截短的可溶性人血管内皮细胞生长因子受体及其制备方法与用途.pdf

本发明报道了经采用重组基因工程与哺乳动物细胞培养等技术生产的两种代号分别为sFLT1(D1-7)及sKDR(D1-7)的重组蛋白。这两种重组蛋白都为截短的可溶性的人血管内皮细胞生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)受体，其共同结构特征是在于其各自都仅包含有VEGF受体-1(FLT1)或VEGF受体-2(KDR)的胞膜外的第1至第7个(D1-7)免疫球蛋白样区。这两种重组蛋白保留有与VEGF高度结合的生物活性，可作为中和吸附VEGF的试剂或药物成分，用于检测与分离体内外VEGF蛋白及治疗包括肿瘤在内的多种与血管增生有关的疾病。

权利要求书
1.   两种经采用重组基因工程与哺乳动物细胞培养技术生产的代号分别为sFLT1(D1-7)及sKDR(D1-7)的全人源化的重组蛋白。其特征在于1)这两种重组蛋白都为截短的可溶性的人血管内皮细胞生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)受体；其中重组蛋白sFLT1(D1-7)为截短的VEGF受体-1(即FLT1)，仅含有FLT1膜外区的第1至第7个(D1-7)免疫球蛋白样结构；而重组蛋白sFLT1(D1-7)为截短的VEGF受体-2(即KDR)，仅含有KDR膜外区的第1至第7个(D1-7)免疫球蛋白样结构；2)这两种重组蛋白都保留有与VEGF高度结合的生物活性。

2.   一种制备权利要求1所述的sFLT1(D1-7)蛋白及sKDR(D1-7)蛋白的方法；其步骤包括：1)以反转录-多聚酶链式反应(RT-PCR)从经VEGF激活的人脐静脉内皮细胞中扩增出FLT1或KDR胞外免疫球蛋白样1～7区cDNA片段；2)通过基因重组将该cDNA片段克隆于真核细胞表达载体中；3)将该表达载体转入哺乳动物细胞培养表达重组蛋白并收集细胞培养上清液；4)将收集的含重组蛋白sFLT1(D1-7)或重组蛋白sKDR(D1-7)的细胞培养上清液上样至含VEGF为配体的亲和层析柱中；5)亲和层析柱经1XPBS洗涤后，再以0.2M的甘氨酸(glycine，pH为2.0至3.0间)洗脱亲和层析柱并同时收集从该亲和层析柱上洗脱下来的蛋白，获得sFLT1(D1-7)或sKDR(D1-7)蛋白。

3.   一种以权利要求1所述的sFLT1(D1-7)或sKDR(D1-7)重组蛋白为主要成分的试剂盒。该试剂盒可定性或定量检测体内或体外的VEGF蛋白；其中可被检测的VEGF蛋白包括以可溶性物质形式存在于细胞培养上清液中或体液(如血清、血浆、唾液等)中的VEGF及其变体和以膜蛋白形式表达存在于细胞或组织中的VEGF及其变体。

4.   一种以权利要求1所述的sFLT1(D1-7)或sKDR(D1-7)重组蛋白为吸附剂用于分离VEGF蛋白及其变体的方法。

5.   一种以权利要求1所述的sFLT1(D1-7)或sKDR(D1-7)重组蛋白为吸附剂用于分离含VEGF蛋白及其变体的细胞或组织的方法。

6.   一种以权利要求1所述的sFLT1(D1-7)或sKDR(D1-7)重组蛋白为主要活性成分的药用物，该药用物可用于中和吸附VEGF及治疗与血管过度增生有关的疾病。

7.   一种同时含有权利要求1所述的FLT1(D1-7)及sKDR(D1-7)两种重组蛋白的组合药用物，该组合药用物可更彻底地中和吸附VEGF及治疗与血管过度增生有关的疾病。

说明书截短的可溶性人血管内皮细胞生长因子受体及其制备方法与用途
技术领域
本发明属于生物技术-重组基因工程领域。更具体地说，本发明报道了经采用重组基因工程与哺乳动物细胞培养技术生产的两种代号分别为sFLT1(D1-7)及sKDR(D1-7)的重组蛋白及由这两种蛋白单体构成的其异源双倍体蛋白。这两种重组蛋白及其异源双倍体蛋白都为截短的可溶性的人血管内皮细胞生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)受体(简称VEGF受体)，其共同特征是其各自都仅包含有VEGF受体的第1至第7个(D1-7)免疫球蛋白样结构。本发明中的两种重组蛋白及其异源双倍体保留有与VEGF高度结合的生物活性，可作为中和吸附VEGF的试剂或药物成分，用于检测与分离体内外VEGF蛋白及治疗各种与血管过度增生有关的疾病。
背景技术
血管增生或新生(angiogenesis)是指体内的已存在的血管(如毛细血管和小静脉)通过出芽或分裂的方式而产生新的血管的过程。血管增生在维持体内很多正常生理过程如胚胎发生、女性生殖、伤口愈合以及缺血组织中的新血管形成与修复等是必要与有益的。但在一些病理下如在肿瘤的发生发展中血管的增生或新生则是有害无益的。血管在正常生理或病理下能够保持增生与增长的关键是因为其内衬的血管内皮细胞具有不断分裂增生及定向迁移置入已有的血管管壁的能力。目前已知维持与刺激体内血管内皮细胞分裂增生与迁移功能的最为重要的活性物质是血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)(Leung DW等Science 1989，246：1306；Keck PJ等Science，1989，246：1309)。
血管内皮细胞生长因子(VEGF)是通过与其相应的表达在血管内皮细胞上的受体(VEGFR)相结合而介导出刺激血管内皮细胞分裂增生与迁移的活性。表达在血管内皮细胞上的VEGF受体目前已知的主要有三种：即VEGFR1(fms-like tyrosine kinase，简称FLT1)(ShibuyaM等Oncogene，1990，5：519；De Vries等Science 1992，255：989)；VEGFR2(Kinase-insertDomain Receptor，简称KDR；在小鼠中称FLK1)(Terman BI等Biochem Biophys Res Commun1992，187：1579-1586)和VEGFR3(简称FLT4)。这三种VEGF受体均为含酪氨酸激酶的I型跨细胞膜的嵌膜蛋白，各由一含7个免疫球蛋白样的袢环圈(Immunoglobuin-like loop，orIg-like loop)结构的胞膜外区，一个横穿胞膜区及一包含有2个酪氨酸激酶的胞膜内区三部分组成。其中的胞膜外区是维持VEGF受体与其配体VEGF高度结合的关键结构(Davis-SmythT等EMBO J，1996，15：4919；Fuh G等J Biol Chem，1998，273，11197)。VEGF受体在与其配体结合后，发生二聚体化及激活内在的酪氨酸激酶，产生酪氨酸残基自动磷酸化和细胞内信号蛋白的酪氨酸磷酸化，传导胞内信号，从而介导出刺激血管内皮细胞分裂及血管新生的生物学效应活性。有趣的是，VEGF受体除都与VEGF-A高度结合之外，还可与其他相关配体结合。如VEGFR1(即FLT1)可与胎盘生长因子(PIGF)及VEGF-B相结合。
体内的VEGF受体除了上述以膜嵌蛋白的形式表达在细胞膜上的之外，还有另一种以可溶性蛋白形式存在于细胞外间质或体液中。这类可溶性蛋白实际上就是截短的VEGF受体。截短的VEGF受体最早的报道见于可溶性Flt-1受体(即sFlt1)(Kendall RL及Thomas KA(Kendall RL and Thomas KA Proc Natl Acad Sci USA，1993，90：1070)。这种可溶性Flt-1受体蛋白仅含有Flt-1受体胞外结构的前6个免疫球蛋白样区，而不含穿膜区及膜内如酪氨酸激酶区。与镶嵌在膜上完整的受体一样，这种截短的可溶性VEGF受体保留与VEGF高度结合的生物活性。但与镶嵌在膜上完整的受体不同的是：截短的VEGF受体由于其不含酪氨酸蛋白激酶区，故在与VEGF结合后，并不会传导胞内信号及或介导出刺激血管内皮细胞分裂与增生的活性。截短的VEGF受体因其与镶嵌在膜上的VEGF受体竞争结合VEGF，故反而具有中和抑制VEGF及其介导的生物学活性。而实际上，目前已有多篇关于以截短的可溶性受体(如sFlt1)作为拮抗剂，成功地封闭VEGF生物学活性及抑制体内肿瘤血管生成的报道。如Goldman等在1998年报道了以腺病毒-多聚赖氨酸复合物将sFlt-1基因导入肿瘤细胞，而成功抑制了肿瘤细胞在裸鼠体内的种植与生长(Goldman et al.Proc Natl Acad SciUSA，，95：8795～8800)。又比如在中国2003年公布的专利号为02133546.X一发明专利中(专利发明名称：持续释放两种新生血管形成抑制因子的微囊物质及制备方法。专利发明人：魏于全等；公告日：2003.07.23)，就公开了一种经藻酸盐包裹编码vasostatin和血管内皮细胞生长因子受体-1/-2基因的遗传工程细胞形成微囊化物质及其制备方法和应用。该专利申明其所制备的微囊物质皮下植入体内后能持续释放这两种血管内皮细胞生长因子受体而发挥抑制新生血管形成的作用，可用于治疗多种与血管生成相关的疾病和多种肿瘤。
鉴于截短的可溶性VEGF受体具有高度结合VEGF及拮抗血管形成的作用，故该类蛋白及其变体将可用于开发为抑制血管生长的拮抗剂药物，用于干预治疗包括如恶性肿瘤在内的各种与血管增生相关的疾病。但是，由于正常人体内的编码可溶性VEGF受体的基因及其蛋白质的表达水平都很低，故很难从体内或体液中直接提取与分离到足够量的可作药物之用的可溶性VEGF受体蛋白。解究这一问题的理想方案是采用现代重组基因工程技术在体外高效表达与生产截短的可溶性VEGF受体。近来已有个别报道了以重组基因工程技术在体外表达生产重组的可溶性VEGF受体。如安平等2000年发表的“可溶性VEGF受体Flt-1的基因克隆及其活性产物在原核中的表达”(安平，董志伟，寿成超：中国生物化学与分子生物学报，2000Vol.16 No.1 P.62-66)一文中就报道了利用RT-PCR技术从人脐静脉内皮细胞扩增出Flt-1胞外免疫球蛋白样1～4区cDNA片段，再通过基因重组将该片段克隆于谷胱甘肽转移酶(GST)融合蛋白表达载体PGEX2-T中，连接产物转化大肠杆菌，经IPTG诱导获得大量稳定表达的Flt-1-GST融合蛋白。但是，该文报道生产的可溶性VEGF受体如用于人体内治疗还面临一些问题与不足。其问题与不足首先在于该方法生产的可溶性VEGF受体是一种含有外源性蛋白(即GST)的融合蛋白，如将其引入人体会产生人抗GST-融合蛋白抗体等免疫反应，而这种免疫反应将极大地限制Flt-1GST融合蛋白在体内治疗上的应用。此外，该法采用的是大肠杆菌系统表达生产。大肠杆菌表达系统虽具有如工艺简单，成本低廉等优点，但以这种系统来生产如VEGF受体这样的富含二硫键(S_S)及糖基等结构的大分子蛋白，其表达的重组蛋白在其结构折叠，构像及功能与内源性的蛋白一般会有偏差，故也不太合适。因此，更为理想的方案是采用其他高级表达系统如哺乳动物细胞来表达生产可溶性VEGF受体。但由于编码VEGF受体胞膜外区的基因相对较长(其cDNA＞2kb)，而可用于特异检测与分离VEGF受体蛋白的试剂又很稀乏，故目前除个别的带有如免疫球蛋白-Fc段或碱性磷酸酶等外来标签(tag)的VEGF受体融合蛋白已成功表达分离之外，仅含有人VEGF受体胞膜外区的全部7个免疫球蛋白样区而又不带其他标签物(tag)的重组蛋白还鲜见有报道。
本发明在此报道了经采用重组基因工程与哺乳动物细胞培养等技术生产的两种代号分别为sFLT1(D1-7)及sKDR(D1-7)的重组蛋白。这2种重组蛋白的结构特征在于它们是不带其他任何标签(tag)成分的截短的可溶性的人VEGF受体。其中的重组蛋白sFLT1(D1-7)为截短的人VEGF受体-1(即FLT1)，仅含有FLT1膜外区的第1至第7个(D1-7)免疫球蛋白样区；而重组蛋白sFLT1(D1-7)为截短的人VEGF受体-2(即KDR)，仅含有KDR膜外区的第1至第7个(D1-7)免疫球蛋白样区。
本发明还报道了制备sFLT1(D1-7)蛋白及sKDR(D1-7)蛋白的方法。其制备步骤包括：1)以反转录-多聚酶链式反应(RT-PCR)从经VEGF激活的人脐静脉内皮细胞中扩增出FLT1或KDR胞外免疫球蛋白样1～7区cDNA片段；2)通过基因重组将该片段克隆于真核细胞表达载体中；3)将表达载体转入哺乳动物细胞培养表达重组蛋白并收集细胞培养上清液；4)将收集的含重组蛋白sFLT1(D1-7)或重组蛋白sKDR(D1-7)的细胞培养上清液上样至含VEGF为配体的亲和层析柱中；5)亲和层析柱经PBS洗涤后，再以0.2M的甘氨酸(glycine，pH为2.0至3.0间)洗脱亲和层析柱并同时收集从该亲和层析柱上洗脱下来的蛋白，即获得sFLT1(D1-7)或sKDR(D1-7)蛋白。
本发明的重组蛋白sFLT1(D1-7)，sKDR(D1-7)及由这两种蛋白单体构成的其异源双倍体蛋白保留有与VEGF高度结合的生物活性。这几种重组蛋白，可作为中和吸附VEGF的试剂或药物成分，以单个独立或组合在一起使用的方式，广泛用于体内外检测与分离VEGF蛋白及用于抑制VEGF介导的血管增生或新生。
发明内容
本发明内容之一是报道了两种重组的可溶性血管内皮细胞生长因子受体蛋白及其制备方法。这两种重组的可溶性蛋白的代号及其结构特征如下：1)重组蛋白1，代号为sFLT1(D1-7)，是一截短的人VEGF受体-1(Flt-1)，仅含该受体的胞膜外结构中的第1至第7免疫球蛋白样胞区。2)重组蛋白2，代号为sKDR(D1-7)，是一截短的人VEGF受体(KDR)，仅含该受体的胞膜外结构中的第1至第7免疫球蛋白样区。sFLT1(D1-7)及sKDR(D1-7)都为不含有酪氨酸蛋白激酶区的截短的可溶性VEGF受体，但都保留有与VEGF高度结合的生物活性。
制备本发明中的可溶性蛋白sFLT1(D1-7)及sKDR(D1-7)步骤包括1)以反转录-多聚酶链式多聚酶链式反应(RT-PCR)从经VEGF激活的人脐静脉内皮细胞中扩增出FLT1或KDR胞外免疫球蛋白样1～7区cDNA片段；2)通过基因重组将该片段克隆于真核细胞表达载体中；3)将表达载体转入哺乳动物细胞培养表达重组蛋白并收集细胞培养上清；4)将收集的细胞培养上清上样至含VEGF为配体的亲和柱中分离获得化的重组蛋白。
本发明的另一大内容是提供了sFLT1(D1-7)及sKDR(D1-7)蛋白的用途。这2种蛋白由于保留有与VEGF高度结合的生物活性而又不含酪氨酸蛋白激酶区，故在与VEGF结合后，不会介导出刺激血管内皮细胞分裂及血管新生的活性。相反的，sFLT1(D1-7)及sKDR(D1-7)蛋白如引入体内或细胞中，则可通过其与镶嵌在膜上的VEGF受体竞争结合VEGF，而达到中和抑制VEGF及其介导血管增生的效果。作为可中和吸附VEGF的可溶性蛋白质，本发明的sFLT1(D1-7)与sKDR(D1-7)至少具有以下几种用途：如1)作为试剂成分，用于检测体内外VEGF的表达水平；2)作为分离剂，用于体内外分离吸附VEGF分子及VEGF分泌表达阳性的细胞与组织；3)作为药物成分，用于干预抑制VEGF介导的血管增生及治疗如包括多种肿瘤在的与血管生成相关的疾病。
本发明中的sFLT1(D1-7)及sKDR(D1-7)重组蛋白及其异源双倍体蛋白的一大特征在于这三种蛋白，在作为抗VEGF或抗血管增生的药物使用时，既可单个的独立使用，也可几种组合在一起使用。重组蛋白sFLT1(D1-7)除与VEGF-A高度结合之外，还可与PIGF及VEGF-B结合；而重组蛋白sKDR(D1-7)除与VEGF-A高度结合之外，还可与VEGF-C及VEGF-D结合。因此，与使用单一的重组蛋白相比，将sFLT1(D1-7)及sKDR(D1-7)蛋白组合在一起使用，将可取到更为彻底地中和与清除VEGF及其他血管增生因子的作用，在抗血管增生治疗上也可望获得更好的疗效。
此外，由于本发明中的sFLT1(D1-7)，sKDR(D1-7)及其异源双倍体蛋白是不带任何其他外来标签(tag)的人源化的重组蛋白，故其如用作药物，在引入人体后一般不会产生针对该重组蛋白的抗体等免疫反应，可长期反复使用。
本发明的具体内容如下：
1.编码可溶性蛋白sFLT1(D1-7)与sKDR(D1-7)基因的克隆扩增及其表达载体的构建。
本发明中的sFLT1(D1-7)与sKDR(D1-7)的编码基因的克隆扩增及其表达载体的构建可分为两部分：1)克隆扩增出FLT1或KDR的胞膜外结构中的第1至第7免疫球蛋白样区(D1-7)cDNA基因片段，2)将克隆扩增的基因片段定向插入到表达载体，获得含编码sFLT1(D1-7)或sKDR(D1-7)基因的重组载体。基因的克隆扩增及其表达载体的构建的具体技术与操作方法可参见《分子克隆》等书。鉴于sFLT1(D1-7)与sKDR(D1-7)蛋白具有分子量大，含二硫键(S_S)及糖基等结构，其表达以在真核细胞中的分泌性表达最为理想。
保证重组蛋白在真核细胞分泌性表达的一大关键因素是需要一段信号肽(signalpeptide)以引导新合成的蛋白质穿透过细胞内质网，并最终分泌到细胞外间质。编码该信号肽的基因可来自于VEGF受体基因，或其他外源基因如IL-2等基因。
编码本发明中的sFLT1(D1-7)蛋白的cDNA片段采用RT-PCR方法从经VEGF激活的健康人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)中克隆扩增获得。用于PCR的上、下游引物可参照已报道的Flt-1核苷序列体外合成。
同理，编码本发明中的sKDR(D1-7)蛋白的cDNA片段也采用RT-PCR方法从VEGF激活的HUVEC中克隆扩增获得。用于PCR的上、下游引物可参照已报道的KDR核苷序列体外合成。
2.可溶性蛋白sFLT1(D1-7)与sKDR(D1-7)在哺乳动物细胞中的表达生产
可溶性蛋白sFLT1(D1-7)与sKDR(D1-7)的表达生产以在哺乳动物细胞中为理想。常用的哺乳动物细胞有CHO，COS-7，Hela，HEK-293等。有两种主要方式：即瞬时转染与稳定转染可将含sFLT1(D1-7)或sKDR(D1-7)基因的表达载体转染入哺乳动物细胞(如CHO细胞)。稳定转染的细胞因可进一步用于筛选与扩增高表达细胞株。稳定转染常用的方法包磷酸钙法；阳离子脂质体法；病毒介导法及电穿孔法等。
sFLT1(D1-7)与sKDR(D1-7)在转染细胞里的表达可以用免疫组化方法进行检测；也可以通过免疫印迹试验及ELISA方法定量检测细胞培养液中的蛋白。经检测确认转染细胞表达该重组蛋白后，转染的细胞则转入含筛选药物如G418的培养液中进行筛选。筛选出的表达细胞株再扩增培养，并收集其培养上清液。收集的培养液再用于分离提取重组蛋白。
3.可溶性蛋白sFLT1(D1-7)与sKDR(D1-7)的分离提取及其理化活性鉴定
可溶性蛋白sFLT1(D1-7)与sKDR(D1-7)可用亲和层析柱法从收集的细胞培养液中分离提取。可用于分离提取该蛋白的亲和层析柱有VEGF-或抗FLT1或抗KDR抗体亲和层析柱。如以VEGF亲和层析柱分离提取sFLT1(D1-7)或sKDR(D1-7)重组蛋白为列，其操作步骤如下：取收集的细胞培养上清液，经离心及以0.45μm滤膜过滤后，将滤液上样置于亲合层析柱，sFLT1(D1-7)或sKDR(D1-7)重组蛋白因其与亲合层析柱上的VEGF发生非共价的耦联而被特异吸附于亲合层吸柱中。层吸柱先以PBS洗脱去除杂蛋白，再以低pH液(如pH 2.7，0.1M甘氨酸)洗脱被吸附的蛋白。再经调节pH至7.0及对PBS透析后即获得纯化的sFLT1(D1-7)或或sKDR(D1-7)蛋白。
分离提取的蛋白可以用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gelelectrophoresis，PAGE)，结合考马斯亮蓝染色或免疫印迹试验及ELISA等方法加以鉴定。
4.可溶性蛋白sFLT1(D1-7)与sKDR(D1-7)的生物活性鉴定
本发明的可溶性蛋白sFLT1(D1-7)与sKDR(D1-7)的一大特征是它们都保持有与VEGF的结合的生物活性。一种鉴定sFLT1(D1-7)或sKDR(D1-7)蛋白与VEGF结合的方法如下：先以含VEGF基因的表达载体转染入哺乳动物细胞如CHO细胞，24-48h后，转染的CHO细胞经1x PBS液漂洗及以固定后，分别加入含sFLT1(D1-7)或与sKDR(D1-7)蛋白或对照蛋白，25℃孵育1-2h，以PBS液洗脱，再加入抗FLT1或抗KDR抗5℃孵育1-2h，以PBS液洗脱；再加入酶标记的抗人Ig抗体，25℃孵育1-2h，再以PBS液洗脱，然后加入显色液，室温至显色，于显微镜下观察显色结果。如加入sFLT1(D1-7)或与sKDR(D1-7)蛋白的孔有显色阳性的细胞，而加入对照蛋白的孔里细胞无显色，则证明sFLT1(D1-7)或与sKDR(D1-7)蛋白保持有与VEGF相特异结合的生物活性。
此外，可溶性蛋白sFLT1(D1-7)或sKDR(D1-7)与VEGF的特异结合还可通过与125I标记的VEGF或biotin标记的VEGF结合的实验而测定。如以biotin标记的VEGF为例：先用sFLT1(D1-7)或sKDR(D1-7)蛋白包被96孔ELISA板，4℃过夜，经1x PBS液漂洗及2％BSA液室温封闭1～2h后，分别加入同浓度biotin-标记的VEGF在4℃孵育1-2h，经PBS液洗脱后，再加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的Avidin，4℃孵育1-2h，PBS液洗脱后，加入显色液，室温至显色，再以酶联免疫仪测定特定波长处各孔的吸光值。根据OD值可测定被96孔板上sFLT1(D1-7)或sKDR(D1-7)蛋白吸附的VEGF量，进而推测出sFLT1(D1-7)或sKDR(D1-7)与VEGF结合的强度。
本发明的可溶性蛋白sFLT1(D1-7)与sKDR(D1-7)的另一大特征是其可与镶嵌在膜上的VEGF受体竞争结合VEGF，而达到中和抑制VEGF介导的促血管增生的效果。一种体外鉴定与检测sFLT1(D1-7)或sKDR(D1-7)中和抑制由VEGF介导的血管增生的方法如下：从健康人外周血单核细胞(PBMCs)中提取血管内皮细胞或人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，置于含有重组人VEGF的细胞培养皿中培养，再将待检测的sFLT1(D1-7)或sKDR(D1-7)蛋白按不同剂量(如高、中、低剂量)分别加入到血管内皮细胞或HUVEC培养中，并以加入抗人VEGF的单抗如avastin为阳性对照组，以加入正常的白蛋白为阴性对照组，37℃孵育2-3天后，在显微镜下或应用流式细胞仪观察血管皮细胞增殖与凋亡的情况。将sFLT1(D1-7)或sKDR(D1-7)蛋白检测组的结果与抗人VEGF的单抗阳性对照组及正常白蛋白阴性对照组的结果相比，则可判断sFLT1(D1-7)或sKDR(D1-7)蛋白拮抗VEGF介导的促血管细胞增生的能力。根据该类体外细胞水平的测试结果可初步推断sFLT1(D1-7)或sKDR(D1-7)蛋白用于体内拮抗抑制VEGF的可能程度。
5.可溶性蛋白sFLT1(D1-7)与sKDR(D1-7)的用途
本发明的另一大内容则是提供了可溶性蛋白sFLT1(D1-7)及sKDR(D1-7)的用途。这2种蛋白由于保留有与VEGF高度结合的生物活性而又不含酪氨酸蛋白激酶区，故在与VEGF结合后，不会介导出刺激血管内皮细胞分裂及血管新生的活性。相反的，sFLT1(D1-7)及sKDR(D1-7)可通过其与镶嵌在膜上的VEGF受体竞争结合两者的共同配体VEGF，而起到中和抑制VEGF介导的促血管增生的效用。本发明的可溶性蛋白sFLT1(D1-7)与sKDR(D1-7)至少具有以下几种用途，如1)作为试剂成分，用于检测体内外VEGF的表达水平；2)作为分离剂，用于体内外分离吸附VEGF分子及VEGF分泌表达阳性的细胞与组织；3)作为药物成分，用于干预抑制VEGF介导的血管增生及治疗如包括多种肿瘤在的与血管生成相关的疾病。有关sFLT1(D1-7)或sKDR(D1-7)蛋白的这几项用途更具体地描述如下：
5.1.可溶性蛋白sFLT1(D1-7)或sKDR(D1-7)作为试剂用于检测体内外VEGF的表达水平
本发明的sFLT1(D1-7)或sKDR(D1-7)蛋白可作为试剂成分用于检测体内外的VEGF表达水平。被检测的VEGF分子包括存在于体液(如血清、血浆、唾液等)、细胞培养上清液中流离的可溶性分子及表达于细胞/组织膜上的蛋白。
作为检测试剂，sFLT1(D1-7)或sKDR(D1-7)蛋白可有标记处理的及未标记处理的两种主要形式。可用于标记sFLT1(D1-7)或sKDR(D1-7)蛋白的标记物包括各种酶(如辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，葡萄糖氧化酶，微过氧化物酶)；荧光素(异硫氰酸荧光素，FITC)；生物素-抗生物素及胶体金等。作为试剂，经标记的FLT1(D1-7)或sKDR(D1-7)蛋白，可直接用于免疫酶组化、免疫荧光或免疫印迹等试验来体内外检测VEGF分子的表达水平。
未标记处理的sFLT1(D1-7)或sKDR(D1-7)蛋白也可与已标记的其他试剂一起合并作为试剂盒成分，用于检测VEGF分子。试剂盒中标记的其他试剂可包括酶标或荧光标记的鼠抗人VEGF抗体，酶标或荧光标记的抗鼠免疫球蛋白抗体，酶标或荧光标记的protein-A/protein-G蛋白，等。如以未标记的sFLT1(D1-7)或sKDR(D1-7)蛋白与酶标记的鼠抗人VEGF抗体合并组成试剂盒，用夹心ELISA法来检测体液(如血清、细胞悬液、细胞培养上清液)中的VEGF的表达水平为例，其检测步骤如下：先用未标记处理的sFLT1(D1-7)或sKDR(D1-7)蛋白包被96-孔ELLSA板，4℃过夜，经1x PBS液漂洗及2％BSA液室温封闭1～2h后，分别加入待检的样品如血清，37℃孵育1-2h，经PBS液洗脱后，再加入酶标记的鼠抗人VEGF抗体，37℃孵育1-2h，PBS液洗脱后，加入显色液，室温至显色，再以酶联免疫仪测定特定波长处各孔的吸光值。根据OD值并与VEGF正常参照物相比较，可估测待检样品中的VEGF水平。
5.2.可溶性蛋白sFLT1(D1-7)或sKDR(D1-7)用于吸附及分离VEGF表达阳性细胞与组织
sFLT1(D1-7)或sKDR(D1-7)还可用于体内外吸附与分离VEGF表达阳性的细胞与组织。如用sFLT1(D1-7)蛋白体外吸附分离VEGF表达阳性的细胞与组织为例，可先将sFLT1(D1-7)蛋白吸附在适当的固相载体上(固相载体包括如细胞培养板，细胞培养皿，硝酸纤维素膜等)，再加入含VEGF表达阳性的细胞或组织，4℃孵育1-2h，再以1x PBS液洗脱，即达到吸附与分离VEGF表达阳性细胞或组织成分的目的。
5.3.可溶性蛋白sFLT1(D1-7)及sKDR(D1-7)作为药物成分，用于抑制VEGF介导的血管增生及治疗包括肿瘤在内的与血管生成相关的疾病
本发明的sFLT1(D1-7)或sKDR(D1-7)蛋白质可作为新型实验性治疗药物的主要成分，用于抑制VEGF介导的血管增生及治疗包括肿瘤在内的与血管生成相关的疾病。作为治疗药物成分的sFLT1(D1-7)或sKDR(D1-7)蛋白质可以冻干或液态的形式保纯。冻干或液态保纯的sFLT1(D1-7)或sKDR(D1-7)蛋白在使用时再以生理盐水或PBS稀释。稀释的sFLT1(D1-7)或sKDR(D1-7)蛋白的给药途径可包括经皮下，或静脉注射等。作为实验性治疗药物，sFLT1(D1-7)或sKDR(D1-7)蛋白质的药理药效的测试先是在种植了人肿瘤的裸鼠体内进行。该实验的重点是测试FLT1(D1-7)或sKDR(D1-7)在体内的抗肿瘤血管增生及抗肿瘤生成的疗药。目前已有多个不同的人肿瘤在裸鼠种植生长的模型可用于进行该实验。在此如以异体种植生长了人肉瘤移植肿瘤的模型来实验测试sFLT1(D1-7)或sKDR(D1-7)的抗肿瘤血管新生及抗肿瘤生长的药效为列，其方法是：裸鼠经皮下和腹腔种植人肿瘤(S-180肉瘤)，7天后分组，每组的小鼠分别注射不同剂量的sFLT1(D1-7)，sKDR(D1-7)，阳性对照蛋白质(avastin，一种抗人VEGF的单抗)或阴性对照蛋白质，治疗连续7-30天。其间记录观察种植的肿瘤生长及种植组小鼠的活情况。30天后处死小鼠，剥离肿瘤，称重，并采用免疫组织化学对肿瘤组织及其血管进行分析及计算每组平均瘤重和抑瘤率及治疗制剂对小鼠寿命的影响。如实验结果显示注射了sFLT1(D1-7)或sKDR(D1-7)蛋白质的小鼠体内肿瘤及其肿瘤组织中血管的生长被抑制，sFLT1(D1-7)或sKDR(D1-7)蛋白则可望进一步开发成为可用于临床上治疗包括肿瘤在内的多种与血管生成相关疾病的药物。
在作为抗VEGF或抗血管增生的药物成分时，本发明的sFLT1(D1-7)与sKDR(D1-7)蛋白，既可单个的独立使用，也可几种组合在一起使用，以发挥最大药效作用。鉴于重组蛋白sFLT1(D1-7)除与VEGF-A高度结合之外，还可与PIGF及VEGF-B结合；而重组蛋白sKDR(D1-7)除与VEGF-A高度相结合之外，还可与VEGF-C及VEGF-D相结合；因此，如果将sFLT1(D1-7)及sKDR(D1-7)这两种蛋白组合在一起使用，应可取到更为彻底地中和与清除VEGF及其他血管增生因子的作用。sFLT1(D1-7)及sKDR(D1-7)这两种蛋白的组合使用也可望在未来的抗血管增生临床治疗上获得更好的疗效。
附图说明
图1.为可溶性sFLT1(D1-7)蛋白单体及可溶性sKDR(D1-7)蛋白单体的结构示意图.
其中的D1，D2，D3，D4，D5，D6及D7分别代表VEGF受体-1(FLT-1)或VEGF受体-2(KDR)的胞膜外结构区，SP为信号肽(signal peptide)。
图2.含sFLT1(D1-7)与sKDR(D1-7)的异源双倍体蛋白的结构示意图。
图3.为以SDS_PAGE结合免疫印迹试验检测分析分离提纯的sFLT1(D1-7)蛋白。
本发明具体实施方式
实施例一：编码sFLT1(D1-7)或sKDR(D1-7)基因的克隆及其表达载体的构建
本发明中的sFlt1D(1-7)蛋白和sKDRD(1-7)蛋白的单体结构如图1所示。这两种蛋白都为截短的可溶性的人血管内皮细胞生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)受体；其中sFLT1(D1-7)为截短的VEGF受体-1(即FLT1)，仅含有FLT1膜外区的第1至第7个(D1-7)免疫球蛋白样结构；而sFLT1(D1-7)为截短的VEGF受体-2(即KDR)，仅含有KDR膜外区的第1至第7个(D1-7)免疫球蛋白样结构。
编码这两种蛋白的基因克隆及其达载体的构建如下：
1.编码人类FLT1(D1-7)基因片段的克隆。
编码人sFLT1(D1-7)FLT1的基因片段采用逆转录-多聚酶链式反应(RT-PCR)方法从经VEGF激活的人脐静脉内皮细胞HUVEC中克隆获得。其具体实施如下：以Trizol按常规方法从HUVEC细胞中提取总RNA；再取1μg总RNA，加入到逆转录酶的反应液里(总体积为20μ，包括5×buffer 4μL、Oligo(dT)引物2μL及10mmol/L dNTP 8μL，RNasin 1μL，反转录酶5U～10U)，经70℃变性10分钟，42℃1小时，42℃30分钟，70℃15分钟，逆转录反应终止，合成得到cDNA。再以PCR扩增人sFlt1(D1-7)基因片段。用于PCR扩增的引物为：
上游引物1.FLT1-NcoATG：gcgaagcttgagacc atg gtc agc tac tgg
下游引物2.FLT1-TAG-BH：gcgggatcc cta cac aga gcc ctt ctg gtt gg
PCR扩增用的Taq酶购自大连TAKARA生物公司。PCR的反应总体积为50μL。PCR的反应条件为：94℃预变性2min后，然后94℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸120s，35个循环，末次循环72℃延伸5min。PCR扩增后获得2.0kb的DNA片段
PCR产物纯化及酶切：取PCR产物(2.0kb band)用HinD III和BamH I酶切，反应完毕后，经1％琼脂糖电泳后，切下酶切扩增片段，再经回收纯化，用20μl去离子水溶解后，置-20℃保存备用。
DNA重组连接及转化感受宿主菌：采用以T4DNA连接酶的方法将上述酶切后的DNA与经同样酶切处理的表达载体pcDNA3.1(Invitrogen)DNA体外相连。连接反应体系总体积为20μl，在16℃条件下连接16h。之后，取2μl连接反应物在4℃条件下转化感受态细菌宿主菌DH5a(50μl/管)30分钟。转化结束后，将感受细菌接种于LB/agar培养板(含100μg/mlAmp)，37℃孵育过夜，再提取重组质粒DNA及酶切鉴定后获得含Flt1(D1-7)基因片段的重组质粒。经酶切及核苷酸序列测序证明所获得的重组质粒含有编码人FLT1膜外区的第1至第7个(D1-7)免疫球蛋白样区的基因。
2.编码人类KDR(D1-7)基因片段的克隆。
编码人KDR的胞外免疫球蛋白区D1至D7的基因片段也采用RT-PCR方法克隆获得。PCR扩增用的引物为：
上游引物1.KDR-ATG-H3：gcgaagcttccatg gag agc aag gtg ctg
下游引物2.KDR-TAG-BH：gcgggatcccta cac aga gcc ctt ctg gtt
PCR扩增反应总体积为50μL。PCR的反应条件为：94℃预变性2min后，然后94℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸120s，35个循环，末次循环72℃延伸5min。PCR扩增后获得2.0kb的DNA片段。
PCR产物纯化及酶切：取10ul PCR产物(2.0kb)经HinD III和BamH I双酶切后，于1％琼脂糖电泳；电泳分离后，切下酶切后的扩增片段，再经回收纯化及，用20μl去离子水溶解后，置-20℃保存备用。
DNA重组连接及转化感受宿主菌：采用以T4DNA连接酶的方法将上述酶切后的片段与经同样双酶切(HinD III和BamH I)处理的表达载体pcDNA3.1在16℃条件下连接。16h后，取2μl连接反应物转化感受态细菌宿主菌DH5a。转化结束后，将感受细菌接种于LB/agar培养板(含100μg/ml Amp)，37℃孵育过夜。再提取重组质粒DNA及酶切鉴定获得含扩增基因片段的重组质粒。经酶切及核苷酸序列测序证明所获得的重组质粒含有编码人KDR膜外区的第1至第7个(D1-7)免疫球蛋白样区的基因。
实施例二：sFLT1(D1-7)或sKDR(D1-7)蛋白的表达及其检测
鉴于本发明中的sFLT1(D1-7)或sKDR(D1-7)蛋白具有分子量大，含二硫键S_S及糖基，其表达以在哺乳动物细胞为好。在本发明实施中，选以sFLT1(D1-7)蛋白在哺乳动物细胞中的表达生产为例，本发明中的sKDR(D1-7)蛋白的表达生产应与此例大致相同。
sFLT1(D1-7)或sKDR(D1-7)在哺乳动物细胞中的表达生产包括三大步骤：1)将含sFLT1(D1-7)或sKDR(D1-7)基因的重组质粒转染入CHO细胞；2)重组基因表达阳性CHO细胞的鉴定与高表达细胞株的筛选；3)sFLT1(D1-7)或sKDR(D1-7)蛋白的分离纯化。
转染CHO细胞可采用fugen6介导的方法。其步骤为：取对数生长期的CHO细胞，胰酶/5mM EDTA常规消化后，以1×105细胞/孔接种6-孔塑料培养板，37℃，5％CO2培养过夜.第2天，在100μL无血清、无抗生素的DMEM加入6μL fugen6与不同量的重组质粒及阴性对照空载体DNA(1-2μg)混匀，制备成fugen6-DNA混合液，室温放置15min后，缓慢滴加至CHO细胞中，于37℃、5％CO2条件下培养培养4-6h后，加入3ml DMEM-5％fcs/孔，转染24h后，换无血清DMEM培养基，48h～72h后，收集培养细胞上清液。
收集的细胞培养上清液用ELISA方法测定可溶性sFLT1(D1-7)或sKDR(D1-7)蛋白。以ELISA方法测定sFLT1(D1-7)蛋白为列，其操作步骤如下：用鼠抗人FLT1抗体(clone FB6，2μg/ml，50μL/孔)包被96-well ELISA板，4℃过夜，经1x PBS液漂洗及2％BSA(in PBS-0.1％tween 20液)室温封闭1～2h后，分别加入经含sFLT1(D1-7)基因的质粒或空载体转染的CHO细胞的培养上清液，37℃孵育2h，PBS-0.1％tween 20洗板×3，再加入人源化的抗人FLT1抗体(clone 18F1)，37℃2h，PBS-0.1％tween 20洗板×3；再加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG多克隆抗体(抗体购自Sigma，1∶1000稀释)，37℃孵育1h；以PBS-0.1％tween 20洗板×3，然后加入显色液(邻苯二胺)-3％H202，室温10min，1mol/L HCL终止反应，以酶联免疫仪测定以酶标仪(Microplate reader 550，Bio-Rad)测定490nm波长处各孔的吸光值。ELISA检测显示sFLT1(D1-7)质粒转染的CHO细胞上清液结果为阳性，表明sFLT1(D1-7)蛋白在CHO细胞中分泌表达成功。收集的转染细胞培养上清液可用于分离提纯sFLT1(D1-7)蛋白。
此外，如将含sFLT1(D1-7)基因的重组质粒和含sKDR(D1-7)基因的重组质粒同时转染入细胞；则转染细胞中除可分泌表达sFLT1(D1-7)蛋白及sKDR(D1-7)蛋白，还可分泌表达由sFLT1(D1-7)蛋白单体及sKDR(D1-7)蛋白单体构成的异源双倍体蛋白。该异源双倍体蛋白的结构示意图见图2。
实施例三：sFLT1(D1-7)或sKDR(D1-7)蛋白的分离提纯及理化生物活性鉴定
在此例中，从收集的转染细胞培养液中分离提纯sFLT1(D1-7)或sKDR(D1-7)蛋白的方法为亲和层析柱法。亲和层析柱中的填充物为交联上重组人VEGF165蛋白的粒珠(用于交联的粒珠为cyanogen bromide activated agarose，购自Sigma)。以该亲和层析柱分离提纯sFLT1(D1-7)的其操作步骤如下：取收集含有sFLT1(D1-7)的细胞培养上清液100ml，经离心及以0.45μm滤膜过滤后，将滤液上样于亲合层析柱上；上样结束后，先以10倍于层析柱体积的1xPBS液洗脱层吸柱，共2-3次，再以1-2ml 0.1M的甘氨酸液(pH 2.0至3.0)洗脱被吸附的蛋白，洗脱下的成分再经调节pH(pH至7.0-7.4)及对1xPBS透析后即获得纯化的sFLT1(D1-7)。
上述分离提纯的FLT1(D1-7)蛋白以SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gelelectrophoresis，PAGE)，结合免疫印迹试验方法加以鉴定。其操作步骤如下：取不同量的纯化的重组sFLT1(D1-7)上样于8％SDS-PAGE凝胶，进行电泳分离。SDS-PAGE电泳结束后，取下凝胶，将蛋白质转印至PVDF膜(30V，4℃，16h)，再以1％BSA封闭，室温1～2h后，加入人源化的抗人FLT1抗体，37℃2h，PBS-0.1％tween 20洗板×3；再加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG多克隆抗体(1∶1000稀释)，37℃孵育1h。膜经充分漂洗后，加入显色液(邻苯二胺，3％H202)，至显色条带出现后，蒸馏水漂洗终止反应。如图3示：免疫印迹试验结果显示在110kd附近有主要显色带，其位置与推算出的sFLT1(D1-7)单体的分子量一致。此结果表明采用该亲和层析柱已成功分离及提纯到sFLT1(D1-7)蛋白。