蔗糖、葡萄糖以及目前开发的罗汉果甜素、甘草甜素、多穗柯甜素、甜叶菊甜素分子结构不同。《“恩七叶甜”绞股蓝甜味物质分子结构初步研究》（郑小江，刘金龙，毛先发.食品科学，2009, 30（21）：46-49)，其甜味物质分子纯化方法为“恩七叶甜”干叶粉末乙醚脱脂→ 95% 乙醇浸泡超声波破碎→热浸提→离心过滤→ZTC除杂→离心→浓缩→甲醇溶解丙酮沉淀→沉淀物用去离子水溶解水饱和正丁醇萃取→水相浓缩→过硅胶柱→过Sephadex G-10 纯化冷冻干燥。主要有2个组分，一个分子量为274，无法确定结构；另一个分子量为170，分子式可能为C11H10N2。但这两种方法均为实验室少量提取，且分子纯度不高，结构并未完全弄清。
相关的绞股蓝甜味素专利文献目前没有。
发明内容
本发明针对目前绞股蓝甜味素结构未完全弄清问题，提供一种逐步分离、提取纯化方法，同时应用多种表征技术对其纯度和结构进行跟踪表征，最终得到纯度高，结构准确的绞股蓝甜味素。
本发明另一目的是提供所述方法制得的绞股蓝甜味素。
本发明的第三个目的是提出绞股蓝甜味素的应用。
本发明甜味物质甜味强度高、甜感阈值低，口感纯正、回味悠长。甜味绞股蓝甜味物质主要结构为葡萄糖6-醛酸乙酯-1,4-α-D半乳糖，是天然非糖类甜味剂，无化学味或金属味，甜度是蔗糖的300~1200倍。
为实现本发明的目的，具体技术方案为采用以下技术步骤。
1、选用甜味绞股蓝茶叶，在索氏提取器中用有机溶剂脱去叶绿素、脂肪和皂苷，取残渣于通风处除去溶剂。
2、在步骤1处理过的绞股蓝中加入1-7倍质量的蒸馏水，保温70℃-100℃搅拌提取0.5h-2h，重复提取2次。离心过滤取上清液合并，用旋转蒸馏器真空浓缩。
3、在步骤2浓缩液中加入氨水调节溶液pH值为8 ~ 9, 再分次加入30%的H2O2脱色1~3天。
4、用Sevage法脱蛋白，即加入体积比为 5/1的氯仿/正丁醇混合溶剂, 用搅拌器搅拌混合物30 min, 离心分离后取上层水溶液, 分去水层与溶剂层交界处的变性蛋白质及下层氯仿溶液。重复脱蛋白多次, 至紫外检测器在蛋白质的特征吸收峰280 nm未检出游离蛋白质。取水溶液再用旋转蒸馏器真空浓缩。
5、脱色、除蛋白后浓缩液用截留分子量范围为500-2000分子量透析袋在蒸馏水中透析2~4天，每天至少换水一次，取透析袋外透析液，用旋转蒸馏器真空浓缩。
6、将步骤5中的溶液用分子量100-500分子量透析袋在蒸馏水中透析，取透析袋内溶液，用旋转蒸馏器真空浓缩。
7、将步骤6中的溶液用冷冻干燥机干燥，得甜味素样品。
作为本发明另一简化技术方案，上述技术步骤中，步骤1、步骤3和步骤4也可以省略，用甜味绞股蓝茶叶不经过步骤1除去脂溶性杂质，直接加入水提取，提取液不经过步骤3脱色、不经过步骤4脱蛋白，可由步骤5除蛋白。具体如下。
1、选用甜味绞股蓝茶叶，加入1-7倍质量的蒸馏水，保温70℃-100℃搅拌提取0.5h-2h，重复提取2次。离心过滤取上清液合并，用旋转蒸馏器真空浓缩。
2、用截留分子量范围为500-1000分子量透析袋在蒸馏水中透析2~4天，每天至少换水一次，取透析袋外透析液，用旋转蒸馏器真空浓缩。
3、将步骤2中的溶液用分子量100-500分子量透析袋在蒸馏水中透析，取透析袋内溶液，用旋转蒸馏器真空浓缩。
4、冷冻干燥机干燥，得甜味素样品。
对上述步骤制得的甜味素样品应用液相色谱-质谱(LC-MS)、气相色谱-质谱(GC-MS)、 1H, 13C 和二维核磁共振 (NMR)、红外光谱(IR)、元素分析等研究表明，甜味素样品主要结构为葡萄糖6-醛酸乙酯-1,4-α-D半乳糖。
本发明从甜味绞股蓝中提取分离出纯度较高的甜味素，确定了它的化学结构主要为葡萄糖6-醛酸乙酯-1,4-α-D半乳糖。所用方法简单易行、成本较低廉。
附图说明
图1 甜味绞股蓝甜味素13C核磁共振图。
图2 绞股蓝甜味素红外光谱图。
图3 绞股蓝甜味素液相色谱-质谱图。
图4 绞股蓝甜味素分子结构。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实例1
1、选用甜味绞股蓝茶叶100g，在索氏提取器中用有机溶剂脱去叶绿素、脂肪和皂苷，取残渣于通风处除去溶剂。
2、在步骤1处理过的绞股蓝中加入500mL的蒸馏水，保温70℃-90℃搅拌提取0.5h-2h，重复提取2次。离心过滤取上清液合并，用旋转蒸馏器真空浓缩至200mL。
3、在步骤2浓缩液中加入氨水调节溶液pH值为8 ~ 9, 再分次加入3mL 30%的H2O2脱色1~3天。
4、用Sevage法脱蛋白，即加入体积比为 5/1的氯仿/正丁醇混合溶剂20mL, 用搅拌器搅拌混合物30 min, 离心分离后取上层水溶液, 分去水层与溶剂层交界处的变性蛋白质及下层氯仿溶液。重复脱蛋白多次, 至紫外检测器在蛋白质的特征吸收峰280 nm未检出游离蛋白质。取水溶液再用旋转蒸馏器在温度低于70℃，真空度为0.005~0.05MPa条件下真空浓缩。
5、脱色、除蛋白后浓缩液用截留分子量范围为500-1000分子量透析袋在蒸馏水中透析2~4天，每天至少换水一次，取透析袋外透析液，用旋转蒸馏器同上条件下真空浓缩。
6、将步骤5中的溶液用分子量100-500分子量透析袋在蒸馏水中透析，取透析袋内溶液，用旋转蒸馏器同上条件下真空浓缩。
7、将上述浓缩液置于-20℃以下温度，0.001~0.005MPa真空度冷冻干燥机中冷冻干燥，得甜味素样品。
样品经红外光谱分析显示样品特征峰为619 cm-1，1078cm-1，2934 cm-1，3409cm-1， 以及1384 cm-1和1596 cm-1，应该为多羟基糖类化合物(图1)。样品元素分析见表1，H:C:O比例接近2：1：1，说明为碳水化合物，H:C比例略小于2，说明有不饱和烯烃。核磁共振分析1H显示羟基质子特征峰4.70ppm非常强，经放大显示有饱和基团-OCH- (3.0~4.3ppm)、-CH2(1.2~1.7ppm)、-CH3(0.7ppm)质子等，主要为多羟基化合物。核磁共振13C谱表明，样品谱峰尖锐，主要为小分子寡糖(57~100 ppm)，含有甲基(13ppm)、亚甲基(25、29ppm)和双键(126,135 ppm) (图2)。液相色谱-质谱分析显示，紫外色谱图检测主要有一个峰，含有少量杂质，其纯度为95%，正离子质谱显示分子离子质核比为385(图3)，经甲基化衍生后气相色谱质谱分析主要结构为葡萄糖6-醛酸乙酯-1,4-α-D半乳糖(图4)。
表1 样品元素分析结果
样品CHO，%H:C (mol/mol)H:O (mol/mol)
实施例141.90 6.14 47.42 1.75 2.07
实施例241.796.7151.51.93 2.08
实施例2
1、选用甜味绞股蓝茶叶100g，加入500mL的蒸馏水，保温70℃-80℃搅拌提取0.5h-2h，重复提取2次。离心过滤取上清液合并，用旋转蒸馏器真空浓缩至200mL。
2、用截留分子量范围为500-1000分子量透析袋在蒸馏水中透析2~4天，每天至少换水一次，取透析袋外透析液，用旋转蒸馏器在温度低于70℃，真空度为0.005~0.05MPa条件下真空浓缩。
3、将步骤2中的溶液用分子量100-500分子量透析袋在蒸馏水中透析，取透析袋内溶液，用旋转蒸馏器同上条件下真空浓缩。
4、将上述浓缩液置于-20℃以下温度，0.001~0.005MPa真空度冷冻干燥机中冷冻干燥，得甜味素样品。
样品经红外光谱分析显示样品特征峰为多羟基糖类化合物。样品元素分析见表1，H:C:O比例接近2：1：1，说明为碳水化合物，H:C比例略小于2，说明有不饱和烯烃。