4氧代2戊烯酸和脑健康.pdf

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1、10申请公布号CN104220056A43申请公布日20141217CN104220056A21申请号201380018306322申请日20130325CNCMI386520071115CNCMI39142008020512162358120120330EPA61K31/19200601A23L1/00200601A61K35/00200601C12R1/00200601A61P25/00200601A61P25/2820060171申请人雀巢产品技术援助有限公司地址瑞士沃韦72发明人FJ阿尔塞维拉B布尔其T比特勒S杜布克斯J杜尔加F法塔PA盖伊N帕日SAD莱兹I阿拉曼S朗加歇尔E鲁赫蒂P马。

2、吉斯特雷蒂74专利代理机构北京市中咨律师事务所11247代理人陈润杰黄革生54发明名称4氧代2戊烯酸和脑健康57摘要本发明一般涉及具有健康益处的组合物。特别而言，本发明涉及脑健康领域，例如脑保护、维持认知功能、预防认知减退和预防认知障碍。本发明的主题是用于治疗或预防认知减退的包含4氧代2戊烯酸的组合物。30优先权数据85PCT国际申请进入国家阶段日2014092986PCT国际申请的申请数据PCT/EP2013/0562532013032587PCT国际申请的公布数据WO2013/144077EN2013100383生物保藏信息51INTCL权利要求书1页说明书11页附图4页19中华人民共和国。

3、国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书11页附图4页10申请公布号CN104220056ACN104220056A1/1页21用于治疗或预防认知减退的包含4氧代2戊烯酸的组合物，其中所述组合物不用作药剂。2根据权利要求1使用的组合物，其用于治疗或预防记忆丧失、特别是短期记忆丧失。3根据前述权利要求中一项使用的组合物，其用于治疗或预防学习能力损失。4根据前述权利要求中一项使用的组合物，其中所述4氧代2戊烯酸获自天然来源。5根据前述权利要求中一项使用的组合物，其中4氧代2戊烯酸可获自短双岐杆菌CNCMI3865或短双岐杆菌ATCC15700。6根据权利要求5使用的组合物，其中所述短双岐。

4、杆菌CNCMI3865或短双岐杆菌ATCC15700在约60180、优选在约80160进行热处理。7根据前述权利要求中一项使用的组合物，其包含至少1MG/KG组合物、优选至少10MG/KG组合物、例如50MG至50G/KG组合物的量的4氧代2戊烯酸。8根据前述权利要求中一项使用的组合物，其以对应于2G至20MG4氧代2戊烯酸/KG体重、优选20G至2MG4氧代2戊烯酸/KG体重、例如40G至1MG4氧代2戊烯酸/KG体重的日剂量施用。9根据前述权利要求中一项使用的组合物，其口服或肠内施用。10根据前述权利要求中一项使用的组合物，其向人或宠物施用。11根据前述权利要求中一项使用的组合物，其向成年。

5、人、特别是老年人施用。12根据前述权利要求中一项使用的组合物，其中所述组合物选自下组食品组合物、食品添加剂、营养品、饮料、营养配方、管饲配方、在乳或水中重构的粉状组合物、和宠物食品组合物。权利要求书CN104220056A1/11页34氧代2戊烯酸和脑健康0001描述0002本发明一般涉及具有健康益处的组合物。特别而言，本发明涉及脑健康领域，例如脑保护、维持认知功能、预防认知减退和预防认知障碍。本发明的主题是用于治疗或预防认知减退的包含4氧代2戊烯酸的组合物。0003几乎每个国家中超过60岁的人的比例比任何其它年龄组增长得更快，其至少部分归因于预期寿命变长。这种人口老龄化可以被视为增加健康意识。

6、以及改善公共卫生护理的有效性和表现的成功故事。根据联合国人口司，超过60岁的人的全世界人口目前略低于9亿。到2050年，60岁以上的人口预计达到24亿。然而，老龄化增加患上多种疾病的风险，故现在我们社会的重要目的是允许人口以良好的健康状态老龄化。特别是对于老龄化人口，生活质量的核心是正确的认知表现及其维持。0004大多数常见的精神障碍影响认知功能，主要是记忆处理、感知和解决问题。最直接的认知障碍是健忘症、痴呆和谵妄。阿尔茨海默病是一种痴呆形式。数种年龄相关障碍可以通过适当营养来治疗或预防。然而，关于可采用来预防认知障碍的营养措施知之甚少。因此，强烈需要可用于保护正确认知功能的组合物。特别而言，。

7、需要鉴定可用于治疗或预防认知减退的组合物。0005因此，本发明的目的是改良技术状态，特别是提供可用于保持认知功能以及预防或治疗认知减退和/或认知障碍的组合物。0006发明人惊讶地看到，可由独立权利要求的主题实现本发明的目的。从属权利要求进一步开发本发明的理念。0007因此，本发明提供用于治疗或预防认知减退的包含4氧代2戊烯酸的组合物。组合物可以不用作药剂。0008本发明还提供4氧代2戊烯酸在制备用于治疗或预防认知减退的组合物中的用途。0009在本发明的范围内的“治疗”是指减少、抑制、减轻或改善。在本发明的范围内的“认知减退”是指认知功能的劣化。认知减退可通过例如脑功能的变化，尤其是脑老化，或来。

8、自疾病的损伤引起。00104氧代2戊烯酸具有CAS号4743822和下列式00110012在正常老化期间和在神经变性疾患如阿尔茨海默病中，增加的氧化应激促使认知表现减退。氧化应激由人细胞在控制因反应性氧种类自由基和过氧化物造成的细胞损伤中或在去除反应性中间体中的损害产生。过氧化物和自由基的产生导致细胞组分的损伤，包括蛋白质、脂质和DNA。然而，值得注意的是在特定条件下，反应性氧种类可以是有益的，因为它们被免疫系统用作杀死入侵病原体的方式。0013已发现氧化应激的不希望效应受抗氧化剂控制。核因子红细胞源性2样2，说明书CN104220056A2/11页4也称为NRF2，是抗氧化剂响应的主要调控因。

9、子。发明人惊讶地发现4氧代2戊烯酸激活NRF2。已知在很多神经元损伤急性模型中NRF2的激活在保护神经元方面起关键作用VARGASMR等人,JOURNALOFNEUROSCIENCE,2850,1357413581,2008。0014转录因子NRF2存在于细胞溶质中且结合于抑制剂KEAP1。当结合于KEAP1时，NRF2还被蛋白酶体快速降解，因此其基底浓度低。在被应激源例如一氧化氮、生长因子或重金属活化时，从KEAP1释放NRF2。NRF2浓度增加并且其易位到细胞核中。NRF2然后结合于存在于编码很多抗氧化剂酶的基因的启动子区中的抗氧化剂响应元件AREKENSLERTW等人,ANNUREVPH。

10、ARMACOLTOXICOL2007；4789116。0015已描述NRF2被食品化合物活化。已报道，分别从姜黄TURMERICRHIZOME、葡萄、花椰菜BROCCOLI和苹果分离的多元酚如姜黄素BALOGUNE等人,BIOCHEMJ2003年5月1日；371PT388795、白藜芦醇CHENCY等人,BIOCHEMBIOPHYSRESCOMMUN2005年6月17日；33149931000、莱服硫烷SULFORAPHANEFELBARBRY等人,JOURNALMEDICALPLANTSRESEARCH,5,473484,2011和槲皮素TANIGAWAS等人,FREERADICBIOLME。

11、D2007年6月1日；42111690703激活NRF2。例如US2009/0042980描述了包含神经保护量的亲电子化合物的组合物，其中亲电子化合物导致在哺乳动物细胞中NRF2从KEAP1/NRF2复合物解离。专利中所述的此类亲电子化合物的例子为姜黄素。然而，这些化合物在体内的吸收和生物利用度有待于确认，故仍然需要鉴定更多的可用于控制氧化应激的不希望效应的化合物和组合物。姜黄素、白藜芦醇、莱服硫烷和槲皮素的非常低的水溶解度影响它们的生物利用度。相比之下，4氧代2戊烯酸具有良好的水溶解度。0016氧化应激是一种已与数种病症的神经变性相关的过程AREYNOLDS等人,INTREVNEUROBIO。

12、L,82,2973252007。发明人调查了4氧代2戊烯酸是否使神经元免受氧化应激。使用神经元和星形细胞的共培养模型，他们发现4氧代2戊烯酸使神经元细胞免受被过氧化氢诱导的氧化应激。0017发明人还惊讶地发现4氧代2戊烯酸可获自一些经过热处理的细菌株。例如，当在90加热6小时时，短双岐杆菌BIDOBACTERIUMBREVECNCMI3865和短双岐杆菌ATCC15700TM的细菌制品均产生4氧代2戊烯酸。发现在离心并过滤经过热处理的细菌制品后，4氧代2戊烯酸存在于可溶性部分中。0018短双岐杆菌CNCMI3865于2007年11月15日保藏于COLLECTIONNATIONALEDECULT。

13、URESDEMICROORGANISMESCNCM,INSTITUTPASTEUR,25RUEDUDOCTEURROUX,F75724PARISCEDEX15,FRANCE。0019短双岐杆菌ATCC15700TM可商业获得，例如以ATCC15700的商标获自美国典型培养物保藏中心AMERICANTYPECULTURECOLLECTIONATCC,MANASSAS,VIRGINIA,USA。0020因此，本发明部分涉及用于治疗或预防认知减退的包含4氧代2戊烯酸的组合物；其中组合物不用作药剂。药剂是在药房中制备或分发且在医学治疗中使用的药物或药品于2012年07月17恢复。本发明的组合物可用于治。

14、疗或预防记忆丧失，特别而言短期记忆丧失。在本发明的范围内的“记忆丧失”是指存储、保留或回忆信息、包括过往经历、知识和思想的能力下降。在本发明的范围内的“短期记忆”是指存储、保留或回忆一周前记住的信息。任何类型的记忆丧失说明书CN104220056A3/11页5可以是可严重影响人们生活的痛苦和可怕的经历。特别而言，短期记忆丧失可使应付日常生活非常困难，故能够治疗记忆丧失的组合物是有利的。0021本发明的组合物可用于治疗或预防学习能力丧失。在本发明的范围内的“学习能力丧失”是指获取新知识或技能的能力下降，或者可获取此类知识或技能的速度下降。学习能力丧失可妨碍受害者适应其环境如新住处的改变。如中央供。

15、暖系统计时器、电视或电话的家居用品的越来越复杂的性质还为学习能力下降的患者创造现实的艰难。0022在本发明中，4氧代2戊烯酸可以获得，例如获自天然来源。很多人关心在工业上由化工原料合成的材料的安全性，尤其在将摄入这些材料的情况下，并且优选获自天然来源的材料。0023令人惊讶的是，发明人发现，一些菌株提供4氧代2戊烯酸的天然来源。特别而言，发明人已发现4氧代2戊烯酸可获自短双岐杆菌CNCMI3865或短双岐杆菌ATCC15700TM短双岐杆菌的模式株。将细菌用作4氧代2戊烯酸的来源是尤其有利的，因为例如通过使用生物反应器可以生产大量4氧代2戊烯酸。因此，在本发明中4氧代2戊烯酸可以获得，例如获自。

16、短双岐杆菌CNCMI3865或短双岐杆菌ATCC15700TM。0024该细菌可以在商业生产过程中在约60180、优选在约80160。例如在约110150进行热处理。发明人发现，在这些温度的热处理在可接受的时间内提供令人满意的4氧代2戊烯酸收率。不希望受理论束缚，应理解，热处理的温度越高4氧代2戊烯酸形成速率增加，而且使其降解速率增加。因此，这些温度在4氧代2戊烯酸的形成速率与其降解之间给出良好平衡。0025包含4氧代2戊烯酸的典型组合物可以包含至少1MG/KG组合物的量的4氧代2戊烯酸。一般而言，如果组合物包含至少10MG/KG组合物、例如在50MG至50G/KG组合物之间的量的4氧代2戊烯。

17、酸，则是优选的。0026待施用的最佳量的4氧代2戊烯酸可以由熟练技术人员容易地确定。0027在治疗性应用中，以足以至少部分治愈或阻止病症和/或其并发症的症状的量施用组合物。足以完成此的量被定义为“治疗性有效剂量”。对于此目的有效的量将取决于本领域技术人员已知的许多因素，如病症的严重性以及患者的重量和一般状况。在预防性应用中，向易受特定病症影响或另外处于特定病症风险的患者施用足以至少部分减少发展病症的风险的量的根据本发明的组合物。此类量被定义为“预防性有效剂量”。而且，精确量取决于许多患者特异性因素如患者的健康状况和重量。0028在本发明的框架中，4氧代2戊烯酸可以以治疗性有效剂量和/或以预防性。

18、有效剂量施用。本发明的组合物可以以对应于2G至20MG4氧代2戊烯酸/KG体重、优选20G至2MG4氧代2戊烯酸/KG体重、例如40G至1MG4氧代2戊烯酸/KG体重的日剂量施用。0029认知减退可影响宠物以及人。健康老龄化或老年宠物可展现出各种行为病症，例如老化宠物够可能不响应于它们的名字或熟悉的命令，即使在熟悉环境中可能迷路或困惑，可能不再问候或响应于它们的主人或访客，可能展现出白天活动减少，可能绕圈走路，可能回避感情，并且可以丧失膀胱或肠道控制。0030因此，提供向人或宠物施用的组合物是有利方面。在伴侣动物的情况下，此类治疗改良动物的整体生活质量，改良主人满意度并且改良主人与伴侣动物之间。

19、的联系。可向人说明书CN104220056A4/11页6或宠物施用本发明的组合物。0031本发明中所述的4氧代2戊烯酸和组合物可以向成年人、特别是年长者施用。如果对象具有相对的成熟年龄，则认为他们是成年人。当对象性成熟且能够生育时，则通常认为他们是成年人。0032如果对象已超过其所属国的平均预期寿命的前2/3，优选如果他们已超过其所属国的平均预期寿命的前3/4，更优选如果他们已超过其所属国的平均预期寿命的前4/5，则他们被认为是“年长者”。例如，根据英国国家统计局于2010年生于英国的人类男性出生时的预期寿命为78岁，因此他们在超过52岁、优选超过58岁6个月且更优选超过62岁5个月的年龄时被。

20、认为是年长的。0033例如，可以向至少45岁、至少60岁或至少75岁的年龄的人施用组合物。0034对于宠物，应考虑物种和品种。例如YORKSHIRETERRIER狗具有约12岁的预期寿命EJTAYLOR等人,PROCEEDINGSOFTHENUTRITIONSOCIETY,54,6456561995，故将在超过8岁、优选超过9岁且更优选超过9岁7个月的年龄时被认为是年长的。0035组合物的性质并不特别受限。其可以是用于口服或肠道施用的组合物。组合物可以是例如选自下组食品组合物、食品添加剂、营养品NUTRACEUTICAL、饮料、营养配方、管饲配方、在乳或水中重构的粉状组合物、和宠物食品组合物。。

21、0036组合物可以是食品组合物。根据本发明的食品组合物具有不同特征，例如乳、酸奶、奶酪、发酵乳、乳基发酵产品、冰淇淋、基于谷物的产品或发酵的基于谷物的产品、乳基粉末、冷冻的或耐贮藏的饮料、糖果、动物饲料特别对于家畜。0037食品组合物还可以进一步包含蛋白源、碳水化合物源、脂质源、矿物源和/或维生素源。蛋白质、碳水化合物、脂质、矿物和/或维生素的存在可具有数种优势。这些化合物通常促成最终产品的味道和口感。它们还为身体提供当其受认知障碍影响时可以急需的营养物。它们还允许将本发明的组合物配制成完整营养配方，以使无需另外的营养。0038溶于水中的化合物具有以多种方式、包括作为溶液或以胶囊或片剂形式口服。

22、方便施用的优势。包含4氧代2戊烯酸的组合物可以是水基，例如组合物可以包含溶解于水中的4氧代2戊烯酸。0039包含4氧代2戊烯酸的组合物可以是营养组合物。在本发明的范围内，术语营养品是指提供健康益处的作为强化食品、口服补充剂或饮食补充剂的食品。0040本领域技术人员应理解，他们可自由地组合本文公开的本发明的所有特征。特别而言，可以组合对于本发明的不同实施方案所述的特征。本发明的另外的优势和特征根据下列附图和非限制性实例是明显的。0041图1示出短双岐杆菌ATCC15700TM的粗制品OD50，在90加热6小时的标准化荧光素酶活性。结果在Y轴上被表示成技术上一式三份的平均SD。X轴值为样品的最终稀。

23、释度。0042图2示出短双岐杆菌CNCMI3865的粗制品OD50，在90加热6小时的标准化荧光素酶活性。结果在Y轴上被表示成技术上一式三份的平均SD。X轴值为样品的最终稀释度。0043图3示出用0至200M剂量范围的4氧代2戊烯酸温育的AREC32细胞的NRF2诱导倍数棒和细胞活力百分比线。NRF2倍数诱导为在4氧代2戊烯酸存在下说明书CN104220056A5/11页7AREC32细胞的荧光素酶活性RLU与未暴露细胞的基底荧光素酶活性之间的比率。通过ATP定量测量的细胞活力表示为对照未治疗细胞的相对百分比。结果被表示为技术上一式三份的平均SD并且代表四个独立实验。0044图4示出用25至5。

24、0V/V剂量范围的短双岐杆菌CNCMI3865的“纯制品”温育的AREC32细胞的NRF2诱导倍数棒和细胞活力百分比线。其它细节如图3所示。0045图5示出用不同浓度5至30的4氧代2戊烯酸刺激48小时对具有由过氧化氢100诱导的神经变性的神经元星形细胞共培养物的作用。各浓度以一式三份在三个独立实验中测试。误差棒为SEM。0046图6示出溶解于水中的4氧代2戊烯酸标准品的典型色谱图。较高的SRM与M/Z11369的跃迁反应相关联，而较低的SRM对应于M/Z11341的跃迁反应。保留时间以分钟X轴表示。信号强度Y轴以CPS表示。0047图7示出使用在90以圆形表示、120以三角形表示和140以正。

25、方形表示加热2、15、30和60分钟的短双岐杆菌CNCMI3865OD40的粗制品的HPLCESIMS/MS的4氧代2戊烯酸定量。0048实施例1通过4氧代2戊烯酸和细菌部分的NRF2激活NRF2报告基因测定0049使用NRF2报告基因测定测量NRF2的激活。该测定基于来自CRX生物科学DUNDEE,SCOTLAND的AREC32细胞系，一种在ARE控制下含有荧光素酶基因构建体的稳定转染MCF7乳腺癌的细胞系。荧光素酶是消化荧光素并且产生荧光的酶。抗氧化分子如叔丁基氢醌TBHQ经由结合于ARE的NRF2激活而诱导荧光素酶转录。荧光素酶活性使用荧光素酶试剂盒形式PROMEGAMADISON,WI。

26、来确定。荧光素酶活性与NRF2激活成比例。0050通过细菌部分的NRF2激活0051使用三种细菌株来调查通过微生物的NRF2激活短双岐杆菌CNCMI3865NCC2950、短双岐杆菌CNCMI3914NCC466和短双岐杆菌ATCC15700TMNCC2791。短双岐杆菌CNCMI3914于2008年2月5日保藏于COLLECTIONNATIONALEDECULTURESDEMICROORGANISMESCNCM,INSTITUTPASTEUR,25RUEDUDOCTEURROUX,F75724PARISCEDEX15,FRANCE。0052对于各株，将10ML含有005半胱氨酸的MRS琼脂用。

27、20L甘油储液接种并在37在厌氧条件中温育过夜以形成预培养物。然后通过用预培养物接种10ML含有005半胱氨酸的MRS制备另外的培养物最终OD600调节为01。将培养物在37在厌氧条件中温育16小时以形成P2培养物。将200ML含有005半胱氨酸的MRS用P2培养物接种最终OD600调节为01且将瓶在37在厌氧条件中温育16小时。0053测量OD600，将培养物以3300G离心10MIN且将细菌沉淀物用冷1XPBS磷酸盐缓冲液盐水洗涤两次且用1XPBS标准化至OD50。0054对于各细菌株，用两种方法获得细菌部分；“粗制品”和“纯制品”。0055如下获得细菌“粗制品”。将5MLOD50细菌制品。

28、在90于加热块来自TECHNE,STAFFORDSHIRE,UNITEDKINGDOM的DRIBLOCKDB3加热块中加热6小时。将经过加热的细菌制品在4以3300G离心10MIN，将上清液使用022M注射器滤器过滤且在4贮藏直至进一步分析。0056如下获得细菌“纯制品”。将5MLOD50细菌制品在4以3300G离心10MIN且说明书CN104220056A6/11页8将细菌沉淀物用5ML水重悬浮。在冷藏室中使用迷你珠敲打MBB装置破坏细菌细胞6个循环，以最大速度各90秒，每个循环之间停顿10MIN。将经破坏的细胞在4以3300G离心1H，将沉淀物用5ML1XPBS重悬浮并且于加热块中在90加。

29、热6小时。将经过加热的制品在4以3300G离心10MIN。将上清液使用022M注射器滤器过滤并在4储存直至进一步分析。0057通过使用斑点法铺板来确定“OD50悬液”的活菌计数，并使用具有下列设置的卤素水分分析仪METLERTOLEDO,GREIFENSEE,SWITZERLAND确定干重干燥温度为160且激活步阶干燥。0058为了确定NRF2激活，将样品在AREC32细胞于96孔板中接种中使用10个独立稀释1/2、1/4、1/6、1/10、1/15、1/20、1/25、1/30、1/40和1/50测试且于5CO2/空气孵育箱中在37温育24小时。使用荧光素酶和来自PROMEGA的CELLTI。

30、TERGLO试剂盒确定荧光素酶活性和细胞活力ATP测量。0059对于每次运行，用所有板中仅细胞的荧光素酶活性的平均值将所有孔的以相对光单位RLU测量的荧光素酶活性标准化。在测试的所有样品中，发现标准化程序不影响数据，这种观察允许不同运行中测量的样品的比较。0060对于每个样品，如下计算NRF2激活00611NRF2倍数诱导00620063NRF2倍数诱导对于筛选目的是非常有用的。然而，NRF2倍数诱导仅仅是定性测量，因为该计算不考虑样品稀释。00642每个样品的荧光素酶含量00650066“每个样品的荧光素酶含量”还反映NRF2激活，但可区分两个以类似NRF2倍数诱导激活NRF2的样品，因为该。

31、计算考虑样品稀释。0067每个样品的荧光素酶含量通过反映NRF2激活分子的量而允许NRF2激活的半定量。0068表A标准化荧光素酶活性和短双岐杆菌ATCC15700TM的粗制品OD50，在90加热6小时的“每个样品的荧光素酶含量”的计算0069说明书CN104220056A7/11页90070每个样品的荧光素酶含量937E5X2187E60071科学符号94E5等于94X1050072表B标准化荧光素酶活性和短双岐杆菌CNCMI3865的粗制品OD50，在90加热6小时的“每个样品的荧光素酶含量”的计算00730074每个样品的荧光素酶含量104E06X25260E070075如表A和B中图示。

32、，两个粗制品短双岐杆菌ATCC15700TM和短双岐杆菌CNCMI3865具有类似的最大NRF2诱导，但是具有不同荧光素酶含量/样品值。每个样品的荧光素酶含量值的差异反映它们相应的NRF2激活模式参见图1和2。0076相比之下，短双岐杆菌CNCMI3914并未显著地激活NRF2，参见比较表C。0077表C来自三种不同短双岐杆菌株粗制品的比较结果0078说明书CN104220056A8/11页100079表D来自三种不同短双岐杆菌株纯制品的比较结果00800081通过4氧代2戊烯酸的NRF2激活0082将4氧代2戊烯酸ALFAAESAR参考号L02185在NRF2报告基因测定中测试。将不同剂量的。

33、4氧代2戊烯酸应用于AREC32细胞上24小时，然后如上所述定量荧光素酶活性。还使用细胞TITERGLO试剂盒ATP定量测量细胞活力。0083如图3中所示，发现4氧代2戊烯酸分子以剂量依赖性方式强烈激活NRF2。AREC32细胞的活力不受低于70M剂量的4氧代2戊烯酸影响。NRF2激活的最佳剂量为约4050M。为了比较，图4示出，短双岐杆菌CNCMI3865的细菌部分以类似方式激活NRF2。0084实施例2使用4氧代2戊烯酸和细菌部分使神经元免受氧化应激0085化合物对细胞存活的有益作用通常是通过用神经毒性损害激发细胞培养物并在有限时间段内测量产生的氧化应激和兴奋性中毒来研究AKSENOVA等。

34、人,CURRENTNEUROVASCULARRESEARCH,2,73892005。因此，发明人使用神经元星形细胞共培养物模型以测试4氧代2戊烯酸对由氧化应激诱导的神经变性的潜在有益作用。氧化应激用过氧化氢诱导，并且比较用4氧代2戊烯酸处理的培养物和未经处理的那些培养物之间的细胞存活。0086模型由面向培养皿底部上接种的星形细胞的涂铺在玻璃盖玻片上的原代神经元组成。两个细胞区室通过石腊珠隔离，但是释出的化合物例如能量基质和谷胱甘肽前体可通过培养基从一个区室自由地扩散到另一个区室。0087将小鼠神经元的原代培养物在20MM直径玻璃盖玻片上的NEUROBASALTM培养基中说明书CN1042200。

35、56A109/11页11生长12天。将小鼠星形细胞的原代培养物在35MM直径皿中的星形细胞培养基中生长21天。在引发共培养之前2小时，去除星形细胞培养基并替换为新鲜神经元培养基。通过将具有神经元的玻璃盖玻片放入含有星形细胞培养物的皿中引发共培养，以使神经元面向星形细胞。然后在存在或缺少4氧代2戊烯酸下在48小时期间保持共培养。在该温育结束时，用100M过氧化氢激发共培养4小时或保持非激发态作为对照情形。在温育期结束时，通过使用MTT测定24,5二甲基噻唑2基2,5二苯基溴化四唑鎓分别评估神经元和星形细胞活力。0088选择MTT还原测定，以使它能够监测神经元和星形细胞两者中的细胞活力。MTT是通。

36、过胞内酶、脱氢酶和酯酶的作用捕获在活细胞内的膜渗透分子。在具有黄色的细胞MTT内，可主要被活细胞的线粒体脱氢酶还原成称为甲的紫色不溶产物。为了检测，将该紫色产物溶解以使用分光光度计在560NM进行比色定量。0089结果表示为4氧代2戊烯酸处理的共培养物的MTT还原测定值和基底值无4氧代2戊烯酸处理之间的差值，其被标准化为它们相应对照没有用过氧化氢激发的百分比。结果示于图5中。除10M之外的所有测试浓度显示清楚而显著的保护作用。5M4氧代2戊烯酸获得最强作用。0090实施例3HPLCMS/MS对4氧代2戊烯酸的定量0091为了定量4氧代2戊烯酸，开发了涉及将高效液相色谱与电喷雾离子化串联质谱法H。

37、PLCESIMS/MS耦合的高通量分析法。0092方法学00934氧代2戊烯酸标准品购自ALFAAESARWARDHILL,USA。发现4氧代2戊烯酸可溶于水中以达到至少20MG/ML。将4氧代2戊烯酸标准品化合物溶解于水中以达到10MG/ML的最终储备溶液，并进一步稀释于水中以建立校准曲线。0094在与3200QTRAP质谱仪APPLIEDBIOSYSTEMS耦合的湍流色谱TFC系统THERMOFISHER,WALTHAM,MA上进行HPLCESIMS/MS分析。使用的分析柱为购自THERMOFISHERWALTHAM,MA的HYPERSILGOLDAQ3X50MM,5M，其在室温和恒定流速。

38、600L/MIN下运行。流动相由溶剂A含有005乙酸的水和B含有005乙酸的甲醇构成。梯度程序为0MIN0B，以0B保持40秒0067MIN，在180秒内升至50B067367MIN，在10秒内从50B升至90B367383MIN，以90B保持120秒583MIN，之后回到0B且保持另外的300秒5831083MIN。注射体积为5L。0095以电喷雾负电离模式实现MS数据采集。使用T型接头，以流速10L/MIN注入与由溶剂A和B的HPLC流80/20,VV；06ML/MIN混合的4氧代2戊烯酸标准品5G/ML于水中的溶液来执行MS调节。氮气用于喷雾器和气帘气体。激活接口加热器且用设定在45KV。

39、的毛细管电压将块源温度保持在700。氮气还用作在中压选择下的碰撞气体。使用选择的反应监测SRM采集模式实现MS/MS检测。使用恒定停留时间50MS总扫描时间110MS，通过扫描M/Z11369碰撞能量11EV和M/Z11341碰撞能量26EV选择两个最强片段离子。去簇电压设定为29V。使用最强SRM信号执行定量分析，而基于由标准溶液计算的适当面积比，第二跃迁用于分析物确认。使用ANALYST151软件APPLIEDBIOSYSTEMS执行数据处理。0096通过HPLCMS/MS检测PBS和水中的4氧代2戊烯酸说明书CN104220056A1110/11页120097将4氧代2戊烯酸溶解于1XP。

40、BS或水中，如前述章节中所述，执行HPLCMS/MS的检测。与跃迁反应M/Z11369相关的SRM揭示，其与保留时间125MIN处的跃迁M/Z11341相关联的SRM相比，信号更强。观察到两种转变的保留时间类似，确认分析的正确性图6。在1XPBS数据未示出和水图7中成功地检测到分子4氧代2戊烯酸。0098建立4氧代2戊烯酸标准曲线0099为了准确定量细菌部分中4氧代2戊烯酸的量，在简单基质如1XPBS或HPLC级水中建立4氧代2戊烯酸的标准曲线。将商购4氧代2戊烯酸以不同剂量悬浮于1XPBS和水中。然后将HPLCESIMS/MS方法用于定量所估计剂量的4氧代2戊烯酸。在1XPBS和HPLC级水。

41、中，均观察到4氧代2戊烯酸的量从01至25G/ML和所得强度以CPS表示之间存在良好线性。0100定量细菌部分中的4氧代2戊烯酸0101在来自实施例1的经过热处理的细菌制品中定量4氧代2戊烯酸。在HPLCESIMS/MS分析之前将所有样品在HPLC级水3次稀释/样品中稀释。结果概述于表E中。0102表E来自实施例1的经过加热的粗和纯细菌制品OD50在90加热6小时中4氧代2戊烯酸的浓度G/ML。ND表示“不可检测的”，低于方法的检测限。01030104实施例4加热温度和时间对4氧代2戊烯酸从短双岐杆菌CNCMI3865的产生的影响0105为了表征在热处理后4氧代2戊烯酸从短双岐杆菌CNCMI3。

42、865的产生，使用不同温度执行动力学实验。在厌氧和PH控制条件下，用于该实验的生物质的“主原料MASTERSTOCK”在生物反应器中在37用MRS培养基产生。在生长培养16H后，去除培养基且将细胞用1XPBS洗涤两次，于含有10甘油的1XPBS中浓缩至OD13415E10CFU/ML，然后在80以50ML等分试样储存。0106然后如下由生物质主原料制备短双岐杆菌CNCMI3865的“工作生物质”将生物质用1XPBS洗涤两次且于1XPBS中调节至OD40。0107使用温度加热装置THA来调查不同加热时间和温度的作用。该系统为在生产环境中发现的典型装置的小规模形式。使用蒸汽加热含有生物质套筒的保持管。将90、120和140的样品温度应用多达60分钟的时间。然后将5ML各经热处理的生物质以5000G离心10MIN且过滤上清液02M，通过HPLCESIMS/MS定量4氧代2戊烯酸说明书CN104220056A1211/11页13含量。产生的4氧代2戊烯酸的量示于图7中。说明书CN104220056A131/4页14图1图2说明书附图CN104220056A142/4页15图3说明书附图CN104220056A153/4页16图4图5说明书附图CN104220056A164/4页17图6图7说明书附图CN104220056A17。