一种白牛筋木的组培增殖方法技术领域
本发明涉及一种树木的增殖方法，具体是一种白牛筋木的组培增殖方法。
背景技术
牛筋条在植物分类上属于蔷薇科牛筋条属，产于云南的只有一种和一个变种。云
南省农业科学院园艺作物研究所结合云南山高坡陡、冬春干旱的实际，就地取材，在总结群
众经验的基础上，对牛筋条植物进行了研究。根据初步观察，牛筋条无论嫁接苹果和梨都有
矮化树体和提早结果的明显效果，可以一砧多用，是一个很有希望的苹果和梨的实生矮化
砧。但牛筋条是常绿灌木，四季常绿，主根发达，入土很深，须根少，有抗早耐瘠的一面，又有
不耐移栽、定植的一面，一般嫁接苗由于须根少，移苗定植后缓苗期长，影响生长。
白牛筋木的繁殖方法主要是种籽繁殖和扦插繁殖。种籽繁殖的实生苗因为主根发
达，入土深，须根少，又是常绿树，所以移栽成活率低；扦插繁殖，除了要求外界具有一定的
湿度、温度、空气和自生以及外界具备充足营养物质外，还需要一些微量的特殊活性物质，
操作复杂，由于牛筋条扦插生根困难，育苗成本高，效率低，影响了其推广速度。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高育苗效率、降低育苗成本的白牛筋木的组培增殖
方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种白牛筋木的组培增殖方法，具体步骤如下：
（1）外植体的选取：在3月至5月的晴好天气，剪取牛筋条当年生营养枝的幼嫩茎段或茎
尖；
（2）外植体的灭菌：剪去嫩茎上的叶片，用洗洁精清洗茎段或茎尖，再用自来水冲洗干
净，将茎段或茎尖放入超净工作台中，用75%的酒精浸泡30s，再用灭过菌蒸馏水将酒精冲洗
干净，再放入0.1%的升汞溶液中浸泡20-30min，然后用无菌水清洗4次；
（3）无菌系建立：无菌系的建立采用的基本培养基是MS培养基，使用的激素为6BA和
NAA，将培养基装入广口瓶中，每瓶装入培养基30-40ML，密封后进行高温高压灭菌，灭菌后
冷却待用；在超净工作台中，将消毒好的茎段或茎尖剪成长为2cm的茎段，然后将剪好的茎
段插入灭菌后的MS培养基中，每瓶培养基插入茎段5-8个，密封后将其放入培养室进行培
养；
（4）继代增殖：牛筋条在经过一段时间的培养后，无菌系建立，继而进行继代增殖培养；
代培养所用培养基为MS+1-2mg6BA+0.05-0.5%NAA，每瓶培养基为50ML，接入无菌系的茎段3
个，密封后放入培养室进行继代培养，每周对培养室进行消毒一定，每20-25d更换一次培养
基，通过一个周期的继代培养，牛筋条增殖系数达到13-15。
作为本发明进一步的方案：所述步骤（1）中的茎段或茎尖用质量百分浓度为75%的
酒精消毒30秒，再用质量百分浓度为0.1%的升汞消毒25min。
作为本发明再进一步的方案：所述步骤（3）和步骤（4）中的培养室条件为：培养室
温度控制在25-27℃，每天光照12h，光照强度为1000-1200Lx。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明采用组织培养增殖方法，对白牛筋木矮化砧木进行大批量生产，降低了育苗成
本，提高了育苗效率。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。
实施例1
一种白牛筋木的组培增殖方法，具体步骤如下：
（1）外植体的选取：在3月至5月的晴好天气，剪取牛筋条当年生营养枝的幼嫩茎段或茎
尖；
（2）外植体的灭菌：剪去嫩茎上的叶片，用洗洁精清洗茎段或茎尖，再用自来水冲洗干
净，将茎段或茎尖放入超净工作台中，用75%的酒精浸泡30s，再用灭过菌蒸馏水将酒精冲洗
干净，再放入0.1%的升汞溶液中浸泡20min，然后用无菌水清洗4次；
（3）无菌系建立：无菌系的建立采用的基本培养基是MS培养基，使用的激素为6BA和
NAA，将培养基装入广口瓶中，每瓶装入培养基30mL，密封后进行高温高压灭菌，灭菌后冷却
待用；在超净工作台中，将消毒好的茎段或茎尖剪成长为2cm的茎段，然后将剪好的茎段插
入灭菌后的MS培养基中，每瓶培养基插入茎段5个，密封后将其放入培养室进行培养；控制
好培养所需的光照和温度条件，避免外界对培养室的污染，及时清除被污染的茎段和培养
基；培养室温度控制在25℃，每天光照12h，光照强度为1000Lx。
（4）继代增殖：牛筋条在经过一段时间的培养后，无菌系建立，继而进行继代增殖
培养；代培养所用培养基为MS+1mg6BA+0.05%NAA，每瓶培养基为50ML，接入无菌系的茎段3
个，密封后放入培养室进行继代培养，每周对培养室进行消毒一定，每20d更换一次培养基，
通过一个周期的继代培养，牛筋条增殖系数达到13；培养室温度控制在25℃，每天光照12h，
光照强度为1000Lx。
实施例2
一种白牛筋木的组培增殖方法，具体步骤如下：
（1）外植体的选取：在3月至5月的晴好天气，剪取牛筋条当年生营养枝的幼嫩茎段或茎
尖；
（2）外植体的灭菌：剪去嫩茎上的叶片，用洗洁精清洗茎段或茎尖，再用自来水冲洗干
净，将茎段或茎尖放入超净工作台中，用75%的酒精浸泡30s，再用灭过菌蒸馏水将酒精冲洗
干净，再放入0.1%的升汞溶液中浸泡25min，然后用无菌水清洗4次；
（3）无菌系建立：无菌系的建立采用的基本培养基是MS培养基，使用的激素为6BA和
NAA，将培养基装入广口瓶中，每瓶装入培养基35mL，密封后进行高温高压灭菌，灭菌后冷却
待用；在超净工作台中，将消毒好的茎段或茎尖剪成长为2cm的茎段，然后将剪好的茎段插
入灭菌后的MS培养基中，每瓶培养基插入茎段6个，密封后将其放入培养室进行培养；控制
好培养所需的光照和温度条件，避免外界对培养室的污染，及时清除被污染的茎段和培养
基；培养室温度控制在26℃，每天光照12h，光照强度为1100Lx。
（4）继代增殖：牛筋条在经过一段时间的培养后，无菌系建立，继而进行继代增殖
培养；代培养所用培养基为MS+1.5mg6BA+0.2%NAA，每瓶培养基为50ML，接入无菌系的茎段3
个，密封后放入培养室进行继代培养，每周对培养室进行消毒一定，每22d更换一次培养基，
通过一个周期的继代培养，牛筋条增殖系数达到14；培养室温度控制在26℃，每天光照12h，
光照强度为1100Lx。
实施例3
一种白牛筋木的组培增殖方法，具体步骤如下：
（1）外植体的选取：在3月至5月的晴好天气，剪取牛筋条当年生营养枝的幼嫩茎段或茎
尖；
（2）外植体的灭菌：剪去嫩茎上的叶片，用洗洁精清洗茎段或茎尖，再用自来水冲洗干
净，将茎段或茎尖放入超净工作台中，用75%的酒精浸泡30s，再用灭过菌蒸馏水将酒精冲洗
干净，再放入0.1%的升汞溶液中浸泡30min，然后用无菌水清洗4次；
（3）无菌系建立：无菌系的建立采用的基本培养基是MS培养基，使用的激素为6BA和
NAA，将培养基装入广口瓶中，每瓶装入培养基40mL，密封后进行高温高压灭菌，灭菌后冷却
待用；在超净工作台中，将消毒好的茎段或茎尖剪成长为2cm的茎段，然后将剪好的茎段插
入灭菌后的MS培养基中，每瓶培养基插入茎段8个，密封后将其放入培养室进行培养；控制
好培养所需的光照和温度条件，避免外界对培养室的污染，及时清除被污染的茎段和培养
基；培养室温度控制在27℃，每天光照12h，光照强度为1200Lx。
（4）继代增殖：牛筋条在经过一段时间的培养后，无菌系建立，继而进行继代增殖
培养；代培养所用培养基为MS+2mg6BA+0.5%NAA，每瓶培养基为50ML，接入无菌系的茎段3
个，密封后放入培养室进行继代培养，每周对培养室进行消毒一定，每25d更换一次培养基，
通过一个周期的继代培养，牛筋条增殖系数达到15；培养室温度控制在27℃，每天光照12h，
光照强度为1200Lx。
试验1：
1.1外植体的选取：2015年5月，在云南省农业科学院园艺作物研究所云南特有果树及
砧木资源圃采集1a生牛筋条嫩梢部分。剪取其10-15cm长的嫩梢，去掉叶片，带回实验室备
用。
1.2试验方法
1.2.1无菌苗的培养：将采集的嫩梢剪成5cm左右长的茎段，用流水冲洗30-60min，在超
净工作台内用70%的酒精浸泡30s，再用0.1%升汞溶液灭菌8min，最后用无菌水摇晃冲洗3
次，然后将嫩梢剪成1.5cm左右长的带腋芽茎段，接入MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.3mg/L的初代
培养基中，每瓶接种2个茎段；初代培养25d
后，用镊子小心取出试管苗，切成1.5-2.0cm带芽茎段，接种到继代培养基MS+6-
BA1.0mg/L+IBA0.1-0.3mg/L中，每瓶接3-4茎段。
1.2.2茎芽的增殖培养：选取继代培养同一批生长期30d左右的、长势好的试管苗，
将其切成1.5-2.0cm带芽茎段接入各种不同成分的增殖筛选培养基中，每种处理最少接10
瓶，每瓶接种3个茎段，试管苗培养30d后，观察试管苗生长状况，统计其增殖系数及试管苗
高度。增殖系数＝植株大于1cm长的分支/接种时茎段的数量×100%；
1.2.3生根培养和试管苗移栽：切取3-4cm的试管苗茎段，接种到生根培养基上，30d后
统计生根率和生根条数等；然后将长势好的生根苗转入练苗室进行练苗，瓶内练苗5d后，移
栽入基质中练苗，15d试管苗已发新根，统计成活率。生根率＝生根植株数/接种茎段总数×
100%；生根条数为植株基部诱导出的第一级根的条数；移栽成活率＝移栽成活数/移栽生根
苗数×100%。
培养条件：
以上培养基pH均为5.8，蔗糖30g/L，琼脂7g/L，培养条件为温度（25±2）℃，光照时间
16h/d，光照强度1800lx。
试验2：
1.1外植体的选取：2009年5月，在西北农林科技大学梨种质资源圃采集2a生云南榅桲
植株嫩梢部分。剪取其10-15cm长的嫩梢，去掉叶片，带回实验室备用；
1.2试验方法：
1.2.1无菌苗的培养：将采集的嫩梢剪成5cm左右长的茎段，用流水冲洗30-60min，在超
净工作台内用70%的酒精浸泡30s，再用0.1%升汞溶液灭菌8min，最后用无菌水摇晃冲洗3
次，然后将嫩梢剪成1.5cm左右长的带腋芽茎段，接入MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.3mg/L的初代
培养基中，每瓶接种2个茎段。初代培养25d后，用镊子小心取出试管苗，切成1.5-2.0cm带芽
茎段，接种到继代培养基MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.1-0.3mg/L中，每瓶接3-4茎段。
1.2.2茎芽的增殖培养：选取继代培养同一批生长期30d左右的、长势好的试管苗，
将其切成1.5-2.0cm带芽茎段接入各种不同成分的增殖筛选培养基中，每种处理最少接10
瓶，每瓶接种3个茎段，试管苗培养30d后，观察试管苗生长状况，统计其增殖系数及试管苗
高度。增殖系数＝植株大于1cm长的分支/接种时茎段的数量×100%。
1.2.3生根培养和试管苗移栽：切取3-4cm的试管苗茎段，接种到生根培养基上，
30d后统计生根率和生根条数等。然后将长势好的生根苗转入练苗室进行练苗，瓶内练苗5d
后，移栽入基质中练苗，15d试管苗已发新根，统计成活率。生根率＝生根植株数/接种茎段
总数×100%；生根条数为植株基部诱导出的第一级根的条数；移栽成活率＝移栽成活数/移
栽生根苗数×100%。
培养条件：
以上培养基pH均为5.8，蔗糖30g/L，琼脂7g/L，培养条件为温度（25±2）℃，光照时间
16h/d，光照强度1800lx。
以梨矮化砧木云南榅桲的茎段为外植体，进行了离体快繁研究。结果表明：茎芽增
殖的适宜培养基为MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.3mg/L或MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.5mg/L，增殖系数
分别为3.65和3.58，并且试管苗长势健壮；云南榅桲不定根诱导的适宜培养基为1/2MS+
NAA0.3mg/L，生根苗移栽成活率为92％。
针对白牛筋木的矮化作用明显，但繁殖和移栽后难成活，导致难以推广利用的问
题。因此，把2015年扦插试验成活的白牛筋木，嫁接苹果和梨品种试验，同时开展白牛筋木
的组织培养离体保存研究，找到适宜快速扩繁的方法，加速白牛筋木矮化砧的繁殖推广。在
无菌系建立的基础上，进行了牛筋条芽增值培养基的筛选工作，以MS为基本培养基，利用6-
BA1-2（细胞分裂素）、KT1-2（激动素）、NAA0.1-1（生长素）等激素，设计了2组12个配方来进
行牛筋条芽增值培养基的筛选。具体的配方见表1：
表1牛筋条芽增值培养基配方
通过多次的筛选比较，目前已基本筛选出第一组中的第二个培养基，即MS+6-BA1+
NAA0.5配方对牛筋条芽增值有较好地效果，解决了牛筋条在扩繁过程中的芽增值问题。其
芽的增值数量在5～10棵之间，而其他配方的培养基增值数量仅在0～4棵。因此扩繁过程中
以MS+6-BA1+NAA0.5配方为主要的芽增值培养基。
本发明采用组织培养增殖方法，对白牛筋木矮化砧木进行大批量生产，降低了育
苗成本，提高了育苗效率。
上面对本专利的较佳实施方式作了详细说明，但是本专利并不限于上述实施方
式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本专利宗旨的前提下
作出各种变化。