表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）在制备抗呼吸道合胞病毒药物中的应用技术领域
本发明属于抗病毒药物领域，具体涉及表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)在制备抗呼吸道合胞病毒(RSV)中的应用。
背景技术
呼吸道合胞病毒(Respiratorysyncytialvirus，RSV)属副黏病毒科肺炎病毒属，是一种有包膜的单股负链RNA病毒，有1个血清型，可分为A、B两个亚型。呼吸道合胞病毒严重危害着婴幼儿健康，是住院儿童患者较常见的呼吸道感染性病原体，每年约40％～50％住院治疗的婴幼儿毛细支气管炎和25％的婴幼儿肺炎是RSV感染所致。呼吸道合胞病毒首次感染多为年龄小于1岁的婴儿，主要侵犯毛细支气管、支气管和肺泡，导致呼吸道合胞病毒肺炎，临床表现为以发热、咳嗽、喘憋为主要症状，严重者可出现呼吸困难，是儿童支气管哮喘发生的重要危险因素。呼吸道合胞病毒也可感染成年人，是引起约50％的成年人支气管哮喘加重的一种病原体，65岁以上的老年人下呼吸道感染和循环系统疾病死亡中，有78％多与RSV相关。目前临床应用利巴韦林、干扰素治疗呼吸道合胞病毒感染，可减轻症状、缩短病程和排毒时间，但均存在疗效不够理想，有明显的毒副作用等，且至今仍未有安全有效的预防疫苗。因此，研究和开发一种高效、安全、副作用少的抗呼吸道合胞病毒感染的新药具有重大意义。
茶多酚是从茶叶中提取的一类组成复杂、相对分子质量不同、性质与结构差异很大的多羟基酚类混合物。其中以儿茶素为主的黄烷醇类化合物是茶多酚的主体部分，占茶多酚总量的60％～80％，包括表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表没食子儿茶素(EGC)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、表儿茶素(EC)，尤其是EGCG最引人注目，在茶叶生物化学中研究最广泛、最深入。EGCG是茶叶特有的儿茶素，含量最高，占茶多酚制品的40％～50％，它是2-连苯酚基苯并吡喃与没食子酸形成的酯，同时因其结构中有6个邻位酚羟基而具有优于其他儿茶素的许多性质。现代科学研究表明EGCG具有显著的抗突变、抗氧化作用，能增强机体免疫力、抑制肿瘤生长、抑制肝脂和胆固醇的增长，对痢疾、伤寒、金黄色葡萄球菌也有很强的抑制作用。国外有文献报道EGCG体外可通过抑制HIV-1逆转录酶的活性发挥抗HIV的作用，另外还可通过抑制细胞内内涵体或溶酶体的酸化影响流感病毒的感染性。
发明内容
本发明的目的在于提供EGCG在制备抗呼吸道合胞病毒药物以及EGCG在制备治疗和/或预防呼吸道合胞病毒引起的肺部疾病的药物中的应用。
为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：
1、EGCG对RSV感染靶细胞－HEp-2细胞的毒性：HEp-2细胞加入不同浓度(2μg/mL，4μg/mL，8μg/mL，16μg/mL，32μg/mL，64μg/mL和128μg/mL)的EGCG，培养48h，通过MTT法检测EGCG的细胞毒性作用，选择无毒或弱毒浓度的EGCG进行随后的抗RSV作用研究。
2、EGCG抗RSV活性的测定：
(1)EGCG在HEp-2细胞中抗RSV感染的作用效果：
1)取不同浓度的EGCG加入HEp-2细胞中，37℃孵育2h，弃上清，PBS洗3次，再加入RSV病毒吸附1h，弃上清，PBS洗3次，再加入细胞维持液35℃培养，观察细胞病变(CPE)，待到病毒对照孔CPE呈+++～++++(≥75％的细胞出现CPE)且细胞对照正常时，用MTT法检测病毒抑制率，来判定EGCG对病毒侵入细胞是否具有阻断作用。
2)取不同浓度EGCG各100μL分别与20μLRSV病毒液混合，于35℃作用1h，随后将药物和病毒的混合液加入HEp-2细胞中，35℃吸附1h，弃上清，用PBS洗3次，最后加细胞维持液35℃培养，观察CPE，待到病毒对照孔CPE呈+++～++++且细胞对照正常时，用MTT法检测病毒抑制率，来判定EGCG能否直接灭活RSV。
3)先用RSV感染HEp-2细胞，35℃吸附1h后，弃病毒液，于培养孔中加入含不同浓度EGCG的培养液，35℃培养，观察CPE，待到病毒对照孔CPE呈+++～++++且细胞对照正常时，用MTT法检测病毒抑制率，以此判定EGCG在RSV穿入细胞后对其是否具有抑制作用。
数据统计：用SPSS17.0软件进行统计学分析。上述各项实验均重复3次，然后分别计算各组数据均数及标准差(s)。将MTT法所测值计算出的细胞存活率和病毒抑制率，采用Probit回归法计算出病毒半数组织感染量(TCID50)、药物半数毒性浓度(TC50)和药物半数有效浓度(IC50)，药物治疗指数(TI)＝TC50/IC50。
(2)EGCG在体内抗RSV感染的作用效果：
1)EGCG对RSV在BALB/c小鼠中复制的影响：RSV感染后2h给药，连续灌胃给药7天，EGCG处理后可明显抑制小鼠肺组织中的病毒复制，且随着给药剂量的增加，感染小鼠肺组织中病毒滴度逐渐降低。
2)EGCG对RSV引起的肺部炎症的影响：RSV感染后2h给药，连续灌胃给药7天，EGCG处理后可显著减轻RSV感染小鼠的肺组织病理改变。
通过上述研究，本发明发现EGCG在体外和体内均能抑制RSV感染，且无毒副作用。EGCG在体外能保护细胞免受RSV的感染和抑制RSV在细胞内的复制；在体内能抑制RSV在小鼠体内的复制并减轻病毒感染所致的组织病理损害，降低病毒滴度。基于此，EGCG可用于制备抗RSV的药物，同时也可用于制备治疗和/或预防RSV引起的肺部疾病的药物。
本发明与现有临床上用于治疗RSV感染的药物相比，具有以下优点和效果：
1、EGCG抗RSV病毒作用具有多种途径，既可保护细胞不受病毒感染，也可抑制病毒在细胞中的复制。
2、在体内EGCG可明显减轻RSV感染所致的肺部病理损害，且无明显的毒副作用。
附图说明
图1是表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)的结构式。
图2是不同处理组BALB/c小鼠肺组织的HE染色病理切片图。
图3是用实时荧光定量PCR检测不同处理组BALB/c小鼠肺组织中RSV核酸水平的结果图，*表示p<0.05vs安慰剂对照组(Pla)、**表示P<0.01vs安慰剂对照组(Pla)。
图4是采用空斑实验检测小鼠肺组织匀浆中RSV病毒滴度的结果图，**表示P<0.01vs安慰剂对照组(Pla)、***表示P<0.001vs安慰剂对照组(Pla)。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
EGCG是2-连苯酚基苯并吡喃与没食子酸形成的酯，分子式为C22H18O11，分子量为458.4，结构式如图1所示。EGCG已商品化，下述实施例中所用EGCG购于Sigma公司，其纯度≥98％。
实施例1-4中各项实验均重复3次，然后分别计算各组数据均数及标准差(s)。
实施例1MTT法检测EGCG的细胞毒性作用
DMEM(含10％胎牛血清，V/V)培养的HEp-2细胞用胰酶消化后稀释成1～3×105个/mL，每孔100μL接种于96孔板。细胞长成单层后，加入100μL用DMEM(含2％胎牛血清，V/V)稀释成不同浓度(2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、16μg/mL、32μg/mL、64μg/mL和128μg/mL)的EGCG药物(药物组)，培养48h。未经EGCG处理的细胞(加入100μL含2％胎牛血清的DMEM)为正常对照组。通过MTT法检测正常对照组和药物组吸光度值，计算细胞存活率(HEp-2细胞存活率＝药物组平均吸光度值/正常对照组平均吸光度值×100％)，从而评价EGCG的细胞毒性作用。
结果显示，EGCG对HEp-2细胞毒性作用表现为：细胞粘连、变圆、破碎脱落，胞质内颗粒增加，折光性增强并且吸光值明显下降。随着EGCG的浓度逐渐增加细胞存活率呈递减趋势，用SPSS17.0的Probit回归法计算、经直线回归分析，药物浓度与细胞存活率之间存在直线相关关系(r2＝0.80，P<0.05)，EGCG半数毒性浓度TC50为51.8μg/mL。EGCG在16μg/mL范围内均未见明显的细胞毒性，从而确定该浓度为抗病毒实验的最高允许浓度。结果见表1。
表1EGCG对HEp-2细胞的毒性作用
注：-为无CPE；+为≤25％细胞出现CPE；++为25％～50％细胞出现CPE；+++为50％～75％细胞出现CPE。
实施例2EGCG对病毒侵入细胞的阻断作用
正常对照组：将不含EGCG的DMEM(含2％胎牛血清，V/V)加入已长满80％单层HEp-2细胞的96孔板中，每孔100μL，37℃孵育2h，弃上清，PBS洗3次，再加入不含病毒的DMEM(含2％胎牛血清，V/V)20μL/孔，35℃作用1h，弃上清，PBS洗3次，再加入细胞维持液(含2％胎牛血清的DMEM，V/V)100μL/孔，35℃培养，观察CPE，待到病毒对照孔中≥75％的细胞出现CPE(+++～++++)且正常对照组细胞正常时，用MTT法检测病毒抑制率。
病毒对照组：将不含EGCG的DMEM(含2％胎牛血清，V/V)加入已长满80％单层HEp-2细胞的96孔板中，每孔100μL，37℃孵育2h，弃上清，PBS洗3次，再加入100TCID50RSV(10-2.6/mL)病毒20μL/孔，35℃吸附1h，弃上清，PBS洗3次，再加入细胞维持液(含2％胎牛血清的DMEM，V/V)100μL/孔，35℃培养，观察CPE，待到病毒对照孔中≥75％的细胞出现CPE(+++～++++)且正常对照组细胞正常时，用MTT法检测病毒抑制率。
药物组：取含不同浓度EGCG(2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、16μg/mL、32μg/mL)的DMEM(含2％胎牛血清，V/V)加入已长满80％单层HEp-2细胞的96孔板中，100μL/孔，37℃孵育2h，弃上清，PBS洗3次，再加入100TCID50RSV(10-2.6/mL)病毒20μL/孔，35℃吸附1h，弃上清，PBS洗3次，再加入细胞维持液(含2％胎牛血清的DMEM，V/V)100μL/孔，35℃培养，观察CPE，待到病毒对照孔中≥75％的细胞出现CPE(+++～++++)且正常对照组细胞正常时，用MTT法检测病毒抑制率。
病毒抑制率＝(药物组平均吸光度值-病毒对照组平均吸光度值)/(正常对照组平均吸光度值-病毒对照组平均吸光度值)×100％。
结果显示：病毒对照组各孔均出现以细胞肿胀变圆，折光度增强，聚集成葡萄串状为特征的典型CPE，不同浓度药物组CPE病变程度减轻，且随着EGCG的浓度增加病毒抑制率呈递增趋势，用SPSS17.0的Probit回归法计算、经直线回归分析，药物浓度与病毒抑制率之间存在直线相关关系(r2＝0.96，P<0.05)，结果见表2。EGCG的抗病毒侵入的半数有效浓度IC50为5.49μg/mL，治疗指数(TI)为9.43，表明EGCG对RSV侵入细胞有阻断作用。
表2EGCG对病毒侵入细胞的阻断作用
注：-为无CPE；+为≤25％细胞出现CPE；++为25％～50％细胞出现CPE；+++为50％～75％细胞出现CPE。
实施例3EGCG对病毒直接灭活作用
正常对照组：取不含EGCG的DMEM(含2％胎牛血清，V/V)100μL与20μL的DMEM(含2％胎牛血清，V/V)混合，于35℃作用1h，随后将混合液加入已长满80％单层HEp-2细胞的96孔板中，置于培养箱中35℃吸附1h，弃上清，用PBS洗3次，最后加入DMEM(含2％胎牛血清，V/V)100μL/孔，35℃培养，观察CPE，待到病毒对照孔中≥75％的细胞出现CPE(+++～++++)且正常对照组细胞正常时，用MTT法检测病毒抑制率。
病毒对照组：将不含EGCG的DMEM(含2％胎牛血清，V/V)100μL与20μL的100TCID50(10-2.6/mL)的RSV病毒液混合，于35℃作用1h，随后将混合液加入已长满80％单层HEp-2细胞的96孔板中，置于培养箱中35℃吸附1h，弃上清，用PBS洗3次，最后加入DMEM(含2％胎牛血清，V/V)100μL/孔，35℃培养，观察CPE，待到病毒对照孔中≥75％的细胞出现CPE(+++～++++)且正常对照组细胞正常时，用MTT法检测病毒抑制率。
药物组：取含不同浓度EGCG(2μg/mL，4μg/mL、8μg/mL、16μg/mL、32μg/mL)的DMEM(含2％胎牛血清，V/V)100μL分别与20μL的100TCID50(10-2.6/mL)的RSV病毒液混合，于35℃作用1h，随后将药物和病毒的混合液加入已长满80％单层HEp-2细胞的96孔板中，置于培养箱中35℃吸附1h，弃上清，用PBS洗3次，最后加入DMEM(含2％胎牛血清，V/V)100μL/孔，35℃培养，观察CPE，待到病毒对照孔中≥75％的细胞出现CPE(+++～++++)且正常对照组细胞正常时，用MTT法检测病毒抑制率。
病毒抑制率＝(药物组平均吸光度值-病毒对照组平均吸光度值)/(正常对照组平均吸光度值-病毒对照组平均吸光度值)×100％。
结果显示：药物组中细胞的CPE病变程度与病毒对照组相比无差异，且病毒抑制率与病毒对照组相比较无显著差异(P>0.05)，并不受药物浓度的影响，表明EGCG对RSV无直接灭活作用。
实施例4EGCG对病毒穿入细胞后的抑制作用
正常对照组：先将DMEM(含2％胎牛血清，V/V)20μL/孔，加入已长满80％单层HEp-2细胞，35℃作用1h后，弃上清，于培养孔中加入DMEM(含2％胎牛血清，V/V)100μL/孔，35℃培养，观察CPE，待到病毒对照孔中≥75％的细胞出现CPE(+++～++++)且正常对照组细胞正常时，用MTT法检测病毒抑制率。
病毒对照组：先用100TCID50RSV(10-2.6/mL)病毒20μL/孔，感染已长满80％单层HEp-2细胞，35℃吸附1h后，弃病毒液，于培养孔中加入不含EGCG的DMEM(含2％胎牛血清，V/V)100μL/孔，35℃培养，观察CPE，待到病毒对照孔中≥75％的细胞出现CPE(+++～++++)且正常对照组细胞正常时，用MTT法检测病毒抑制率。
药物组：先用100TCID50RSV(10-2.6/mL)病毒20μL/孔，感染已长满80％单层HEp-2细胞，35℃吸附1h后，弃病毒液，于培养孔中加入含不同浓度EGCG(2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、16μg/mL、32μg/mL)的DMEM(含2％胎牛血清，V/V)100μL/孔，35℃培养，观察CPE，待到病毒对照孔中≥75％的细胞出现CPE(+++～++++)且正常对照组细胞正常时，用MTT法检测病毒抑制率。
结果显示：EGCG在2μg/mL～32μg/mL范围内，对RSV有明显抑制作用，并且EGCG在该浓度范围内，病毒抑制率与药物浓度呈对数直线关系(r2＝0.93，P<0.05)，EGCG的抗病毒生物合成的半数有效浓度IC50为5.77μg/mL，治疗指数(TI)为8.97，表明EGCG对RSV穿入细胞后具有抑制作用。结果见表3。
表3EGCG对病毒穿入细胞后的抑制作用
注：-为无CPE；+为≤25％细胞出现CPE；++为25％～50％细胞出现CPE；+++为50％～75％细胞出现CPE。
实施例5EGCG对BALB/c小鼠的毒性作用
将60只15g～17g的BALB/c小鼠随机分为六组：正常对照组和不同浓度实验药物组(各组剂量分别为2000、4000、6000、8000、10000mg/(kg·d)，即每kg小鼠体重每天分别给予2000、4000、6000、8000、10000mgEGCG)，每组10只，按照0.2mL/10g灌胃给药，不同药物组用生理盐水将EGCG稀释至各剂量所需浓度。正常对照组灌服生理盐水，1次/d，连续灌胃7d，试验前和最后一次给药12h后称体重，观察小鼠体征，并记录小鼠死亡情况，直至第21d实验结束。
采用Probit回归法计算EGCG对小鼠的半数致死剂量(LD50)。实验结果表明，高剂量的EGCG对BALB/c鼠有一定的毒性，10000mg/(kg·d)剂量的EGCG连续灌胃BALB/c鼠7d，90％死亡；8000mg/(kg·d)剂量组的死亡率为80％；6000mg/(kg·d)剂量组的死亡率为70％；4000mg/(kg·d)剂量组的死亡率为50％；2000mg/(kg·d)剂量组的死亡率为20％。Probit回归法计算出EGCG的LD50为3946mg/(kg·d)。
实施例6BALB/c小鼠体内EGCG抗RSV作用
随机将15g～17g的BALB/c小鼠分成5组，即正常对照组、安慰剂对照组(Pla，即病毒感染阳性对照组)、高剂量组(HD，1000mg/(kg·d)、中剂量组(MD，500mg/(kg·d)、低剂量组(LD，250mg/(kg·d)，每组10只饲养于独立通气笼盒(individualventilatedcages，IVC)系统中。
正常对照组：小鼠在乙醚麻醉后鼻腔滴注50μL无血清DMEM高糖培养基，待全部吸入鼻腔后2h，按照0.2mL/10g给予生理盐水灌胃，连续灌胃7d，所有小鼠取肺组织做空斑形成实验检测肺组织中RSV滴度，行HE染色检测肺部病理改变和进行实时定量PCR检测肺组织RSV核酸水平。
安慰剂对照组(Pla)：小鼠在乙醚麻醉后鼻腔滴注50μL4.5×106PFU/mL的RSV，待全部吸入鼻腔后2h，按照0.2mL/10g给予生理盐水灌胃，连续灌胃7d，所有小鼠取肺组织做空斑形成实验检测肺组织中RSV滴度，行HE染色检测肺部病理改变和进行实时定量PCR检测肺组织RSV核酸水平。
高剂量组(HD)：小鼠在乙醚麻醉后鼻腔滴注50μL4.5×106PFU/mL的RSV，待全部吸入鼻腔后2h，按照0.2mL/10g，根据给药量1000mg/(kg·d)制备相应浓度的药物，灌胃给药，连续灌胃7d，所有小鼠取肺组织做空斑形成实验检测肺组织中RSV滴度，行HE染色检测肺部病理改变和进行实时定量PCR检测肺组织RSV核酸水平。
中剂量组(MD)：小鼠在乙醚麻醉后鼻腔滴注50μL4.5×106PFU/mL的RSV，待全部吸入鼻腔后2h，按照0.2mL/10g，根据给药量500mg/(kg·d)制备相应浓度的药物，灌胃给药，连续灌胃7d，所有小鼠取肺组织做空斑形成实验检测肺组织中RSV滴度，行HE染色检测肺部病理改变和进行实时定量PCR检测肺组织RSV核酸水平。
低剂量组(LD)：小鼠在乙醚麻醉后鼻腔滴注50μL4.5×106PFU/mL的RSV，待全部吸入鼻腔后2h，按照0.2mL/10g，根据给药量250mg/(kg·d)制备相应浓度的药物，灌胃给药，连续灌胃7d，所有小鼠取肺组织做空斑形成实验检测肺组织中RSV滴度，行HE染色检测肺部病理改变和进行实时定量PCR检测肺组织RSV核酸水平。
实验结果为：
1)EGCG对感染RSV小鼠肺部炎症的影响
对各组所收集的小鼠肺组织进行HE染色病理切片观察。结果显示，正常对照组小鼠肺组织HE染色无明显炎症改变，而安慰剂对照组小鼠在接种病毒第3d肺组织呈明显炎症反应，肺泡壁水肿、充血、增厚，大量淋巴细胞、中性粒细胞等细胞浸润。HD组、MD组和LD组小鼠肺组织病理改变程度均轻于安慰剂对照组，且随着给药浓度的逐渐增加，肺组织的炎症改变程度逐渐减轻(图2)。上述结果表明口服EGCG可显著降低感染小鼠肺组织的炎症病变程度。
2)EGCG对肺组织中RSV核酸的影响
对各组所收集的小鼠肺组织应用实时定量PCR(RT-PCR)检测RSV核酸水平，所用引物及具体过程为：
针对RSV病毒M基因的保守区域设计引物和探针：
RSVF：5’-TGGAAACATACGTGAACAAGC-3’，
RSVR：5’-ACATGGGCACCCATATTGTA-3’；
RSVPF：5’FAM-TCCACATACACAGCTGCTGTTCAAT-TRAMA3’。
反应条件：40℃30min，95℃3min；然后93℃45s，55℃15s，10个循环(预扩增)；93℃45s，55℃15s，30个循环。
结果显示：HD组、MD组和LD组小鼠肺组织病毒核酸表达量下降，与安慰剂对照组相比变化有明显差异，病毒核酸表达抑制率与药物浓度呈对数直线关系(r2＝0.9847，P<0.05)，存在显著的量效关系，结果见图3。
3)EGCG对RSV在小鼠体内复制的影响
对各组所收集的小鼠肺组织应用空斑实验检测小鼠肺组织匀浆(按10mL/g加入组织平衡液(pH7.4，0.01mol/LTris-HCL，0.0001mol/LEDTA-2Na，0.01mol/L蔗糖，0.8％的氯化钠溶液)，研磨肺组织，4℃10000r/min离心5min，取上清-80℃保存)病毒滴度。正常对照组病毒滴度为0PFU/g，安慰剂对照组病毒滴度为(4.167±0.752)×104PFU/g，HD组病毒滴度为(0.333±0.516)×104PFU/g，MD组病毒滴度为(1.5±0.548)×104PFU/g，LD组病毒滴度为(2.833±0.408)×104PFU/g，给药组与安慰剂对照组比较，差异均具有显著性(P<0.05)，如图4所示。结果表明灌胃给予EGCG能降低RSV在小鼠体内复制。结果表明灌胃给予EGCG能降低RSV在小鼠体内复制。