小分子多肽KP-6在制备治疗慢性肾脏病的药物中的用途技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种独特的小分子多肽在治疗慢性肾脏病(CKD)
中的用途，具体是涉及KP-6多肽在制备治疗CKD药物中的用途。
背景技术
慢性肾脏病(CKD)最终进展至终末期肾功能衰竭(ESRD)，患者终身依赖“肾脏替代
治疗”来维持生命。在过去的几十年中，伴随着人类社会的人口老龄化，CKD患病率呈现逐年
上升趋势(Nat Rev Nephrol,2011,7:684-696)。有资料表明，CKD正成为一种“公众健康问
题”，严重危害人类健康并消耗大量卫生资源。然而，目前临床上尚缺乏有效延缓CKD进展的
药物。针对CKD的发病机制，寻找有效地抑制或延缓CKD进展的药物无疑是当前肾脏病学界
的当务之急，成为亟待攻克的战略重点之一。
肾脏纤维化是CKD的共同途经，其特征是细胞外基质过量表达和沉积，导致组织结
构损伤，疤痕形成，毛细血管丢失和组织缺氧，最终肾脏功能衰竭。大量研究表明，Wnt/β-
catenin信号的持续激活是肾脏纤维化和CKD发生发展的一个关键途经(Kidney Int
Supple2014,4:84-90)。因此，寻找阻断Wnt/β-catenin信号途经的对策，对于抑制肾脏纤维
化的发生发展具有重要的理论意义和临床应用价值。
Wnt的配体在体内可以与不同的蛋白质结合，从而调节其生物学活性。蛋白质相互
作用通常是通过特定的氨基酸序列所组成的结构域完成的。本发明涉及通过筛选多肽文
库，发现一个特异的小分子多肽(KP-6)，能抑制肾脏纤维化的关键信号通路。KP-6多肽无前
人报道，它在氨基酸序列结构上与抗衰老蛋白klotho分子的一段序列同源。有文献报道，
klotho能结合Wnt配体，阻断Wnt/β-catenin信号传导(JAm SocNephrol.2013,24:771-
785)，从而抑制肾脏纤维化，延缓慢性肾病进展。
KP-6作为一种新颖的、有效的小分子多肽，抑制肾组织损伤和肾脏纤维化、延缓
或/和逆转慢性肾脏病的病程。
单侧输尿管结扎(UUO)是经典的CKD动物模型，其特点是可以快速完整地展示梗阻
肾脏间质纤维化不同病理阶段和特征，包括炎细胞浸润、小管细胞的增殖和凋亡、肌成纤维
细胞的活化、纤连蛋白(Fibronectin)和I型胶原(Collagen I)的沉积。缺血-再灌注(IRI)
模型是经典的急性肾损伤(AKI)向慢性肾脏病(CKD)进展的模型。单侧肾脏进行缺血-再灌
注(IRI)手术后10天，然后合并进行对侧肾脏的切除(UIRI)，能够明显展示慢性肾脏纤维化
的病理过程，其造模方法简便易行，成功率高，且具备手术切口小、手术时间短及并发症少
的优点，建立的模型适合于急性肾损伤向慢性肾纤维化进展的研究。
在病理上，通常采用Masson染色，来观察组织细胞外胶原蛋白沉积情况。而更具体
的组织纤维化则常常应用肌成纤维细胞的标志α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、纤连蛋白和I型
胶原的免疫染色和免疫印迹方法(Western blotting)来定性、定量观察和评估。
发明内容
本发明的目的在于提供小分子多肽(命名为KP-6)在制备治疗慢性肾脏病的药物
中的用途。所述多肽KP-6的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
SEQ ID NO.1：QPVVTLYHWDLPQRLQDAYGGWANRALADH。
根据本发明所述的用途的进一步特征，所制备的药物包括：治疗上有效的小分子
多肽(命名为KP-6)，以及药学上可接受的辅料。
本发明的目的还在于提供小分子多肽KP-6的衍生物在制备治疗慢性肾脏病的药
物中的用途。
根据本发明所述的用途的进一步特征，KP-6的衍生物包括：含有KP-6氨基酸序列
的更短肽段、氨基酸替代后的KP-6相关多肽，以及化学修饰后的KP-6及其更短肽段。
本发明的实验证明，小分子多肽(KP-6)在小鼠动物实验中无明显毒副作用。发明
人对KP-6进行单侧输尿管梗阻(UUO)和单侧缺血再灌注损伤(UIRI)肾病模型实验。结果表
明：与UUO或UIRI模型组比较，KP-6组肾脏间质胶原沉积显著减少，α平滑肌肌动蛋白、纤连
蛋白均显著降低，β连环蛋白(β-catenin)及其下游靶基因表达明显下调，表明KP-6能拮抗
Wnt/β-catenin信号通路，有效抑制UUO和UIRI肾脏组织纤维化。
综上所述，KP-6具有显著抑制肾脏组织纤维化和CKD进展的作用，且无明显毒副作
用，因此可用于制备有效治疗慢性肾脏病的药物。
附图说明
图1是KP-6的筛选和鉴定。人肾小管上皮细胞(HKC-8)转染Wnt1质粒之后，给予不
同的小分子多肽处理。图1中，A图显示第1到第6号小分子多肽对Wnt1表达后纤维化相关蛋
白的拮抗作用；B图第6号小分子多肽(KP-6)对TGF-β表达后纤维化相关蛋白的拮抗作用；C
图显示KP-6的氨基酸序列。
图2是UUO模型各组小鼠肾脏Masson染色图。图2中，左：假手术组；中：UUO模型组；
右：UUO+KP-6。
图3是UUO模型各组小鼠肾脏纤维化指标的免疫染色图。该图中，Sham：假手术组；
UUO：模型对照组；UUO+KP-6：用药组。
图4是UUO模型各组小鼠肾组织β-catenin及其下游靶基因蛋白水平的免疫印迹
图。其中，图4A为免疫印迹检测的代表性结果；图4B为所有结果的统计图。Sham：假手术组；
UUO：模型对照组；UUO+KP-6：用药组。
图5是UIRI模型各组小鼠肾脏Masson染色图。该图中，左：假手术组；中：UIRI模型
组；右：UIRI+KP-6。
图6是UIRI模型各组小鼠肾脏纤维化指标的免疫染色图。该图中，Sham：假手术组；
UIRI：模型对照组；UIRI+KP-6：用药组。
图7是免疫印迹法检测各组小鼠肾脏β-catenin及其下游靶基因蛋白水平。其中，
图7A为免疫印迹检测的代表性结果；图7B为所有结果的统计图。
具体实施方式
下面仅以实施例的方式结合附图对本发明做进一步的说明。
实施例一：KP-6小分子多肽的筛选
1.实验材料：
细胞：人肾小管上皮细胞。
培养液：含10％FBS的DMEM/F129(1:1)培养液。
培养条件：37℃含5％CO2培养箱。
小分子多肽文库：由计算机设计产生18条多肽序列，平均每条长度为30氨基酸，交
由南京金斯瑞生物科技公司人工合成，建成小分子多肽文库，进行以下实验。
2.实验处理：
(I)将培养好的人肾小管上皮细胞以1.5×106种于6孔细胞培养板，培养1天，饥饿24小
时，提前1小时给予18种不同的小分子多肽(10μg/ml)。然后转染Wnt1质粒，24小时后收取蛋
白，进行Western blot实验，筛选其中对Wnt1诱导纤连蛋白抑制最强的肽段。
(II)将培养好的人肾小管上皮细胞以1.5×106种于6孔细胞培养板，培养1天，提
前1小时给予肽段6号(KP-6)(10μg/ml)。然后，加入TGF-β(2ng/ml)刺激，24小时后收取蛋
白，进行Western blot实验。
3.实验结果
(I)实验结果如图1A所示，部分小分子肽段能抑制Wnt1所介导的纤连蛋白
(Fibronectin)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达。其中第6肽段(命名为KP-6)抑制作用
最强。
(II)如图1B所示，KP-6能抑制TGF-β所引起的纤维化相关基因的表达。因此，KP-6
作为一种新颖的小分子多肽，能拮抗Wnt和TGF-β活性，阻断体内关键的促纤维化信号通路，
从而抑制纤维化相关蛋白的表达。
(III)KP-6的氨基酸序列
多肽KP-6的氨基酸序列为QPVVTLYHWDLPQRLQDAYGGWANRALADH(SEQ ID NO.1)。
实施例二：小分子多肽KP-6对小鼠UUO模型肾脏纤维化的抑制作用
1.实验动物：C57小鼠，雌雄匹配，体重20-22g，SPF级。
先将动物称重、编号，选择健康、体重在20-22g的小鼠12只，随机分为3组，每组4
只。包括假手术组、模型对照组及用药组。
2.实验分组
1)假手术组：室温，3％戊巴比妥钠以1ml/公斤体重麻醉小鼠后，选择左侧腹2-3cm为切
口；局部消毒后，逐层切开皮肤、皮下、肌层及腹膜，发现左侧输尿管后，随即逐层缝合。局部
消毒后，核实标记，置于相应鼠笼。
2)模型对照组：同上麻醉、消毒。逐层切开皮肤、皮下、肌层及腹膜，找到左侧输尿
管后，于输尿管上1/3段结扎，逐层缝合。局部消毒后，核实标记，置于相应鼠笼。
3)用药组：同上麻醉、消毒。逐层切开皮肤、皮下、肌层及腹膜，找到左侧输尿管后，
于输尿管上1/3段结扎，逐层缝合。局部消毒后，核实标记，置于相应鼠笼。
3.实验过程
KP-6水溶性的粉末用无菌的生理盐水稀释为25mg/ml的储存浓度。实验各组分笼饲养。
假手术组仅观察。模型对照组仅给予生理盐水尾静脉注射。用药组予以UUO开始后的连续6
天以含有0.5mg/kg体重的KP-6的1ml生理盐水尾静脉注射。饲养7天后杀死各组小鼠，均取
左侧肾脏，分别予以10％中性缓冲甲醛固定及液氮冷冻组织。甲醛固定组织在经脱水、包
埋、切片、制片后，分别予以Masson染色及平滑肌肌动蛋白α、纤连蛋白免疫染色。冰冻组织
匀浆后提取蛋白，用免疫印迹法(Western Blot)检测β-catenin及其靶基因表达水平。
4.实验结果
1)Masson染色检测肾脏组织纤维化程度
(I)、KP-6减少UUO小鼠肾间质胶原沉积
实验结果如图2所示，用药组小鼠肾间质胶原沉积明显低于模型对照组。
(II)、KP-6减少UUO小鼠肾间质纤维化
实验结果如图3所示，与模型对照组比较，用药组小鼠肾间成纤维细胞特异性蛋白1
(Fsp1)、平滑肌肌动蛋白α(α-SMA)水平明显降低。
(III)、KP-6抑制UUO小鼠的异常活化的β-catenin信号通路
实验结果如图4所示，与模型对照组比较，用药组小鼠肾脏的β-catenin蛋白及其下游
靶基因蛋白PAI-1和MMP-7明显降低。
实施例三：小分子多肽KP-6对小鼠UIRI模型肾脏纤维化的抑制作用
1.实验动物：BABL/c小鼠，雄性，体重20-22g，SPF级。
先将动物称重、编号，选择健康、体重在20-22g的小鼠18只，随机分为3组，每组6
只。包括生理盐水组、模型对照组及用药组。
2.实验各组
1)假手术组：室温，3％戊巴比妥钠以1ml/公斤体重麻醉小鼠后，选择左侧腹2-3cm为切
口；局部消毒后，逐层切开皮肤、皮下、肌层及腹膜，发现左侧肾蒂后随即逐层缝合。局部消
毒后，核实标记，置于相应鼠笼。
2)模型对照组：同上麻醉、消毒。逐层切开皮肤、皮下、肌层及腹膜，找到左侧肾蒂
后用无损伤微型动脉夹迅速阻断左侧肾蒂，可见肾脏有鲜红变成紫黑色，表示夹闭成功，将
小鼠置于37度的金属加热板上，计时35分钟，手术结束后逐层缝合。局部消毒后，核实标记，
置于相应鼠笼。于术后第10天行右侧肾切除，同上麻醉、消毒。行右侧背部1-2cm切口，先结
扎右侧肾蒂，再切除右侧肾，手术结束后逐层缝合。局部消毒后，核实标记，置于相应鼠笼。
3)用药组：同上麻醉、消毒。逐层切开皮肤、皮下、肌层及腹膜，找到左侧肾蒂后用
无损伤微型动脉夹迅速阻断左侧肾蒂，可见肾脏有鲜红变成紫黑色，表示夹闭成功，将小鼠
置于37度的金属加热板上，计时35分钟，手术结束后逐层缝合。局部消毒后，核实标记，置于
相应鼠笼。于术后第10天行右侧肾切除，同上麻醉、消毒。行右侧背部1-2cm切口，先结扎右
侧肾蒂，再切除右侧肾，手术结束后逐层缝合。局部消毒后，核实标记，置于相应鼠笼。
3.实验过程
KP-6水溶性的粉末用无菌的生理盐水稀释为25mg/ml的储存浓度。各组分笼饲养。假手
术组仅观察。模型对照组仅给予生理盐水尾静脉注射。用药组予以缺血再灌注损伤开始后
的连续10天以含有0.5mg/kg体重的KP-6的1ml生理盐水尾静脉注射。饲养第11天杀死各组
小鼠，收集血标本，均取左侧肾脏，分别予以10％中性缓冲甲醛固定及液氮冷冻组织。甲醛
固定组织在经脱水、包埋、切片、制片后，分别予以Masson染色及平滑肌肌动蛋白α、纤连蛋
白免疫染色。冰冻组织匀浆后提取蛋白，用免疫印迹法(Western Blot)检测β-catenin及其
靶基因表达水平。
4.实验结果
1)Masson染色检测肾脏组织纤维化程度
(I)、KP-6减少UIRI小鼠肾间质胶原沉积
实验结果如图5所示，用药组小鼠肾间质胶原沉积明显低于模型对照组。
(II)、KP-6减少UIRI小鼠肾间质纤维化
实验结果如图6所示，与模型对照组比较，用药组小鼠肾组织成纤维细胞特异性蛋白1、
平滑肌肌动蛋白α、纤连蛋白水平明显降低。
(III)、KP-6抑制UIRI小鼠的异常活化的β-catenin信号通路
实验结果如图7所示，与模型对照组比较，用药组小鼠肾脏的β-catenin蛋白及其下游
靶基因蛋白PAI-1和Snail明显降低。
综上所述，KP-6可以明显减少UUO、UIRI小鼠肾间质胶原蛋白沉积，显著降低UUO、
UIRI小鼠肾组织纤连蛋白、I型胶原α-SMA表达水平，并可以明显抑制CKD模型中的异常活化
的β-catenin信号通路。因此，KP-6可以成为有效抑制CKD进展的新药。
SEQUENCE LISTING
<110> 南方医科大学南方医院
<120> 小分子多肽KP-6在制备治疗慢性肾脏病的药物中的用途
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.4
<210> 1
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
Gln Pro Val Val Thr Leu Tyr His Trp Asp Leu Pro Gln Arg Leu Gln
1 5 10 15
Asp Ala Tyr Gly Gly Trp Ala Asn Arg Ala Leu Ala Asp His
20 25 30