一种从百里香属植物中得到的灯盏乙素技术领域
本发明属于医药领域，具体而言，涉及一种提取物灯盏乙素，特别是一种从唇形科百里香属植物中提取得到的灯盏乙素。
背景技术
唇形科百里香属植物全世界共有300~400种左右，主要分布在北非、欧洲和亚洲的温热带地区，如法国、西班牙等地。目前全世界都有栽培品种。我国分布的百里香属植物主要包括百里香（Thymusruongolicus）、阿尔泰百里香（Thymusaltaicus）、地椒（Thymusquinquelostatus）等12个种和展毛地椒(Thymusquinquecostatusvar.przewalskii)、亚洲地椒(Thymusquinquecostatusvar.asiaticus)两个变种，大致分布在黑龙江、河北、山东，甘肃和陕西、青海、新疆等地。其性温、味辛，有小毒，具有祛风解表、行气止痛和清热解毒的功能。临床上主要用于治疗各种炎症及肿瘤等。
灯盏乙素(scutellarin)为一种黄酮苷，由其制成的制剂灯盏花素片、灯盏花素注射液与注射用灯盏花素对于急性心肌梗死、缺血性脑血管病，冠心病心绞痛等心脑血管病变疗效好而且不良反应少。同时也可应用于慢性肾衰竭、肾病综合症、糖尿病及其并发症、慢性肺源性心脏病、慢性乙肝等疾病的治疗。灯盏乙素原料与其制剂年产值逐年递增，并且灯盏花素及注射用灯盏花素已收《中国药典》。
由于灯盏花素制剂疗效稳定，副作用小，全国有近100家制药企业生产该类药物制剂，加上部分药材或其提取物用于出口，因此，目前灯盏乙素的原药材供不应求，导致其收购价格一直上升。因此有必要寻找制备灯盏乙素的新原料。
目前百里香或地椒等百里香属植物的研究多集中于其挥发油成分及其药理活性研究，但是其非挥发部位化学成分及其生物活性研究基本处于空白。
发明内容
本发明提供了一种以唇形科百里香属植物为原料制备得到的灯盏乙素及其相关制备方法。
本发明还提供了一种产品，即含灯盏乙素提取物，该提取物是以唇形科百里香属植物为原料，尤其是以地椒、展毛地椒、亚洲地椒、百里香、阿尔泰百里香的非挥发部位制备得到，并且灯盏乙素含量较高。
另外，本发明还提供了一种产品，即灯盏乙素，灯盏乙素是由百里香属植物如地椒、展毛地椒、亚洲地椒、百里香、阿尔泰百里香植物通过溶剂提取、大孔树脂纯化及丙酮重结晶制备得到。
本发明也包括一种制备灯盏乙素的方法，步骤如下：
(1)将唇形科百里香属植物，如地椒、展毛地椒、亚洲地椒、百里香或阿尔泰百里香药材，用溶剂提取；
(2)将上一步的提取液滤过，减压回收溶剂，得灯盏乙素粗提物浸膏;
其中，第(1)步所述溶剂可以是乙醇、甲醇、丙酮、水，乙醇或甲醇的浓度为40~80%，优选浓度为60~80%，其用量是药材质量的20~40倍，提取2~4次，优选3次，每次1~2小时，优选1~1.5小时，可采用热回流、温浸、超声等方法提取;
第(2)步所述减压回收溶剂的压力控制在0.06~0.08MPa;
灯盏乙素粗提物浸膏中灯盏乙素含量在4%以上，优选5~10％，更进一步优选15~20%，更进一步优选为25~30%。
本发明从百里香属植物中提取精制灯盏乙素的方法包括以下步骤：
(1)将唇形科百里香属植物，如地椒、展毛地椒、亚洲地椒、百里香或阿尔泰百里香药材，用溶剂提取；
(2)将上一步的提取液滤过，减压回收溶剂，得灯盏乙素粗提物浸膏;
其中，第(1)步所述溶剂可以是乙醇、甲醇、丙酮、水，乙醇或甲醇的浓度为40~80%，优选浓度为60~80%，其用量是药材质量的20~40倍，提取2~4次，优选3次，每次1~2小时，优选1~1.5小时，可采用热回流、温浸、超声等方法提取;
第(2)步所述减压回收溶剂的压力控制在0.06~0.08MPa;
灯盏乙素粗提物浸膏中灯盏乙素含量在4%以上，优选5~10%，更进一步优选15~20%，更进一步优选为25~30%;
(3)取步骤(2)的浸膏用水溶解、过滤，得上柱液；
(4)取上述上柱液，通过大孔吸附树脂柱，水洗涤后，弃水洗液，采用20~70%乙醇，以0.5~2Bv/hr的流速洗脱，收集洗脱液；
(5)用高效液相色谱法对洗脱液中灯盏乙素的富集率和纯度进行检测；
(6)在上述(4)中的灯盏乙素的粗提物中加入甲醇、乙醇或丙酮进行反复重结晶，优选丙酮，得到纯度大于80%，优选纯度大于95%的灯盏乙素。
第(3)步所述浸膏用水溶解配制成重量百分比浓度为10~20%的溶液，过滤，得上柱液。
第(4)步所述的大孔树脂为HPD200A、HPD700、D101、AB-8、HPD722、HPD400或DM130大孔树脂中任意一种。并且大孔树脂的用量与浸膏的重量比为15~30:1。
第(4)步所述的提取液过大孔树脂吸附后，先用1~7Bv的水，以0.5~2Bv/hr的流速洗涤，弃水洗液后再用乙醇水溶液洗脱。
第(6)步所述的用5~10倍量的丙酮进行重结晶4~8次，既得纯度高于95%的灯盏乙素。
由第(2)步所得到的浸膏中，灯盏乙素含量为4%以上，优选5~10％，更进一步优选15~20%，更进一步优选为25~30%；由第（4）步所得到的浸膏中，灯盏乙素含量为50%以上，优选为55~65%，更进一步优选为65~75%。
本发明所述地椒(T.quinquecostatus)可取自不同地方，例如可以是取自甘肃盐池和庆阳、陕西榆林和靖边、宁夏隆德等地，且可在6~9月采摘。
本发明所述提取物的提取方法，可以采用不同溶剂（乙醇、甲醇、丙酮、水）用不同的提取方法（热回流、温浸、超声等）提取，经处理得到一含灯盏乙素的粗提物，然后可采用大孔树脂分离技术和丙醇处理等方法进一步纯化得到一纯度较高的灯盏乙素。
本发明的优点：唇形科百里香属植物，特别是百里香和地椒两种植物中均含有灯盏乙素，并且百里香属植物中的非挥发部位未曾开发过，之前都弃之不用。因此本发明首次将其用作提取灯盏乙素的原料，不仅提供了一种灯盏乙素的药材来源，而且还可以变废为宝。
灯盏乙素作为一种重要的植物中间体，目前灯盏乙素的临床应用和灯盏乙素的生产制备缺乏。本申请人通过长期研究发现唇形科百里香属植物，特别是地椒(T.quinquecostatus)、百里香（T.ruongolicus）植物中含有灯盏乙素，并通过高效液相色谱法(HPLC)测定了该植物中灯盏乙素的含量。通过与灯盏乙素的指纹图谱比较发现，其相似度非常高。
附图说明
图1为地椒提取物的制备流程图。
图2为灯盏乙素(野黄芩苷)标准品的HPLC图谱。
图3为地椒的HPLC图谱。
具体实施方式
以下由本发明的优选实施例，进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段。
实施例1：地椒中灯盏乙素的制备
首先，取地椒药材1.0kg，用30倍量的质量分数为70%的乙醇回流提取3次，每次1.5小时。将上一步的提取液滤过，减压至0.08MPa，回收乙醇，得到浸膏200g。浸膏中灯盏乙素含量在5.6%。取浸膏20g用水溶解配制成重量分数为15%的溶液、过滤，得上柱液；此上柱液通过AB-8大孔吸附树脂(400g)柱，4Bv水洗涤后，弃水洗液；用50%乙醇，以1Bv/hr的流速洗脱，收集洗脱液；用高效液相对洗脱液中灯盏乙素的富集率和纯度进行检测；富集后灯盏乙素含量为68.8%。在上述灯盏乙素的粗提物中加入10倍量的丙酮进行反复重结晶5次，得到纯度为95.6%的灯盏乙素。
实施例2：地椒中灯盏乙素的制备
取地椒药材1.0kg，用40倍量的质量分数为80%的甲醇温浸提取3次，每次1.5小时。将上一步的提取液滤过，减压至0.07MPa，回收甲醇，得到浸膏约195g。浸膏中灯盏乙素含量在5.1%。浸膏20g用水溶解配制成重量分数为20%的溶液、过滤，得上柱液；此上柱液通过HPD200A大孔吸附树脂(600g)柱，5Bv水洗涤后，弃水洗液；用60%甲醇，以1Bv/hr的流速洗脱，收集洗脱液；用高效液相色谱法对洗脱液中灯盏乙素的富集率和纯度进行检测；富集后灯盏乙素的含量为为69.4%，在上述灯盏乙素的粗提物中加入10倍量的丙酮进行反复重结晶5次，得到纯度为96.3%的灯盏乙素。
实施例3：地椒中灯盏乙素的制备
取地椒药材1.0kg，用30倍量的质量分数为60%的甲醇超声提取3次，每次1.5小时。将上一步的提取液滤过，减压至0.06MPa，回收甲醇，得到浸膏约190g。浸膏中灯盏乙素含量在4.6%。取浸膏20g用水溶解配制成重量分数为15%的溶液、过滤，得上柱液；此上柱液通过HPD722大孔吸附树脂(600g)柱，4Bv水洗涤后，弃水洗液；用55%甲醇，以1Bv/hr的流速洗脱，收集洗脱液；用高效液相对洗脱液中灯盏乙素的富集率和纯度进行检测；富集后灯盏乙素的含量为66.7%，在上述灯盏乙素的粗提物中加入10倍量的丙酮进行反复重结晶4次，得到纯度大于90.7%的灯盏乙素。
实施例4：展毛地椒中灯盏乙素的制备
首先，取展毛地椒地椒药材1.0kg，用30倍量的质量分数为70%的乙醇回流浸取3次，每次1.5小时。将上一步的提取液滤过，减压至0.08MPa，回收乙醇，得到浸膏约210g。浸膏中灯盏乙素含量在6.1%。取浸膏20g用水溶解配制成重量分数为15%的溶液、过滤，得上柱液；此上柱液通过AB-8大孔吸附树脂(400g)柱，4Bv水洗涤后，弃水洗液；用50%乙醇，以1Bv/hr的流速洗脱，收集洗脱液；用高效液相对洗脱液中灯盏乙素的富集率和纯度进行检测；富集后灯盏乙素的含量为69.7%，在上述灯盏乙素的粗提物中加入10倍量的丙酮进行反复重结晶5次，得到纯度为95.6%的灯盏乙素。
实施例5：展毛地椒中灯盏乙素的制备
首先，取展毛地椒药材1.0kg，用20倍量的质量分数为80%的甲醇回流浸取3次，每次1.5小时。将上一步的提取液滤过，减压至0.07MPa，回收甲醇，得到浸膏约196g。浸膏中灯盏乙素含量在5.6%。浸膏20g用水溶解配制成重量分数为20%的溶液、过滤，得上柱液；此上柱液通过D101大孔吸附树脂(600g)柱，5Bv水洗涤后，弃水洗液；用50%甲醇，以1Bv/hr的流速洗脱，收集洗脱液；用高效液相色谱法对洗脱液中灯盏乙素的富集率和纯度进行检测；富集后灯盏乙素的含量为64.9%，在上述灯盏乙素的粗提物中加入10倍量的丙酮进行反复重结晶5次，得到纯度为95.1%的灯盏乙素。
实施例6：展毛地椒中灯盏乙素的制备
取展毛地椒药材1.0kg，用20倍量的质量分数为60%的乙醇超声取3次，每次1.5小时。将上一步的提取液滤过，减压至0.06MPa，回收乙醇，得到浸膏约188g。浸膏中灯盏乙素含量在4.8%。取浸膏20g用水溶解配制成重量分数为15%的溶液、过滤，得上柱液；此上柱液通过HPD700大孔吸附树脂(600g)柱，4Bv水洗涤后，弃水洗液；用60%乙醇，以1Bv/hr的流速洗脱，收集洗脱液；用高效液相对洗脱液中灯盏乙素的富集率和纯度进行检测；富集后灯盏乙素的含量为62.1%，在上述灯盏乙素的粗提物中加入10倍量的丙酮进行反复重结晶5次，得到纯度为95.3%的灯盏乙素。
实施例7：百里香中灯盏乙素的制备
取百里香药材1.0kg，用30倍量的质量分数为70%的乙醇回流提取3次，每次1.5小时。将上一步的提取液滤过，减压至0.08MPa，回收乙醇，得到浸膏约205g。浸膏中灯盏乙素含量在5.3%。取浸膏20g用水溶解配制成重量分数为15%的溶液、过滤，得上柱液；此上柱液通过AB-8大孔吸附树脂(600g)柱，4Bv水洗涤后，弃水洗液；用50%乙醇，以1Bv/hr的流速洗脱，收集洗脱液；用高效液相对洗脱液中灯盏乙素的富集率和纯度进行检测；富集后灯盏乙素的含量为69.8%，在上述灯盏乙素的粗提物中加入10倍量的丙酮进行反复重结晶5次，得到纯度为95.8%的灯盏乙素。
实施例8：百里香中灯盏乙素的制备
取百里香药材1.0kg，用40倍量的质量分数为70%的甲醇回流提取3次，每次1.5小时。将上一步的提取液滤过，减压至0.07MPa，回收甲醇，得到浸膏约212g。浸膏中灯盏乙素含量在5.6%。取浸膏20g用水溶解配制成重量分数为20%的溶液、过滤，得上柱液；此上柱液通过HPD200A大孔吸附树脂(600g)柱，5Bv水洗涤后，弃水洗液；用55%甲醇，以1Bv/hr的流速洗脱，收集洗脱液；用高效液相对洗脱液中灯盏乙素的富集率和纯度进行检测；富集后灯盏乙素的含量为69.4%，在上述灯盏乙素的粗提物中加入10倍量的丙酮进行反复重结晶5次，得到纯度为96.3%的灯盏乙素。
实施例9：百里香中灯盏乙素的制备
取百里香药材1.0kg，用40倍量的质量分数为70%的甲醇超声提取3次，每次1.5小时。将上一步的提取液滤过，减压至0.06MPa，回收甲醇，得到浸膏约200g。浸膏中灯盏乙素含量在5.2%，。取浸膏20g用水溶解配制成重量分数为15%的溶液、过滤，得上柱液；此上柱液通过DM130大孔吸附树脂(600g)柱，5Bv水洗涤后，弃水洗液；用60%甲醇，以1Bv/hr的流速洗脱，收集洗脱液；用高效液相对洗脱液中灯盏乙素的富集率和纯度进行检测；富集后灯盏乙素的含量为67.6%，在上述灯盏乙素的粗提物中加入10倍量的丙酮进行反复重结晶5次，得到纯度为95.2%的灯盏乙素。
实施例10：阿尔泰百里香中灯盏乙素的制备
取阿尔泰百里香药材1.0kg，用20倍量的质量分数为70%的甲醇回流提取3次，每次1.5小时。将上一步的提取液滤过，减压至0.08MPa，回收甲醇，得到浸膏约186g。浸膏中灯盏乙素含量在4.9%。取浸膏20g用水溶解配制成重量分数为15%的溶液、过滤，得上柱液；此上柱液通过DM130大孔吸附树脂(400g)柱，5Bv水洗涤后，弃水洗液；用50%甲醇，以1Bv/hr的流速洗脱，收集洗脱液；用高效液相对洗脱液中灯盏乙素的富集率和纯度进行检测；富集后灯盏乙素的含量为66.8%，在上述灯盏乙素的粗提物中加入10倍量的丙酮进行反复重结晶4次，得到纯度为94.6%的灯盏乙素。
实施例11：阿尔泰百里香中灯盏乙素的制备
取阿尔泰百里香药材1.0kg，用40倍量的质量分数为70%的乙醇回流提取3次，每次1.5小时。将上一步的提取液滤过，减压至0.07MPa，回收乙醇，得到浸膏约198g。浸膏中灯盏乙素含量在5.1%。取浸膏20g用水溶解配制成重量分数为15%的溶液、过滤，得上柱液；此上柱液通过AB-8大孔吸附树脂(600g)柱，5Bv水洗涤后，弃水洗液；用60%乙醇，以1Bv/hr的流速洗脱，收集洗脱液；用高效液相对洗脱液中灯盏乙素的富集率和纯度进行检测；富集后灯盏乙素的含量为为68.9%，在上述灯盏乙素的粗提物中加入10倍量的丙酮进行反复重结晶4次，得到纯度为96.1%的灯盏乙素。
实施例12：阿尔泰百里香中灯盏乙素的制备
取阿尔泰百里香药材1.0kg，用30倍量的质量分数为80%的乙醇温浸提取3次，每次1.5小时。将上一步的提取液滤过，减压至0.06MPa，回收乙醇，得到浸膏约202g。浸膏中灯盏乙素含量在5.2%。取浸膏20g用水溶解配制成重量分数为15%的溶液、过滤，得上柱液；此上柱液通过HPD200A大孔吸附树脂(600g)柱，5Bv水洗涤后，弃水洗液；用55%乙醇，以1Bv/hr的流速洗脱，收集洗脱液；用高效液相对洗脱液中灯盏乙素的富集率和纯度进行检测；富集后灯盏乙素的含量为为68.6%，在上述灯盏乙素的粗提物中加入10倍量的丙酮进行反复重结晶5次，得到纯度为96.1%的灯盏乙素。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。