分泌T2毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株.pdf

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摘要
申请专利号:

CN201510740455.1

申请日:

2015.11.02

公开号:

CN105255838A

公开日:

2016.01.20

当前法律状态:

实审

有效性:

审中

法律详情:

实质审查的生效IPC(主分类):C12N 5/20申请日:20151102|||公开

IPC分类号:

C12N5/20; C07K16/14; B01J20/24; B01J20/281; B01D15/38; C07D493/10; G01N33/577; C12R1/91(2006.01)N

主分类号:

C12N5/20

申请人:

中山出入境检验检疫局检验检疫技术中心; 中华人民共和国中山出入境检验检疫局; 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心; 北京中检维康生物技术有限公司

发明人:

李蓉; 王勇; 吴振兴; 冯雪雅; 张静; 王雄; 果旗

地址:

528400广东省中山市中山六路2号8楼13楼至19楼

优先权:

专利代理机构:

成都高远知识产权代理事务所(普通合伙)51222

代理人:

张娟

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内容摘要

本发明提供了一种分泌T-2毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株,还提供了该细胞分泌的T-2毒素单抗。本发明提供的单抗,其腹水效价比达到1:50000,优于现有的单抗。同时,该单抗与HT-2毒素的交叉反应达到92.8%,与其他多种抗原的交叉反应低于0.1%。包含该单抗的免疫亲和柱-液相色谱法,可以同时高效分离提取出样品中的T-2毒素与HT-2毒素,准确、经济、有效。

权利要求书

1.一种杂交瘤细胞株,其特征在于:该杂交瘤细胞株是中国微生物菌种保藏管理委
员会普通微生物中心保藏的编号为CGMCCNO.11181的杂交瘤细胞株。
2.一种T-2毒素单克隆抗体,其特征在于:该单克隆抗体是由权利要求1所述的杂
交瘤细胞株制备得到的。
3.一种免疫吸附剂,其特征在于:该免疫吸附剂包括固相载体和抗体,所述抗体包
括权利要求2所述的单克隆抗体。
4.根据权利要求3所述的免疫吸附剂,其特征在于:所述抗体还包括下述单克隆抗
体中的任一种或多种:
由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的编号为CGMCCNO.
5504的杂交瘤细胞株制备得到的单克隆抗体;
由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的编号为CGMCCNO.
5505的杂交瘤细胞株制备得到的单克隆抗体;
由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的编号为CGMCCNO.
5506的杂交瘤细胞株制备得到的单克隆抗体;
由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的编号为CGMCCNO.
9204的杂交瘤细胞株制备得到的单克隆抗体。
5.根据权利要求4所述的免疫吸附剂,其特征在于:所述抗体包括下述单克隆抗体:
权利要求2所述的单克隆抗体;
由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的编号为CGMCCNO.
5504的杂交瘤细胞株制备得到的单克隆抗体;
由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的编号为CGMCCNO.
5505的杂交瘤细胞株制备得到的单克隆抗体;
由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的编号为CGMCCNO.
5506的杂交瘤细胞株制备得到的单克隆抗体;
由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的编号为CGMCCNO.
9204的杂交瘤细胞株制备得到的单克隆抗体。
6.根据权利要求3-5任一项所述的免疫吸附剂,其特征在于:所述抗体与固相载体
是通过偶联方式结合的。
7.一种装载有权利要求3-6任一项所述免疫吸附剂的免疫亲和柱。
8.一种检测T-2毒素和HT-2毒素的试剂盒,其特征在于:它包括权利要求2所述的
单克隆抗体、权利要求3-6任一项所述的免疫吸附剂或/和权利要求7所述的免疫亲和柱。
9.一种提取T-2毒素和HT-2毒素方法,其特征在于:
(1)取样品,通过权利要求7所述的免疫亲和柱;
(2)洗涤,洗脱,得洗脱液,即可;其中,洗脱采用的的洗脱剂优选为甲醇。
10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于:所述液体样品是饲料提取液样品。

说明书

分泌T-2毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株

技术领域

本发明涉及一种分泌T-2毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株,还涉及该细胞株分泌的
T-2毒素单克隆抗体,包含该抗体的免疫吸附剂、免疫亲和柱、试剂盒,以及利用该免疫
亲和柱提取纯化T-2毒素和HT-2毒素的方法。

背景技术

T-2毒素和HT-2毒素是由多种真菌,主要是三线镰刀菌产生的单端孢霉烯族化合物
(trichothecenes,TS),HT-2毒素为T-2毒素的代谢产物。它们广泛分布于自然界,是常
见的污染田间作物和库存谷物的主要毒素,对人、畜危害较大。T-2和HT-2毒素主要作
用于细胞分裂旺盛的组织器官,如胸腺、骨髓、肝、脾、淋巴结、生殖腺及胃肠粘膜等,
抑制这些器官细胞蛋白质和DNA合成。此外,还发现该毒素可引起淋巴细胞中DNA单
链的断裂。T-2和HT-2毒素还可作用于氧化磷酸化的多个部位而引起线粒体呼吸抑制。
1973年联合国粮农组织(FAQ)和世界卫生组织(WHO)在日内瓦召开的联席会议上,
把这类毒素同黄曲霉素一样作为自然存在的最危险的食品污染源。

目前,T-2毒素、HT-2毒素的检测方法主要有薄层层析法、酶联免疫法(ELISA)。

薄层层析法,要接触大量的标准品,不利于实验者的健康,而且灵敏度很低。酶联免
疫法,只适用于定性检测,很容易出现假阳性和假阴性的现象。而免疫亲和层析-液相色
谱法是通过免疫亲和层析预处理样品分离提取待检物质,再用液相色谱法检测的方法,其
经济、快捷、精确、安全,但是制备得到分离提取待检物质的免疫亲和层析柱却并非易事,
最为关键的地方在于寻找同时有效结合T-2毒素、HT-2毒素的抗体。

王雄等人(抗T-2毒素单克隆抗体的制备及鉴定,中国卫生检验杂志,2010年2月,
20(2):301-304)报道了一种T-2毒素的单抗。尽管该单抗与黄曲霉素无交叉反应,但
是其与HT-2毒素的交叉反应为65.9%。因此,用于免疫亲和层析时,该抗体可以有效提
取T-2毒素,但无法有效提取HT-2毒素。同时,该单抗的效价仅为1:12000,与T-2毒素
的结合力不强,容易解离,导致最终的检测结果不准确。

因此,目前需要一种与其他毒素不发生交叉反应,效价高,并且可以同时有效提取
T-2毒素与HT-2毒素的抗体。

发明内容

为解决上述问题,本发明提供了一种杂交瘤细胞株,该杂交瘤细胞株是中国微生物菌
种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的编号为CGMCCNO.11181的杂交瘤细胞株。

本发明杂交瘤细胞株,命名为抗T2毒素、HT-2毒素单克隆抗体细胞,于2015年8
月21日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,其简称为CGMCC,其
地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,其保藏号为:CGMCCNO.11181。

本发明还提供了一种T-2毒素单克隆抗体,该单克隆抗体是由上述的杂交瘤细胞株制
备得到的。

本发明还提供了该免疫吸附剂包括固相载体和抗体,所述抗体包括本发明所述的单克
隆抗体。

优选地,所述抗体还包括下述单克隆抗体中的任一种或多种:

由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的编号为CGMCCNO.
5504的杂交瘤细胞株制备得到的单克隆抗体;

由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的编号为CGMCCNO.
5505的杂交瘤细胞株制备得到的单克隆抗体;

由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的编号为CGMCCNO.
5506的杂交瘤细胞株制备得到的单克隆抗体;

由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的编号为CGMCCNO.
9204的杂交瘤细胞株制备得到的单克隆抗体。

更优选地,所述抗体包括下述单克隆抗体:

由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的编号为CGMCCNO.
5504的杂交瘤细胞株制备得到的单克隆抗体;

由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的编号为CGMCCNO.
5505的杂交瘤细胞株制备得到的单克隆抗体;

由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的编号为CGMCCNO.
5506的杂交瘤细胞株制备得到的单克隆抗体;

由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的编号为CGMCCNO.
9204的杂交瘤细胞株制备得到的单克隆抗体。

进一步优选地,所述抗体与固相载体是通过偶联方式结合的。

本发明还提供了一种装载有上述免疫吸附剂的免疫亲和柱。

本发明还提供了一种检测T-2毒素和HT-2毒素的试剂盒,它包括前述的单克隆抗体、
前述的免疫吸附剂或/和前述的免疫亲和柱。

本发明还提供了一种提取T-2毒素和HT-2毒素方法,其特征在于:

(1)取样品,通过前述的免疫亲和柱;

(2)洗涤,洗脱,得洗脱液,即可;所述洗脱中,优选的洗脱剂为甲醇。

优选地,所述液体样品是饲料提取液样品。

而本发明的制备得到的T-2毒素单抗,腹水效价比达到1:50000,相比现有的单抗,
具有更高的效价比,与抗原的结合能力强。同时,该单抗与T-2毒素的结合率为100%,
与HT-2毒素的结合率达到92.8%,与其他多种抗原的交叉反应低于0.1%。也就是说,本
发明单抗会特异性结合T-2毒素和HT-2毒素,而不会与其他物质结合。因此,以其制备
为免疫吸附剂,可以将T-2毒素和HT-2毒素从样品中准确分离出来。

因此,在本发明提供的T-2毒素单抗的基础上,本发明的免疫亲和层析-液相色谱法
可以准确、高效、经济地检测许多商品中的T-2毒素和HT-2毒素。

除此之外,在本发明的具体实施方案中,以本发明的单抗和已知的3-乙酰脱氧雪腐
镰刀菌烯醇、黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮单抗制备得到的免疫亲和柱,可以
结合液相色谱同时准确地检测样品中T-2毒素、HT-2毒素、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、
黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮,进一步证明了本发明单
抗能与T-2毒素、HT-2毒素高效、特异结合,而不会结合其他毒素。

显然,根据本发明的上述内容,按照本领域的普通技术知识和惯用手段,在不脱离
本发明上述基本技术思想前提下,还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式,对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。
但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实
现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为样品中3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇的色谱图。

图2为样品中黄曲霉毒素B1,B2,G1,G2的色谱图。

图3为样品中赭曲霉毒素A的色谱图。

图4为样品中玉米赤霉烯酮的色谱图。

图5为样品中T-2毒素和HT-2毒素的色谱图。

具体实施方式

抗3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮单克隆抗
体的分别由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)的编号为CGMCC
NO.9204、CGMCCNO.5506、CGMCCNO.5505和CGMCCNO.5504的杂交瘤细
胞制备得到。上述杂交瘤细胞株均已在专利201510002847.8中公开,专利CN104707362
A中公开。其相应单抗的制备为本领域常规的制备方法。

实施例1制备T-2毒素单克隆抗体

1、动物免疫

免疫动物为8周龄左右雌性BALB/c小鼠。分别将抗原T-2-BSA(北京中检维康生物
技术有限公司自制)免疫10只小鼠。取适量免疫原(100mg/只)加等量弗氏完全佐剂,
制成乳化剂进行免疫,共免疫4-6次,每次间隔2周。除最后一次免疫为腹腔注射外,其
余均为颈背部皮下多点注射。

2、杂交瘤细胞的制备

①骨髓瘤细胞的培养

SP2/0骨髓瘤细胞在含10%胎牛血清的完全培养液中进行培养。当细胞处于对数生长
期时,按1:3-1:10比例稀释,传代,一般每3-4天进行1次传代或扩大培养。处于对数生
长期的细胞应浑圆、透亮、大小均一、排列整齐、呈半致密分布。选取处于生长旺盛、形
态良好的对数生长期细胞供融合用。融合前24h将SP2/0细胞扩大培养。融合当天,选
择处于对数生长期的细胞,用移液管将细胞吹下,收集于50mL离心管中,1000rpm离
心10min,然后用DMEM培养液重新悬浮,显微镜下计数并计算细胞成活率,大于90%
者,可用于融合。

②免疫脾细胞悬液的制备

采用ELISA对血清效价和抑制水平测定后,选取效价高、抑制水平好的小鼠于最后
一次免疫后第三天摘除眼球放血,并分离阳性血清作对照。

a)处死小鼠,置于75%酒精中浸泡5min后移入超净台,打开腹腔,无菌操作取出
小鼠脾脏,放入盛有5-10mLDMEM培养液的平皿中漂洗。

b)将脾脏移入另一盛有5mLDMEM不完全培养液的平皿中,用吸满DMEM培养液
的注射器针头插入脾脏,反复冲洗至脾细胞完全洗出。

c)将脾细胞悬液转移至50mL离心管中,1000rpm离心5min,弃上清液,以10mL
DMEM液悬浮,显微镜下计数。

3、细胞融合

a)分别吸取含6×107个脾细胞和含6×106个SP2/0细胞的细胞悬液(两种细胞数之
比为10∶1),合并置入50mL塑料离心管中,1000rpm离心5min,弃上清液;

b)用手指轻弹管底,使沉淀松散成糊状;

c)取50%PEG15001mL,左手匀速转动离心管,右手持1mL移液管吸取50%PEG
溶液0.7mL,沿转动的管壁(尽量接近细胞处)缓缓滴入,并控制时间在60s内加完,
然后将细胞悬液缓缓吸入移液管内,控制时间在30s内刚好吸完,静置30s后,再将细
胞悬液缓缓吹回到离心管中,时间控制在30s内;

d)立即在5min内加入25mLDMEM不完全培养液,终止反应。加入速度为:第1
min内加1mL,第2min内加4mL,剩余20mL在3min内加完。加液时应轻轻匀速转
动离心管,此时操作应轻柔;

e)1000rpm离心7min,弃上清液,加入20mLHAT培养液,轻轻吹吸使沉淀细胞
悬浮。此时操作应轻柔,切勿用力吹打;

f)将细胞悬液加入已铺有饲养细胞的96孔细胞培养板中,0.1mL/孔,置37℃、含
5%CO2的培养箱中培养;

g)每天观察并记录细胞生长情况。融合后第3天每孔用HAT完全培养液半量换液,
融合后第7、10天改用HT完全培养液半量换液,随后均用完全培养液换液。

4、杂交瘤细胞的筛选

融合后的细胞克隆长至孔底面积的1/4-1/3时,即可用间接竞争ELISA法对所有克隆
生长孔的培养上清进行检测,选择OD值高、抑制率大、克隆数目较少的细胞孔进行克隆,
并扩大培养。

5、杂交瘤细胞的克隆

采用有限稀释法进行细胞克隆,具体步骤如下:

a)将待克隆的阳性孔中的细胞悬浮,吸出悬浮液至含有1mLHT培养液的无菌试管
中;

b)取0.1mL细胞悬液计数。以HAT完全培养液稀释细胞至100个/mL。每个克隆细
胞做3个稀释度(100个/mL、10个/mL、5个/mL),分别加入于96孔细胞板中,每孔0.1
mL,即平均细胞数量分别为10个/孔、1个/孔、0.5个/孔。

c)将培养板置于37℃、含5%CO2的培养箱中培养7-10天,中间换液一次。当克隆
细胞长至孔底面积的1/4-1/3时,对其上清液进行间接竞争ELISA检测。取强阳性(OD
值高、抑制率最大)克隆扩大培养,冻存,同时按上法继续克隆至阳性率达100%;

d)将强阳性单克隆细胞扩大培养至12孔板,长满后扩至10mL细胞瓶,一部分冻
存,一部分继续培养,用于生产腹水,制备单克隆抗体。

本发明杂交瘤细胞即为前述方法最终得到的强阳性单克隆细胞,命名为抗T2毒素、
HT-2毒素单克隆抗体细胞,其于2015年8月21日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员
会普通微生物中心,其简称为CGMCC,其地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,
其保藏号为:CGMCCNO.11181。

本发明杂交瘤细胞又简称杂交瘤细胞11181。

6、单克隆抗体的制备

采用体内诱生腹水法制备单克隆抗体。选择8-10周BALB/c雌性小鼠10只,每只腹
腔内注射无菌石蜡油0.5mL。10-14天后,接种杂交瘤细胞(保藏号为:CGMCC
NO.11181)。将培养的杂交瘤细胞吹打下来,1000rpm离心10min,弃去上清液,用不完
全培养液将其混匀,并将细胞数调至1-4×105个/mL,每只小鼠腹腔注射0.5mL。植入细
胞后第7天起,每天观察小鼠腹部,待小鼠腹部明显膨大,用9#针头穿刺腹腔,收集腹
水,5000rpm离心10min,收集上清液,分装,-20℃保存备用。

7、抗体性能测试

7.1抗血清效价的测定

按照常规的间接ELISA法进行检测,用包被液将包被原0.2μg/mL包被,100μL/孔
加入酶标板,4℃包被过夜;弃包被液,加洗液,200μL/孔,于振荡器上振荡3min,洗
涤3次;加入6%明胶封闭液,200μL/孔,37℃封闭2h;洗涤3次,加入倍比稀释的待
测血清,100μL/孔,最后一列加阴性血清对照组,37℃反应30min;洗涤3次,加入
HRP-羊抗鼠IgG(1:4000倍稀释),100μL/孔,37℃反应30min;洗涤3次,加入TMB
底物液,100μL/孔,室温避光放置10min,加入2mol/LH2SO4终止反应,50μL/孔。用
酶标仪测定OD450nm值。并按下列公式计算P/N值:P/N值=阳性对照孔OD450nm均值/
阴性对照孔OD450nm均值。当P/N值>2时,即阳性对照OD450nm值大于2倍阴性对照孔
OD450nm值时,阳性血清最高稀释倍数作为血清的ELISA效价。

经测定,本实验制备的T-2毒素单克隆抗体的效价均达到1:50000,其与抗原的结
合能力强。

7.2单抗特异性的鉴定

按照间接ELISA法和方阵滴定法确定抗原抗体的最适工作浓度。在最佳工作条件下,
采用间接竞争ELISA法检测待测药物与不同药物的交叉反应率。空白对照吸光值为B0,
不同质量浓度药品的吸光值为B,以B/B0为纵坐标,质量浓度的对数为横坐标,绘制标
准品抑制曲线,得出50%抑制质量浓度。同时根据公式(1.1)计算交叉反应率,结果如
表1所示。

(1.1)

表1T-2毒素抗体特异性鉴定

药物种类
IC50μg/L
交叉反应率%
T-2毒素
6.5
100
HT-2毒素
7.0
92.8
黄曲霉毒素
>1000
<0.1
呕吐毒素
>1000
<0.1
玉米赤霉烯酮
>1000
<0.1
伏马毒素
>1000
<0.1

结果显示,本发明T-2毒素单克隆抗体与T-2毒素的结合率为100%,与HT-2毒素的
结合率为92.8%,而对其他的毒素,如黄曲霉毒素等则无交叉反应,说明本发明T-2毒素
单克隆抗体可以与T-2毒素、HT-2毒素高效、特异结合,而不会结合其他毒素,可以用
于T-2毒素、HT-2毒素的分离纯化。

综上,本发明制备得到了分泌T-2毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞,还采用该细胞制备
得到了T-2毒素单克隆抗体,该抗体的效价高,与T-2毒素和HT-2毒素均有良好的结合
能力,而与其他毒素则无交叉反应,可以同时有效结合、提取T-2毒素和HT-2毒素。

实施例2T-2毒素、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉
烯酮免疫亲和柱的制备

1.基质制备

称取所需1g的Sepharose基质粉末(每克冻干基质粉末可形成3.5ml终体积的溶胀基
质),溶于1mMHCl中。基质将会立即溶胀,然后置于烧结玻璃过滤器中使用1mMHCl
洗涤15min。

2.配体(抗体)偶联

a使用偶联缓冲液0.2MNaHCO3pH8.3溶解待偶联的杂交瘤细胞9204,5506,5505,
5504和11181分泌的3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉
烯酮、T-2毒素抗体(实施例1制备的抗体),抗体浓度为12.5mg/ml,溶解的抗体置于冰
浴中暂存。在一个带盖的可完全密封的容器中加入上述含有抗体的偶联缓冲液。迅速将
CNBr活化的Sepharose转移到抗体溶液中。室温条件(20-25℃)下采用end-over-end的
方式充分混匀上述的混和物2-4h,

b偶联率的计算:离心,2,000RMP×1min,将sepharose离心至管底,将上清液转移
至新的离心管中,测定上清液的蛋白质含量值。计算偶联率为98.3%(说明偶联很成功)。
取离心至管底的sepharose,使用偶联缓冲液进行洗涤,除去多余的配体。

c封闭:封闭所有残留的活性基团。转移基质至0.1MTris-HCl缓冲液中。室温条件
下静置2-4h

d为除去偶联后未偶联上的多余的配体,依次用低、高两种pH的缓冲液对基质进行
洗涤,至少洗涤3个循环,每种缓冲液的使用量至少5倍基质体积。

每个洗涤循环步骤:先用0.1M醋酸/醋酸钠缓冲液洗涤,接着再用0.1MTris-HCl缓
冲液进行洗涤。

e用5倍胶体积的0.01%NaN3-PBS洗涤,并使用0.01%NaN3-PBS保存。

3.装柱

使用结合缓冲液制备浆液,以75%沉降基质和25%缓冲液的比例进行混合。以连续
性的操作向柱内倾入浆液。使用一个斜靠在柱内壁上的玻璃棒进行填柱操作,将有助于减
少气泡的产生。填柱后,关闭亲和柱下端的开口,并取下亲和柱的顶端部件。仔细操作,
使用缓冲液加入充填亲和柱的余下部分,以在亲和柱的顶端形成一个向上的弯液面。将顶
端筛板以一定的角度插入到亲和柱中,确保在筛板的下方没有空气。将筛板锁定在基质表
面适当的位置上,打开亲和柱下方的开口,用5倍柱床体积的无菌过滤的0.01%NaN3-PBS
过柱,并使用0.01%NaN3-PBS保存,至此T-2毒素、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、黄曲
霉毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮亲和柱已装填并平衡完毕,可直接供使用。

实施例3饲料中的T-2毒素、HT-2毒素、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、黄曲霉毒素B1、
B2、G1、G2、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮的检测

1.0饲料中的T-2毒素、HT-2毒素、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、黄曲霉毒素B1、B2、
G1、G2、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮的检测

饲料添加回收实验,分别添加20μg/kg,50μg/kg,100μg/kg三个浓度梯度。每个实验
做五组平行试验。

1.1饲料中T-2毒素、HT-2毒素、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇,黄曲霉毒素B1,B2,G1,
G2,赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮的提取:

准确称取经过磨细(粒度小于2mm)的试样50.0g于250mL具塞锥形瓶中,加入5.0g
氯化钠及准确加入100.0mL甲醇-水(8+2),以均质器高速搅拌提取2min,或摇床震荡
30min。定量滤纸过滤,准确移取5.0mL滤液并加入45.0mLPH7.0PBS溶液稀释,用玻
璃纤维滤纸过滤1~2次,至滤液澄清。

将免疫亲和柱连接于10.0mL玻璃注射器下。准确移取10.0mL样品提取液注入玻璃
注射器中,将空气压力泵与玻璃注射器连接,调节压力使溶液以约6mL/min流速缓慢通
过免疫亲和柱,直至2~3mL空气通过柱体。以10.0mL水淋洗柱子2次,弃去全部流出
液,并使2mL~3mL空气通过柱体。准确加入2.0mL色谱级甲醇洗脱,流速为1mL/min
~2mL/min,收集全部洗脱液于玻璃试管中,供检测用。

2.0高效液相色谱条件

3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇

a流动相:乙腈:水(10:90)

b检测器:紫外检测器波长218nm

c色谱柱:C-18柱(柱长250mm,内径4.6mm,填料直径5μm)

d流速:0.8mL/min

黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2:

a流动相:甲醇-水(45+55)

b检测器:荧光检测器激发波长360nm,发射波长440nm

c色谱柱:C-18柱(柱长150mm,内径4.6mm,填料直径5μm)

d流速:0.8mL/min

e光化学衍生化系统:光化学衍生池(连接于色谱柱后,然后通向荧光检测器)

赭曲霉毒素A:

a流动相:乙腈:水:乙酸(49.5:49.5:1)

b检测器:荧光检测器激发波长333nm,发射波长477nm

c色谱柱:C-18柱(柱长250mm,内径4.6mm,填料直径5μm)

d流速:0.8mL/min

玉米赤霉烯酮

a流动相:乙腈-水(60:40)

b检测器:荧光检测器激发波长274nm,发射波长440nm

c色谱柱:C-18柱(柱长150mm,内径4.6mm,填料直径5μm)

d流速:0.8mL/min

T-2毒素、HT-2毒素

a流动相:甲醇-水(60:40)

b检测器:紫外检测器208nm

c色谱柱:C-18柱(柱长150mm,内径4.6mm,填料直径5μm)

d流速:0.8mL/min

3.0定量

用进样器吸取50μL标准工作液注入高效液相色谱仪,在上述色谱条件下测定标准溶
液的响应值(峰高或峰面积),分别得到标准溶液高效液相色谱图。参考谱图3-乙酰脱氧
雪腐镰刀菌烯醇见图1,黄曲霉毒素B1,B2,G1,G2见图2,赭曲霉毒素A见图3,玉
米赤霉烯酮见图4,T-2毒素和HT-2毒素见图5

4.0结果

花生添加回收率结果都在80-100%之间,RSD均小于10%。结果表明该方法完全满
足饲料中3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇,黄曲霉毒素,赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮检测
的分析要求。结果分别见表2-7。

表2饲料中3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇添加回收率结果


表3饲料中黄曲霉毒素添加回收率结果


表4饲料中赭曲霉毒素A添加回收率结果


表5饲料中玉米赤霉烯酮添加回收率结果


表6饲料中T-2毒素添加回收率结果


表7饲料中HT-2毒素添加回收率结果


可见,本发明提供的T-2毒素单抗,可以同时高效分离提取出T-2毒素与HT-2毒素,
还不会对其他物质——3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、赭曲
霉毒素A、玉米赤霉烯酮的测定产生干扰,从而可以准确测定出样品中的包含T-2毒素与
HT-2毒素在内的多种物质含量。

综上所述,本发明分泌T-2毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其分泌的单抗的腹水效
价比达到1:50000,优于现有的单抗。同时,该单抗与HT-2毒素的交叉反应达到92.8%,
与其他多种抗原的交叉反应低于0.1%。包含该单抗的免疫亲和柱-液相色谱法,可以同时
高效分离提取出T-2毒素与HT-2毒素,还不会对其他物质的测定产生干扰,从而准确测
定出样品中的包含T-2毒素与HT-2毒素在内的多种物质含量。

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本发明提供了一种分泌T-2毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株,还提供了该细胞分泌的T-2毒素单抗。本发明提供的单抗,其腹水效价比达到1:50000,优于现有的单抗。同时,该单抗与HT-2毒素的交叉反应达到92.8,与其他多种抗原的交叉反应低于0.1。包含该单抗的免疫亲和柱-液相色谱法,可以同时高效分离提取出样品中的T-2毒素与HT-2毒素,准确、经济、有效。 。

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