抗真菌剂 本发明涉及一种抗真菌剂。更详细地说是涉及一种特征在于含有咪唑系抗真菌剂及季铵盐的抗真菌剂用组合物。
世界上作为抗真菌剂主流的咪唑系抗真菌剂是在其化学结构中具有咪唑基的药剂。主要是通过破坏真菌的细胞膜来表现抗菌作用。
作为咪唑系抗真菌剂，克霉唑、硝酸双氯苯咪唑、硝酸益康唑、联苯苄唑、硝酸奥昔康唑、硝酸硫康唑、噻康唑等作为转换OTC(Switch OTC)的成分而被人们已知。
克霉唑仅在外用药领域使用，对发癣菌属、念珠菌属等是有效的。用于健康皮肤时，认为几乎没有体内吸收，但认为有局部的副作用，如皮肤的刺激感、发红、出疹子等，考虑这些现象与对皮肤的直接刺激作用或过敏作用有关。
联苯苄唑显示出与克霉唑相同的作用。被认为对多种人体病原真菌是有效的。与其它的咪唑系抗真菌剂相比较，认为其外用时的皮肤渗透性优良，在皮肤组织中的药剂贮留性高。与克霉唑同样有皮肤的刺激感、发红、出疹子等局部的副作用。
硝酸双氯苯咪唑、硝酸益康唑，对发癣菌属、念珠菌属、隐球菌属等也显示出抗菌力 用于健康皮肤时，认为几乎没有体内吸收；通常在外用使用时不会有全身性的副作用，但认为在局部会有与克霉唑同样的副作用。
所谓季铵盐，是指作为阳离子表面活性剂的属于季铵盐的物质。例如有苄索氯铵、苯扎氯铵、地喹氯铵等。被认为是由于季铵盐的阳离子吸附在菌体的表面上，继而进入细胞内以致对细胞内的蛋白质给予影响而发挥杀菌作用
苄索氯铵、苯扎氯铵对革兰氏细菌、真菌显示出杀菌力，但作为副作用在对皮肤长期使用时会出现刺激、出疹子、搔痒感等过敏症状这是周知的。
地喹氯铵被认为对细菌(特别是金黄色葡萄球菌、溶血型链球菌杀菌)、真菌显示出杀菌力。主要配合在口腔内杀菌剂、抗牙痛剂、抗牙槽脓溢剂中。
由咪唑系抗真菌剂和季铵盐配合而成的药剂尚不知晓，但在英国专利公开公报第2208598号中公开了配合咪唑系抗真菌剂和水杨酸或苯甲酸地例子。
一般很难治愈的脚气病，必须长期涂药，冬天脚气病的症状不能完全根治，仅仅只能减缓菌的活动，因此希望开发治疗效果高的药剂。此外，脚气病的发病是由发癣菌或念珠菌引起的，发癣菌和念珠菌之间的区别是靠专门医生用显微镜观察，只能通过菌的培养来判别，由于判别困难因此对双方都有效的药剂是重要的。如前所述，咪唑系抗真菌剂有局部的副作用，如皮肤的刺激感、发红、出疹子等，在减少它们在药剂中的配合量从而降低副作用方面下工夫也是必要的。
本发明者们以开发对发癣菌和念珠菌双方都具有杀菌效力的药剂以及改善其使用感为目的，为选择咪唑系抗真菌剂和具有有效作用的药剂而进行了各种筛选。结果发现某种季铵盐在杀菌力方面具有相乘的增强效果，并基于这种发现而完成了本发明。
也就是说，本发明涉及一种抗真菌剂用组合物，其特征在于含有咪唑系抗真菌剂及季铵盐。
咪唑系抗真菌剂中，优选的物质是咪康唑、益康唑、克霉唑、联苯苄唑等。而且，咪康唑、益康唑的盐也可使用。尤其是硝酸盐被广泛使用。
所谓季铵盐是指作为阳离子表面活剂属于季铵盐的物质，本发明中优选的季铵盐有苄索氯铵、苯扎氯铵、地喹氯铵等。
咪唑系抗真菌剂的配合量为0.2～1重量％，优选0.5～1重量％。
季铵盐的配合量为0.1～1重量％，优选0.5～1重量％，例如苄索氯铵的配合量为0.5～1.0重量％，苯扎氯铵的配合量为0.1～1重量％，优选0.5～1重量％。
相对于1重量份的咪唑系抗真菌剂，优选配合季铵盐0.1～1重量份，更优选配合0.1～0.5重量份。
本发明的有效成分中，可根据需要混合公知的添加剂等，可用通常方法做成液剂、洗涤剂、乳剂、酊剂、软膏剂、霜剂、水性凝胶剂、油性凝胶剂、气溶胶等外用制剂。
作为水溶性成分，可列举丙二醇、1，3-丁二醇、甘油、乙醇、聚乙二醇类等。
作为油性成分，可列举己二酸二异丙酯、硬脂酰醇、鲸蜡醇、三十碳烷、中链甘油三酯等。
作为高分子物质，可列举羧乙烯基聚合物、甲基纤维素等。
作为pH调节剂，可列举氢氧化钠等无机盐、二异丙醇胺等有机胺类等。
作为抗氧化剂，可列举二丁基羟基甲苯(BHT)、丁基羟基茴香醚(BHA)、α-生育酚、异抗坏血酸、焦亚硫酸钠等。
作为着色剂，可列举氧化钛等。
作为表面活性剂，例如可列举聚氧乙烯硬化蓖麻油、山梨聚糖单硬脂酸酯、山梨聚糖单棕榈酸酯、单硬脂酸甘油酯、山梨聚糖单十二烷酸酯、聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物、聚山梨酸酯类、月桂基硫酸钠、蔗糖脂肪酸酯、卵磷酯等。
作为稳定剂，可列举EDTA-2Na等。
此外，本发明特别优选的抗真菌剂用组合物是以含有咪唑系真菌剂及地喹氯铵为特征的抗真菌剂用组合物。
如果从已确认相乘杀菌效果的季铵盐类中进一步研究皮肤刺激性、制剂化等，如表1所示，地喹氯铵是最适宜的。
表1化合物名称 适于制剂性 皮肤刺激性 苯扎氯铵 ○ △ 地喹氯铵 ○ ○
本发明中，硝酸双氯苯咪唑的有效配合量为0.2～1重量％，优选0.5～1重量％。
地喹氯铵的有效配合量为0.05～0.5重量％，优选0.1～0.5重量％。
相对于1重量份硝酸双氯苯咪唑地喹氯铵为0.1～1重量份，优选0.1～0.5重量份。
本发明药剂是一种杀菌效果被增强的强效抗真菌剂。
以下列举试验例具体说明本发明的效果。
试验例1
(1)供试菌株
供试菌株采用以下菌类。
红色发癣菌(Trichophyton rubrum)
须发癣菌(Trichophyton mentagrophytes)
(2)孢子液的制备方法
在装有1/10萨氏琼脂培养基的试验管的斜面上植入供试菌，于28℃培养3～4周。培养后用灭菌刮勺取出菌体，将其移送到装有玻璃珠和10ml含有0.1％Tween80的生理食盐水的三角烧瓶(100ml容积)中，振荡1小时后，经棉塞过滤，成为孢子液。孢子液冷藏保存，在1个月内使用
(1/10萨氏琼脂培养基的组成)
葡萄糖4.0g、胨1.0g、磷酸二氢钾(无水)1.5g，硫酸镁(7水合物)1.0g，硝酸钠1.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1000ml。
(3)供试药剂的制备
供试药剂使用硝酸双氯苯咪唑、苯扎氯铵、地喹氯铵、苄索氯铵以及水杨酸；作为溶解、稀释用溶剂使用DMSO，并调节成试验浓度制得2倍稀释系列。
(4)试验方法
将经过稀释的供试药剂和萨氏琼脂培养基(荣研)按1∶99的比例混合并固化后，接种约105个/毫升的孢子液。于28℃培养5天，确认有无菌的发育。
DMSO浓度规定为对孢子发芽无影响的1％以下。
(5)判定及计算式
相乘效果的判定是根据培养结束时确认菌不再发育的最小药剂浓度(MIC：最小抑菌浓度，μg/ml)算出FIC指数(Fractional Inhihltory Concentration indcx)
(计算式)C 指数＝a/a0+b/b0
a：硝酸双氯笨咪唑和供试药剂并用时的硝酸双氯苯咪唑的MIC：
a0：硝酸双氯苯咪唑单独使用时的MIC；
b：硝酸双氯苯咪唑和供试药剂并用时的供试药剂的MIC；
b0：供试药剂单独使用时的MIC。 (判定)根据以下标准判定有无并用效果
＞2 ：拮抗作用
2以下～大于1 ：相加作用
1以下 ：相乘作用
(6)结果
判断相乘效果的FIC指数值，经考虑抑菌评价以及1次筛选后设定1.0以下为具有相乘效果。其结果如表2所示，确认几乎所有的药剂都具有相加或相乘效果：
表2 FIC指数化合物名称 红色发癣菌 须发癣菌苄索氯铵 0.49 0.55苯扎氯铵 0.12 0.26地喹氯铵 0.47 0.68水杨酸 0.44 0.72
试验例2 (1)供试菌株
供试菌株采用以下菌类。
红色发癣菌(Trichophyton rubrum)
须发癣菌(Trichophyton mentagrophytes) (2)孢子液的制备方法
按与试验例l同样方法制备 (3)供试药剂的制备
供试药剂使用硝酸双氯苯咪唑、硝酸益康唑、克霉唑、联苯苄唑及地喹氯铵；作为溶解、稀释溶剂使用DMSO并调节成试验浓度制得2倍稀释系列。 (4)试验方法
按与试验例1同样方法进行。 (5)判定及计算式
按与试验例1同样方法计算和判定。 (6)结果
结果示于表3中。
表3 咪唑系抗真菌剂和
地喹氯铵的相乘效果 FIC指数 化合物名称 红色发癣菌 须发癣菌 硝酸双氯苯咪唑 0.32 0.55 硝酸益康唑 0.63 0.63 克霉唑 0.38 1.25 联苯苄唑 0.25 0.14
其结果如表3所示，除了克霉唑对须发癣菌的效果之外，都显示出与地喹氯铵的强的相乘效果。
根据以上结果可清楚地看出，由于与地喹氯铵组合而导致的相乘效果，不仅硝酸双氯苯咪唑具有，而且咪唑系抗真菌剂均具有这种效果。
试验例3 (1)供试菌株
供试菌株采用以下菌类。
红色发癣菌(Trichophyton rubrum)
须发癣菌(Trichophyton mentagrophytes) (2)孢子液的制备方法
按与试验例1相同方法制备。 (3)供试药剂的制备
供试药剂使用硝酸双氯苯咪唑(MCZ)、水杨酸、苯扎氯铵(BAC)及地喹氯铵(DQ)；作为溶解、稀释溶剂使用DMSO并调节成试验浓度制得2倍稀释系列 (4)试验方法
在经过滤灭菌的20mM磷酸缓冲液(pH6.5)20ml中添加各药剂100μl，经混合后按照105个/毫升的浓度加入孢子液(通常50～200μl)，并搅拌之。于30℃保温并测定第1天、第2天及第3天的存活孢子数。此外，DMSO浓度规定在对孢子发芽不会有影响的1％以下。 (5)存活孢子数的测定方法
孢子液及试验液中的存活孢子数是通过使用灭菌生理食盐水或LP稀释液(DAIGO)制得10倍稀释系列，将各稀释液50μl涂抹在预先制备的萨氏琼脂培养基(荣研)上，于28℃在红色发癣菌的情况下培养4天以上，须发癣菌的情况下培养3天以上，根据出现的菌落数算出孢子液或试验液中存活的孢子数。 (6)相乘效果的判定
根据文献(Antimicrobial Agents and Chemotherapy Feb.1977，p.225-228)，如果单独时和并用时的存活孢子数之差约为2个数量级以上则被判断为有相乘效果
(试验结果) (1)硝酸双氯苯咪唑的杀菌曲线
确认了硝酸双氯苯咪唑单独在灭菌生理食盐水(pH)中的杀菌力。其结果如图1所示，杀菌力随着浓度而增大。并用效果的试验，选择容易判定相乘杀菌效果的3.13μg/ml浓度。 (2)药剂并用时的杀菌曲线
表4示出各药剂与硝酸双氯苯咪唑的际准内最大配比。
表4 化合物名称 配比* 水杨酸 苯扎氯铵 地喹氯铵 10 1 0.5
*)硝酸双氯苯咪唑的配合量规定为1的情况下
并用时的杀菌力是通过在3.13μg/ml的硝酸双氯苯咪唑中按各自最大配比添加各药剂而得以确认。
如图2所示，并用时的杀菌力除了水杨酸外，都被确认为比起硝酸双氯苯咪唑单独使用时有增强。
以下对各药剂的效果进行详细讨论。
图3中示出水杨酸的结果。
水杨酸单独使用时完全看不到有杀菌力，并用时的杀菌力也只是与硝酸双氯苯咪唑单独使用时大致相等或在其以下。根据1次筛选的FIC指数的结果，水杨酸也可推测有抑菌的并用效果。
图4示出苯扎氯铵的结果
苯扎氯铵单独使用时，确认在红色发癣菌的情况下与硝酸双氯苯咪唑效果相同，在须发癣菌情况下，具有比硝酸双氯苯咪唑高的杀菌力，并用时两种菌在第1天都在检测界限以下。
图5示出地喹氯铵的结果
地喹氯铵单独使用时的杀菌力与硝酸双氯苯咪唑相等，一旦并用，在第2天即在检测界限如下
杀菌力相乘效果的判定，根据文献(Antimicrobial Agents andChemotherapy，Feb 1977，p. 225～228)，如果单独时和并用时的存活孢子数之差为2个数量级以上则被判定为有效果，因此对苯扎氯铵及地喹氯铵判断为具有相乘的杀菌力。
试验例4 (1)供试菌株
供试菌株采用以下菌类
白色念珠菌(Candida albicans)
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) (2)菌液的制备方法
白色念珠菌在萨氏琼脂培养基(荣研)中于28℃培养24小时，按照约106个/毫升那样悬浮在灭菌生理食盐水中，将它作为菌液。金黄色葡萄球菌在磺胺剂敏感试验培养基(荣研)中于37℃培养18小时，按照约106个/毫升那样悬浮在灭菌生理食盐水中，将它作为菌液。 (3)供试药剂的制备
供试药剂使用硝酸双氯苯咪唑及地喹氯铵；作为溶解、稀释溶剂使用DMSO并调节成试验浓度制得2倍稀释系列。 (4)试验方法
将经过稀释的供试药剂和萨氏琼脂培养基(荣研)按1∶99的比例混合并固化后，接种白色念珠菌的菌液。于30℃培养2天，确认有无菌的发育。
将经过稀释的供试药剂和Mueller-Hinton琼脂培养基(荣研)按1∶99的比例混合并固化后，接种全黄色葡萄球菌。于30℃培养24小时，确认有无菌的发育 (5)判定及计算式
按与试验例1同样方法计算和判定 (6)结果
表5示出其结果
表5 供试菌株 FIC指数 白色念珠菌 0.11金黄色葡萄球菌 0.75
由于硝酸双氯苯咪唑和地喹氯铵配合而产生的相乘效果，即使对白色念珠菌和金黄色葡萄球菌也可得到确认。
试验例5
关于硝酸双氯苯咪唑和地喹氯铵并用时的配合比(1∶0.12～1.00)的影响进行了与试验例3同样的试验，图6示出其试验结果。
其结果是，并用时的杀菌力当配合比为1～0.12以上时比硝酸双氯苯咪唑及地喹氯铵单独使用时的杀菌力更强，确认也具有相乘效果。
试验例6：卵磷脂的影响
作为霜剂的基剂而使用的卵磷脂，众所周知是季铵盐等杀菌剂的灭活剂[石关忠一等，卫生试验所报告，第91号(1973)]，因此对于其对硝酸双氯苯咪唑及地喹氯铵的相乘效果带来的影响进行研究。
卵磷脂浓度在硝酸双氯苯咪唑单独使用的情况下，调节成配合比(硝酸双氯苯咪唑∶卵磷脂＝1∶0.5)，地喹氯铵单独使用时及与硝酸双氯苯咪唑并用时，将卵磷脂浓度规定为1.57μg/ml，进行与试验例3同样的试验。
其结果表明，这些卵磷脂的浓度完全没有影响。
以下列举实施例具体说明本发明
实施例1
(霜剂处方例)
硝酸双氯苯咪唑 100g
利多卡因 200g
地喹氯铵 10g
聚氧乙烯山梨糖醇酐单硬脂酸酯 400g
山梨糖醇酐单硬脂酸酯 200g
1，3-丁二醇 1,500g
中链脂肪酸甘油三酯 1,500g
单硬脂酸甘油酯 250g
EDTA-2Na 10g
精制水 总量至10,000g
(制造方法)
在水相成分(1，3-丁二醇、EDTA-2Na、地喹氯铵、精制水)中加入油相成分(硝酸双氯苯咪唑、利多卡因、山梨糖醇酐单硬脂酸酯、中链脂肪酸甘油三酯、单硬脂酸甘油酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐单硬脂酸酯)，混合物加温后按常法制得霜剂10,000g。
实施例2
(液剂处方例)
硝酸酸双氯苯咪唑 100g
地喹氯铵 20g
甘草酸二钾 50g
BHT 5g
乙醇 5,000g
精制水 总量至10,000ml
(制造方法)
将药剂溶解在乙醇中后，加精制水使其总量为10,000ml。
实施例3
(凝胶乳油处方例)
硝酸双氯苯咪唑 100g
地喹氯铵 20g
利多卡因 200g
聚氧乙烯山梨糖醇酐单硬脂酸酯 100g
丙二醇 1,000g
液态石蜡 500g
硬脂酰醇 100g
羧乙烯基聚合物 50g
二异丙醇胺 100g
精制水 总量至10,000g
(制造方法)
将油相成分(硝酸双氯苯咪唑、利多卡因、地喹氯铵、聚氧乙烯山梨糖醇酐单硬脂酸酯、液态石蜡、硬脂酰醇)加温溶解，冷却到室温。然后将羧乙烯基聚合物溶解在丙二醇中，于室温放置，使羧乙烯基聚合物膨润。将上述油相和水相在室温下搅拌制得凝胶乳油。
实施例4
(气雾剂处方)
原液：硝酸双氯苯咪唑 50g
地喹氯铵 5g
甘草酸二钾 25g
乙醇 2500g
精制水 5000ml
喷射剂：LPG 5000ml
(制造方法)
将在乙醇、精制水的基剂中溶解了主药成分的原液填充到容器中后，安装阀门，充填喷射剂，制成气雾剂。
以下简单说明附图。
图1示出硝酸双氯苯咪唑对红色发癣菌(A)和须发癣菌(B)的杀菌力。横轴表示保存天数，纵轴表示存活菌数/毫升的对数(也就是，1表示101个/毫升，2表示102个/毫升，3表示103个/毫升，4表示104个/毫升)。
图2示出各药剂并用时对红色发癣菌(A)和须发癣菌(B)的杀菌力。横轴表示保存天数，纵轴表示存活菌数/毫升的对数
MCZ表示硝酸双氯苯咪唑，BAC表示苯扎氯铵，DQ表示地喹氯铵。
图3示出水杨酸并用时对红色发癣菌(A)和须发癣菌(B)的杀菌力。横轴表示保存天数，纵轴表示存活菌数/毫升的对数。
MCZ表示硝酸双氯苯咪唑
图4示出苯扎氯铵并用时对红色发癣菌(A)和须发癣菌(B)的杀菌力。横轴表示保存天数，纵轴表示存活菌数/毫升的对数。
MCZ表示硝酸双氯苯咪唑，BAC表示苄索氯铵。
图5示出地喹氯铵并用时对红色发癣菌(A)和须发癣菌(B)的杀菌力。横轴表示保存天数，纵轴表示存活菌数/毫升的对数。
MCZ表示硝酸双氯苯咪唑，DQ表示地喹氯铵。
图6示出对于硝酸双氯苯咪唑和地喹氯铵并用时的配合比的影响进行研究的结果。横轴表示保存天数，纵轴表示存活菌数/毫升的对数。MCZ表示硝酸双氯苯咪唑。