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1、10申请公布号CN104203218A43申请公布日20141210CN104203218A21申请号201380015232822申请日2013012261/589,12620120120USA61K9/16200601A61K9/14200601A61K39/395200601A61K38/28200601A61P17/00200601A61P37/0020060171申请人南达科他州立大学地址美国南达科他州72发明人海马钱德图马拉桑尼库马尔74专利代理机构北京安信方达知识产权代理有限公司11262代理人王思琪郑霞54发明名称菊糖和菊糖乙酸酯制剂57摘要本公开内容提供了包含菊糖或菊糖乙酸酯。
2、和活性剂的微粒或纳米颗粒的组合物，其中活性剂被包含在单独微粒或纳米颗粒内。活性剂可以是，例如，疫苗接种抗原、抗原肽序列、或免疫球蛋白。可将组合物掺入各种制剂中用于向受试者诸如人或动物施用。本发明还提供了使用组合物和制剂的方法，包括为了治疗、预防、或抑制传染病、自身免疫性疾病、免疫缺陷紊乱、肿瘤性疾病、退行性疾病、老化疾病，或其组合的目的刺激受试者中的免疫应答，或增强受试者中的免疫应答的方法。30优先权数据85PCT国际申请进入国家阶段日2014091986PCT国际申请的申请数据PCT/US2013/0224632013012287PCT国际申请的公布数据WO2013/110050EN2013。
3、072551INTCL权利要求书2页说明书28页附图16页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书28页附图16页10申请公布号CN104203218ACN104203218A1/2页21一种组合物，所述组合物包含菊糖或菊糖乙酸酯INAC和活性剂的微粒或纳米颗粒，其中所述活性剂被包含在单独微粒或纳米颗粒内。2如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包括微粒。3如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包括具有约1M至约30M的直径的微粒。4如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包括纳米颗粒。5如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包括具有约10NM至约1000NM。
4、的直径的纳米颗粒。6如权利要求1所述的组合物，其中所述菊糖或INAC具有约4KDA至约16KDA的分子量。7如权利要求1所述的组合物，所述组合物还包括一种或更多种免疫调节因子，其中所述一种或更多种免疫调节因子是淋巴因子、细胞因子、胸腺细胞刺激因子、单核细胞或巨噬细胞刺激因子，内毒素、或其组合。8如权利要求1所述的组合物，其中所述活性剂包括抗原、DNA、RNA、抗原肽或抗原序列、免疫原、或免疫球蛋白。9如权利要求1所述的组合物，其中所述活性剂包括细菌的溶解产物或病毒病原体、癌细胞、或与病原体或疾病相关的其他生物组分。10如权利要求9所述的组合物，其中所述生物组分包括肽、蛋白、脂质、DNA或多糖。。
5、11如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物还包括有效量的第二活性剂。12如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物体内或原位刺激免疫应答，并且所述免疫应答包括THLIGG2A型或TH2IGG1型免疫应答、或其组合。13一种组合物，所述组合物包含菊糖或菊糖乙酸酯INAC颗粒和活性剂，其中所述活性剂被包含在单独颗粒中或物理上与菊糖或INAC的颗粒缔合，并且其中所述组合物在人或动物中刺激针对活性剂的免疫应答。14如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物是包含菊糖乙酸酯的疫苗，并且其中对所述菊糖乙酸酯的乙酰化作用的程度为约01至100。15如权利要求1所述的组合物，其中所述菊糖是选自由以下组成的组的菊。
6、糖衍生物酯化的菊糖、醚化的菊糖、二醛菊糖、菊糖氨基甲酸酯、菊糖碳酸酯、菊糖的氧化或还原形式、和菊糖磷酸酯。16一种组合物，所述组合物包含菊糖或菊糖乙酸酯INAC和活性剂的微粒或纳米颗粒，其中所述活性剂被包含在单独微粒或纳米颗粒中，所述组合物用于在传染病、自身免疫性疾病、遗传性疾病、过敏症、糖尿病、免疫缺陷紊乱、肿瘤性疾病、退行性疾病或老化疾病的治疗中使用。17如权利要求16所述的组合物，其中所述菊糖是选自由以下组成的组的菊糖衍生物酯化的菊糖、醚化的菊糖、二醛菊糖、菊糖氨基甲酸酯、菊糖碳酸酯、菊糖的氧化或还原形式、和菊糖磷酸酯。18如权利要求16或17所述的组合物，其中所述组合物在动物中经由TL。
7、R诱导免疫原性应答。19如权利要求16、17或18所述的组合物，其中所述组合物是疫苗。权利要求书CN104203218A2/2页320如权利要求19所述的组合物，其中所述组合物包括INAC微粒。21一种用于产生抗体的方法，所述方法包含用包含根据权利要求120的任一项的组合物的制剂免疫动物或人，并且从所免疫的动物或人收集所述抗体。22如权利要求21所述的方法，所述方法还包括刺激免疫细胞，其中所述免疫细胞是巨噬细胞，其中所述抗体是单克隆抗体或来自多克隆血清的抗体，并且其中所述细胞在所述刺激后收集。23一种用于产生抗血清的方法，所述方法包含用包含根据权利要求120的任一项的组合物的制剂免疫动物或人，。
8、并从所免疫的动物或人，或从所免疫的动物或人的产物收集所述抗血清，其中所述组合物递送抗原至构成所述动物或人的免疫细胞作为TLR激动剂。24如权利要求23所述的方法，其中所述抗血清包含抗体。25如权利要求24所述的方法，其中所述抗体是单克隆抗体或来自多克隆血清的抗体。26如权利要求24或25所述的方法，其中所述动物是灵长类动物、狗、猫、奶牛、小羊、猪、阉猪、家禽、马、母马、骡、雄性动物、雌性动物、驹、犊、一岁动物、公牛、牛、绵羊、山羊、美洲鸵、野牛、水牛、羔羊、小山羊、小猪、母鸡、小鸡、火鸡、鸭、鹅、鸵鸟、鸟、兔、野兔、豚鼠、仓鼠、小鼠、大鼠、啮齿动物、鱼、水生动物或两栖动物。27如权利要求233。
9、6的任一项所述的方法，其中所组合物通过注射、吸入、口服、直肠、阴道、鼻、或局部来施用。28权利要求118的任一项的微粒或纳米颗粒作为佐剂的用途。29一种试剂盒，所述试剂盒包括A包含菊糖或菊糖乙酸酯INAC的微粒或纳米颗粒的组合物；B任选的活性剂；C容器；D一种或更多种缓冲液，E用于将活性剂与所述组合物缔合的说明书；以及F标签。30如权利要求29所述的试剂盒，其中所述活性剂选自由以下组成的组抗原、DNA、RNA、抗原肽、或抗原序列、免疫原、或免疫球蛋白。31如权利要求29所述的试剂盒，所述试剂盒还包括用于在动物或人中产生抗血清的说明书。32如权利要求29所述的试剂盒，其中所述菊糖是选自由以下组成。
10、的组的菊糖衍生物酯化的菊糖、醚化的菊糖、二醛菊糖、菊糖氨基甲酸酯、菊糖碳酸酯、菊糖的氧化或还原形式、和菊糖磷酸酯。33如权利要求30所述的试剂盒，其中所述活性剂包括细菌的溶解产物或病毒病原体、癌细胞、或与病原体或疾病相关的其他生物组分。34如权利要求33所述的试剂盒，其中所述生物组分包括肽、蛋白、脂质、DNA或多糖。35如权利要求29所述的试剂盒，其中所述组合物包括INAC的微粒。权利要求书CN104203218A1/28页4菊糖和菊糖乙酸酯制剂0001发明背景发明领域0002本发明一般涉及疫苗和佐剂，并且更具体地涉及包含菊糖和菊糖衍生物的疫苗和佐剂，其中所述菊糖和菊糖衍生物用作递送装置以及佐。
11、剂，包括包含其的纳米颗粒和微粒组合物以及使用所述组合物治疗的方法。0003背景资料0004接种疫苗的目的是通过产生对施用抗原的强免疫应答，以提供针对感染的长期保护。疫苗通常需要加入称为佐剂的免疫刺激剂，以提高对抗原的特异性免疫应答的效力和寿命。理想的疫苗佐剂应刺激对共注射的抗原的体液TH2型和细胞TH1型两种免疫应答。需要体液应答以清除细胞外的病原体。细胞应答对消除细胞内的病原体是至关重要的。0005在美国用于人类使用的唯一被批准的佐剂明矾铝盐，仅刺激体液免疫应答。虽然已成功地开发了仅使用明矾作为佐剂引起保护性抗体应答的一些基于重组蛋白的疫苗，包括用于乙型肝炎和人乳头状瘤病毒的那些疫苗，但针对。
12、疾病诸如癌症、疟疾、疱疹、流感、结核、HIV和/或AIDS的下一代的重组疫苗，将不仅需要非常强且持久的抗体应答，而且需要有效的细胞介导的免疫应答。0006因此，对可促进受试者中抗体应答的新组合物存在需要。还对可促进体液和细胞两种免疫应答的新颖疫苗佐剂、抗原递送系统、和组合物存在需要。0007发明概述0008本发明提供了当作为微粒或纳米颗粒递送时刺激免疫系统的可溶性或不溶性的多糖聚合物。当作为微粒或纳米颗粒配制时，菊糖的亚型菊糖及其半合成衍生物菊糖乙酸酯INAC可作为新颖疫苗佐剂和抗原递送系统起作用。颗粒可被用于为了预防或抑制传染病、自身免疫性疾病、免疫缺陷紊乱、肿瘤性疾病、退行性疾病、或老化疾。
13、病的目的刺激受试者中的免疫应答。0009在实施方案中，公开了包含菊糖或菊糖乙酸酯和活性剂的微粒或纳米颗粒的组合物，其中活性剂可被包含在单独微粒或纳米颗粒内。活性剂可包括抗原、抗原肽或其序列、免疫原、免疫球蛋白、或其组合。在相关的方面中，活性剂可以是期望针对其的免疫应答的半抗原或任何剂。0010在实施方案中，公开了包含菊糖或菊糖乙酸酯颗粒和活性剂的组合物，其中活性剂可被包含在单独颗粒内，或在物理上与菊糖或菊糖乙酸酯的颗粒缔合，其中当向人或动物施用时，组合物有效地在人或动物中刺激针对活性剂的免疫应答。0011在一个方面，疫苗组合物包含抗原和有效佐剂量的菊糖乙酸酯，其中对菊糖乙酸酯的乙酰化的程度为约。
14、01至100。0012在另一个方面，组合物包含菊糖或菊糖衍生物和活性剂的微粒或纳米颗粒，活性剂包括抗原、抗原肽序列、或免疫球蛋白，并且组合物包含有效佐剂量的菊糖或菊说明书CN104203218A2/28页5糖衍生物，其中菊糖衍生物包括在颗粒制剂形式中的酯化的菊糖、醚化的菊糖、二醛菊糖、菊糖氨基甲酸酯、菊糖碳酸酯、菊糖的氧化或还原形式、菊糖或其氧化或还原形式与另外的活性剂的络合、菊糖的阳离子/阴离子/非离子的修饰、或菊糖的磷酸酯，其中将抗原包封在颗粒内，涂覆或缀合至颗粒上或可包括其组合。0013在实施方案中，公开了为了治疗或抑制传染病、自身免疫性疾病、免疫缺陷紊乱、肿瘤性疾病、遗传性疾病、退行性。
15、疾病或老化疾病的目的刺激受试者中免疫应答的方法，其中方法包括向需要其的受试者施用有效量的本文描述的组合物。0014在实施方案中，公开了提供为了治疗或抑制传染病、自身免疫性疾病、免疫缺陷紊乱、肿瘤性疾病、遗传性疾病、退行性疾病或老化疾病的目的增强受试者中免疫应答的方法，其中方法包括向需要其的受试者施用有效量的本文描述的组合物。0015在实施方案中，公开了诱导受试者中免疫原性应答的方法，包括对所述受试者施用有效量的本文描述的组合物。0016在另一个实施方案中，公开了治疗感染的方法，包括向需要其的受试者施用有效量的本文描述的组合物。感染可由细菌、支原体、真菌、病毒、原生动物、或其他微生物、或其组合引。
16、起。0017在实施方案中，公开了治疗动物或人中侵染的方法，包括向患有侵染的动物或人施用有效量的本文描述的组合物。侵染可由微生物、蠕虫、寄生物、或其组合引起。0018在实施方案中，公开了用于产生抗体或用于刺激免疫细胞的方法，包括用包含本文描述的组合物的制剂免疫动物或人，并从被免疫的动物或人收集抗体或免疫细胞。抗体可以是，例如，单克隆抗体或多克隆抗体或其功能片段例如，FAB、SCFV、抗体缀合物或类似的抗体片段。0019在实施方案中，公开了用于生产抗血清的方法，包括用具有本文描述的组合物的制剂免疫动物或人，并从免疫的动物或人、或从免疫的动物或人的产物诸如动物的卵收集抗血清。抗血清可包含抗体，其中抗。
17、体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。动物可以是灵长类动物PRIMATE、狗DOG、猫CAT、奶牛COW、小羊LAMB、猪PIG、阉猪HOG、家禽POULTRY、马HORSE、母马MARE、骡MULE、雄性动物JACK、雌性动物JENNY、驹COLT、犊CALF、一岁动物YEARLING、公牛BULL、牛OX、绵羊SHEEP、山羊GOAT、美洲鸵LLAMA、野牛BISON、水牛BUFFALO、羔羊LAMB、小山羊KID、小猪SHOAT、母鸡HEN、小鸡CHICKEN、火鸡TURKEY、鸭DUCK、鹅GOOSE、鸵鸟OSTRICH、鸟FOWL、兔RABBIT、野兔HARE、豚鼠GUINEAPIG、仓鼠。
18、HAMSTER、小鼠MOUSE、大鼠RAT、啮齿动物RODENTS、鱼SH、水生动物AQUATICANIMAL或两栖动物AMPHIBIAN。0020组合物可通过注射、吸入、口服、直肠、阴道、鼻、或局部施用。在与颗粒包封或缔合前，活性剂可与生理上可接受的无毒媒介物组合来制备，或在与活性剂包封或缔合后，颗粒可与生理上可接受的无毒媒介物组合。0021在一个方面，本文描述的微粒或纳米颗粒可被用作佐剂。在一个相关方面，本文描述的组合物的颗粒可以是微粒。微粒可具有约1GM至约30M、约15GM至约25M、或约2M至约20M的直径。颗粒还可以是纳米颗粒。纳米颗粒可具有约10NM至约1000NM、约10NM至。
19、约950NM、约10NM至5约900NM、约50NM至约900NM、约100NM至约800NM、约10NM说明书CN104203218A3/28页6至约400NM、约400NM至约900NM、或约20NM至约750NM的直径。0022在另一个方面，菊糖或菊糖乙酸酯可具有约4KDA至约25KDA的分子量。0023在一个方面，组合物还可包括一种或更多种免疫调节因子，诸如淋巴因子、细胞因子、胸腺细胞刺激因子、单核细胞或巨噬细胞刺激因子、内毒素、病原体相关分子模式PAMS、模式识别受体的配体PRR、或其组合。0024在另一个方面，活性剂可以是抗原、抗原肽、或抗原序列、或免疫球蛋白。在相关的方面，抗原可。
20、以是，例如，DNA或RNA，或包含DNA或RNA的生物组分。在另外的相关方面，活性剂还可包括细菌的溶解产物或病毒病原体、癌细胞、或与病原体或疾病相关的其他生物组分ALYSATEOFABACTERIALORAVIRALPATHOGEN,CANCERCELL,OROTHERBIOLOGICALCOMPONENTASSOCIATEDWITHAPATHOGENORADISEASE。例如，生物组分可以是肽、蛋白、脂质、DNA、或单独的多糖。0025在一个方面，组合物还可包括有效量的与颗粒包封或缔合的或与颗粒一起被包含在制剂中的第二活性剂。0026在另一个方面，本文描述的组合物的施用可刺激免疫应答。免疫应。
21、答可包括TH1IGG2A、细胞毒性T细胞或TH2IGG1、IGA类型的免疫应答、或其组合。在相关的方面，向动物或人的施用可减少由活性剂、或与活性剂相关的疾病或状况引起的症状的至少一个。0027在一个方面，免疫组合物包括，与药学上可接受的载体、稀释剂、或赋形剂组合的本文描述的组合物。在相关的方面，可将免疫组合物配制为液体、半固体、胶体或固体剂型。在另外的相关方面，载体可以是液体媒介物或稀释剂可以是固体稀释剂，例如，用于干粉吸入的固体稀释剂。0028在实施方案中，公开了菊糖或菊糖衍生物，诸如菊糖乙酸酯的微粒和纳米颗粒制剂，以及其用作免疫刺激剂的用途。在相关的方面，向受试者施用后的前30分钟，制剂可。
22、具有小于约30WT的包封的或物理上缔合的分子的突释。0029在实施方案中，在向受试者施用后的前30分钟，制剂可具有小于约20WT的突释、小于约15WT的突释、或小于约10WT的突释。在相关的方面，包封的材料的约90WT的释放是约20天。0030在实施方案中，公开了本文描述的组合物用于疾病的医疗、兽医、和人畜共患病的ZOONOTIC治疗或预防的用途。在一个方面，药物治疗可以是预防和治疗癌症或其他恶性肿瘤，包括，但不限于乳腺癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、脑癌、或结肠癌、以及淋巴瘤和白血病、和骨骼、血液、或淋巴系统的癌症。0031在实施方案中，公开了如本文描述的组合物用于制造治疗哺乳动物中疾病，例如人。
23、的癌症的药剂的用途。在一个方面，公开了如本文描述的组合物用于制造治疗非哺乳动物物种中疾病的药剂的用途。在相关的方面，药剂可包括药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体。0032在实施方案中，公开了试剂盒，包括包含菊糖或菊糖乙酸酯的微粒或纳米颗粒的组合物；任选地活性剂；容器；一种或更多种缓冲液，用于活性剂与所述组合物缔合的说明书；以及标签。0033附图简述说明书CN104203218A4/28页70034以下附图构成本说明书的一部分，并且被包括以进一步说明本公开内容的某些实施方案或各个方面。在一些情况下，本公开内容的实施方案可通过参照附图结合本文提供的详细说明书被最好地理解。0035说明书和附图可突出。
24、显示本公开内容的某些具体实施例、或某些方面。然而，本领域技术人员将理解，该实施例或方面的部分可与本公开内容的其他实施例或方面结合来使用。0036图1示出由FTIR光谱学对菊糖和菊糖乙酸酯的IR光谱的比较。0037图2示出卵白蛋白从INAC微粒的体外释放曲线。释放研究用在PH74下的1ML的100MMPBS中分散的10MG的微粒以约100RPM震动在37下来进行。在不同时间间隔取样，并用等体积的新鲜PBS来代替。卵白蛋白浓度通过二辛可宁酸BCA蛋白质测定法来测量N3。0038图3示出树突状细胞对抗原OVA的摄取。A将DC24细胞与在溶液中或在菊糖微粒中的FITCOVA温育后的流式细胞术。B由荧光。
25、显微镜示出如与3A中的相同的结果，DC24细胞的细胞核用DAPI来染色。0039图4示出了AINAC通过MYD88或MAL依赖性TLR激活巨噬细胞，且BINAC微粒与TLR4相互作用。指示使用STUDENTT检验，结果在统计上是显著的P1聚呋喃果糖基D葡萄糖的家族组成的多糖类，其中将典型多达约100果糖部分的无支链的链对于植物衍生的材料N约5至约100且对于微生物衍生的材料约5至约100,000连接至单一末端葡萄糖单元。00700071菊糖是植物衍生的多糖并具有相对疏水性的、聚氧乙烯样的主链。这种结构和其非电离化性质允许以非常纯净的状态再结晶和制备。可将菊糖以多达约16KDA的分子量制备为分子。
26、多分散的MOLECULARLYPOLYDISPERSE。合适的菊糖颗粒诸如本文描述的说明书CN104203218A108/28页11IN和INAC颗粒可从具有约2KDA至约12KDA、约3KDA至约8KDA、约4KDA至约6KDA、或约5KDA的分子量的原始菊糖RAWINULIN来制备。0072菊糖充当菊科植物COMPOSITAE或菊科ASTERACEAE的贮藏碳水化合物并从大丽花块茎以高分子量来获得。菊糖可商购获自多个供应商，诸如SIGMASTLOUIS,MO。菊糖以几种不同的形式多晶型存在，包括、和形式例如，见WO2011/032229PETROVSKY等人。这些形式可由其溶解度参数来区分。
27、。菊糖IN和菊糖IN可分别通过从水和乙醇沉淀来制备。和两种异构体37下基本上可溶于水。菊糖IN37下不溶于水，但在7080下以高浓度50MG/ML可溶于水。以型多晶型形式或以任何水溶性形式的菊糖从未被示出具有佐剂/免疫增强效应。0073术语“菊糖乙酸酯”INULINACETATE，INAC是指乙酰化的菊糖。通常至少约90的菊糖的可用羟基基团被乙酰化，并经常为至少约95、或至少约98。在实施方案中，可使用较低程度乙酰化的菊糖，诸如有至少约10的可利用的羟基基团被乙酰化的菊糖。在实施方案中，至少约25、至少约50、或至少约75的可利用的羟基基团可被乙酰化用于各种菊糖乙酸酯制剂。在实施方案中，当其红。
28、外线光谱中的羟基峰消失且乙酰基峰出现时，认为乙酰化的菊糖是菊糖乙酸酯。菊糖乙酸酯即使在高温下不溶于水，但可溶于各种有机溶剂诸如丙酮、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、以及类似的有机溶剂。0074菊糖乙酸酯不启动补体旁路途径APC，并且当与抗原共注射时，INAC不起疫苗佐剂的作用。INAC容易分散于盐水中。抗原必须被包封在INAC颗粒内部或物理上与INAC颗粒缔合以用作疫苗佐剂。INAC微粒和纳米颗粒可通过增强抗原的摄取和递送包封的抗原至免疫细胞的相关区室用于活化来用作疫苗佐剂。INAC还是新颖的TLR激动剂，如本文首次显示的。虽然不受理论所束缚，但这表明INAC通过与非乙酰化的菊糖形式不同的机制作为疫。
29、苗佐剂起作用。0075除了菊糖乙酸酯外或代替菊糖乙酸酯，可使用其他菊糖衍生物。菊糖衍生物可以是其中菊糖的羟基基团通过用烷基、芳基或酰基基团的化学取代，或通过由已知方法氧化或还原被修饰的菊糖。参见，例如，由GREGTHERMANSON描述于BIOCONJUGATETECHNIQUES,ACADEMICPRESS,SANDIEGO,CA1996的技术。0076菊糖衍生物包括酯键、醚键、酰胺键、氨基甲酸酯键、菊糖的氧化或还原形式及其衍生物、菊糖的阳离子/阴离子/非离子型修饰阴离子O羧甲基菊糖；阳离子INUTECH25P、以及菊糖或其氧化/还原形式与其他剂的络合例如，氧化的菊糖与重金属诸如铜、锌、镉、。
30、或类似的重金属的络合。0077“菊糖酯”或“酯化的菊糖”是指，通过与形成酯的基团诸如羧酸缩合或与基团诸如羧酸酐酰化，或类似的对羟基基团酯化的菊糖。菊糖酯的实例包括但不限于菊糖丙酸酯、菊糖丁酸酯、菊糖磷酸酯，以及类似物。0078“菊糖醚”或“醚化的菊糖”是指，通过用形成醚的基团诸如具有适当离去基团诸如卤化物、酰基卤、或类似基团的基团对羟基基团醚化的菊糖。菊糖醚的实例包括但不限于甲基化的菊糖例如，菊糖全甲基醚、乙基化菊糖、和类似物。0079菊糖的氧化或还原形式及其衍生物的实例包括菊糖碳酸酯、二醛菊糖和类似物。可使用的其他菊糖衍生物包括氰基乙基菊糖、氨基3氧代丙基菊糖、羧乙基菊糖、羟亚说明书CN10。
31、4203218A119/28页12氨基3氨基丙基菊糖、菊糖氨基甲酸酯例如，INUTECSP1，或其组合。0080菊糖衍生物可以是其中将货物分子例如，抗原包封在颗粒内，或涂覆或缀合至颗粒上的粒状制剂的形式。菊糖的可用羟基基团的修饰可为如上对于菊糖乙酸酯的乙酰化描述的程度。0081“活性剂”或“活性”是指可与菊糖或INACC颗粒包封或物理上缔合的药物、免疫学试剂例如，抗原、或其他货物分子。“物理上缔合”是指通过静电相互作用，包括亲水性、疏水性相互作用，或氢键与聚合物或颗粒形成的缔合。“与颗粒物理上缔合”可指用试剂涂覆颗粒，以及将颗粒共价地缀合至试剂。0082缀合的方法是本领域熟知的并且几种技术描述。
32、于GREGTHERMANSONINBIOCONJUGATETECHNIQUES,ACADEMICPRESS,SANDIEGO,CA1996中。可将活性剂以总计的颗粒和货物和/或物理上缔合的分子的约1WT至约25WT、约1WT至约10WT、或约1WT至约5WT装载进颗粒。0083“抗原”是指能够在适当条件下，诱导特定免疫应答，并与该应答的产物即，与特定抗体或特定致敏的T淋巴细胞，或两者发生反应的任何物质。术语“抗原”、“免疫原性剂”和“活性剂”在本文档中可互换使用。抗原可以是可溶性物质，诸如毒素和自身或外来蛋白/肽、或颗粒状物质，诸如细菌、病毒、和组织细胞；然而，称为抗原决定簇或表位的蛋白或多糖。
33、分子的仅一小部分被淋巴细胞上的特定受体识别。类似地由响应产生的抗体或效应淋巴细胞仅与一个抗原决定簇结合。细菌细胞或大蛋白可具有数百个抗原决定簇，其中的一些在保护性免疫中比其他抗原决定簇更重要。0084可与本文提供的佐剂一起使用的已知抗原的部分列表如下同种异体抗原，其在相同物种的一些而非所有个体中出现，例如，组织相容性抗原和以前称为同族抗原的血型抗原；细菌抗原；血型抗原，其存在于红细胞的表面上，并在相同物种的个体之间发生变化，并且被用作为血型分型的基础；荚膜抗原；K、L和V抗原；癌胚抗原CARCINOEMBRYONICANTIGEN，CEA；瘤胚抗原ONCOFETALANTIGEN；共同抗原CO。
34、MMONANTIGEN，其是存在于两种或更多种不同抗原分子中的抗原决定簇并且是它们之间交叉反应的基础；完全抗原，其是既刺激免疫应答又与该应答的产物，例如抗体发生反应的抗原；缀合抗原CONJUGATEDANTIGENS；半抗原；交叉反应的抗原是由于抗原决定簇的相似性与响应于不同但相关的抗原产生的抗体组合的抗原，或两种细菌菌株中的相同抗原，使得针对一种菌株产生的抗体将与另一菌株发生反应；狗红细胞抗原DEA，其是发现于狗红细胞上并用于区分物种中不同血型的抗原；环境抗原，发现于花粉、真菌、屋尘、食物和动物皮屑中的那些抗原；猫致癌RNA病毒细胞膜抗原FOCMA，其是存在于感染了猫白血病病毒的猫的细胞的膜。
35、上的肿瘤特异性抗原；鞭毛抗原；H或HAUCH抗原，其是在细菌鞭毛中出现的抗原；跳蚤抗原，其包括跳蚤唾液，以及跳蚤的提取物中的某些组分；福斯曼抗原；异嗜性抗原，其是在多个不相关的物种，主要在器官但不在红细胞、或仅在红细胞、或偶尔在器官和红细胞两者中出现的抗原；组特异性GS抗原，其为一组特定的生物体，例如，链球菌、致癌RNA病毒所共有；异质抗原；异种抗原；异嗜性抗原；异种抗原，其包括能够刺激与来自其他动物或植物的组织反应的抗体的产生的抗原；隐藏的抗原，其是正常不暴露于循环的淋巴细胞的抗原，例如，在中枢神经组织、睾丸组织和某些胞内组分中，并因此其正常不引起免疫应答；组织相容性抗原；HY抗原，其是细胞。
36、膜的组织相容性抗原；IA抗原，其是由位于B淋巴细胞、T淋说明书CN104203218A1210/28页13巴细胞、皮肤、和某些巨噬细胞的主要组织相容性复合体MHC的I区支配的组织相容性抗原；同基因抗原，其是由个体、或同一纯系株的成员携带的抗原，能够在相同物种的遗传上不同个体中引起免疫应答，但在携带它的个体中不引起免疫应答；K抗原；细菌荚膜抗原；L抗原，其是大肠杆菌ESCHERICHIACOLI的荚膜抗原；LY抗原，其是T淋巴细胞的亚群的抗原性细胞表面标志物，分类为LY1、2和3；淋巴细胞限定性LD抗原；发现于淋巴细胞、巨噬细胞、表皮细胞和精子中的II类抗原；M抗原，表现为主要位于细胞壁中并与化。
37、脓性链球菌STREPTOCOCCUSPYOGENES的毒力相关的类型特异性抗原；马立克氏肿瘤特异性抗原MATSA，发现于感染了马立克氏病、疱疹病毒的细胞的表面；内格里抗原，其是通过丙酮和甲醇从死的、干燥的及捣碎的结核杆菌中制备的抗原；核抗原，其是与抗核抗体发生反应的细胞核组分；0抗原，其在细菌的细胞壁中出现；瘤胚抗原，其是在胎儿发育过程中表达，但在成人的特化的组织中被抑制，并且还被某些癌症产生的基因产物，包括甲胎蛋白和癌胚抗原CARCINOEMBRYONICANTIGEN；器官特异性抗原，其是仅出现在特定器官中，并用于将其与其他器官区分开的任何抗原；部分抗原PARTIALANTIGEN；花粉抗。
38、原，植物的花粉的主要多肽；稀有抗原，其是低频血型的抗原；回忆抗原，其是个体先前已被其致敏化而随后作为攻击剂量施用以诱发过敏性反应的抗原；隔离抗原，其是在胚胎发育过程中被从免疫系统解剖学上隔离，并因而认为不被识别为“自身”且在成年时期此类抗原如果暴露于免疫系统，将引起自身免疫应答的某些抗原；血清学限定性SD抗原，其是由使用特定的抗血清可鉴定的主要组织相容性复合物的I类抗原；合成的抗原，基于微生物中发现的或其他抗原的序列，化学合成或通过重组DNA技术、聚合物的合成产生；T依赖性抗原大部分抗原的免疫应答需要T辅助TH淋巴细胞；由T淋巴细胞产生的淋巴因子决定产生的抗体的特性，其可在免疫应答期间发生改变。
39、；胸腺依赖性抗原，在免疫应答发生之前需要T淋巴细胞参与的抗原；胸腺非依赖性抗原，引起抗体应答而无T淋巴细胞的参与的抗原；致耐受性抗原；肿瘤特异性抗原TSA，其是仅发现于肿瘤细胞内的抗原；V抗原，VI抗原，其是包含在细菌的荚膜中并认为促进其毒性的抗原；异种抗原，其是一个物种的成员共有，而不与其他物种的成员共有的；还称为异质抗原。0085“补体途径”是指由通常以非活性酶原形式存在的众多血清糖蛋白组成的复杂的酶级联。系统具有三种不同的途径“经典途径”、“旁路途径”和“卵磷脂途径”。补体系统的经典途径是人的免疫应答的体液分支的主要效应器。经典途径的引发物是结合至抗原的IGG或IGM抗体。抗体结合抗原暴。
40、露了抗体上的位点，其是第一补体组分CL的结合位点。0086“补体旁路途径”或APC不需要抗体用于其活化。而是，多种抗原诸如细菌脂多糖LPS和病毒和其他病原体的组分具有激活该途径的能力。虽然不受理论所束缚，认为其进化早于经典补体途径，经典补体途径依赖于相对较近演变的抗体分子。像经典途径一样，旁路途径产生C3和C5转化酶两者，其导致产生C5B，并然后形成膜攻击复合物MAC。然而，特定分子参与者和接下来所遵循的路径却不同于经典补体途径的那些。0087尽管用于每种途径的刺激因子是不同的，每个途径具有类似的末端序列，其产生膜攻击复合物MAC，膜攻击复合物MAC是穿过各种细胞表面的酶复合物。此外，旁路和经。
41、典途径两者具有作为其副产物的一些过敏毒素促进炎症应答的小肽。0088参与补体系统的分子通常被提供名称“C”，并然后是数字，例如“C1”。这些数字不指示其在级联中起作用的顺序，而指其被发现的顺序。补体蛋白通常以酶原形式存在，并通说明书CN104203218A1311/28页14过各种分子的连续裂解依次激活。当分解补体蛋白时，形成两个片段，通常称为“A”和“B”。例如，补体分子C5裂解成片段C5A和C5B。0089卵白蛋白，或“OVA”，是水溶性白蛋白并且是鸡蛋清的主要组分。蛋清中总蛋白的约6065是卵白蛋白。卵白蛋白可用作贮藏蛋白并且鸡蛋的卵白蛋白可用作在测试受试者中刺激过敏反应的抗原。0090。
42、如本文使用的术语“动物”，是指任何界的生物，包括但不限于动物界的成员，包括通常在以下与植物不同的多细胞生物体和单细胞生物体1具有无纤维素壁的细胞，2缺乏叶绿素和光合能力，3需要更复杂的食品原料，例如，蛋白质，4被组织到更大程度的复杂性，以及5具有自发运动和对刺激的快速运动响应的能力。如本文使用的术语动物，还指任何动物界大分类，或亚界，和其下的主要分类，包括，但不限于脊椎动物门，包括哺乳类或哺乳动物，包括鸟纲或鸟类、爬行纲、两栖纲、鱼纲或鱼类、MARSIPOBRANCHIATA脊椎动物门CRANIOTA；和LEPTOCARDIA头索动物门ACRANIA；被囊动物，包括海樽，和ASCIDIOIDE。
43、A或海鞘；有关节类ARTICULATA或有环类ANNULOSA，包括昆虫纲、多足纲MYRIAPODA、软足亚门MALACAPODA、蛛形纲、海蜘蛛亚门PYCNOGONIDA、肢口纲MEROSTOMATA、甲壳纲节肢动物门；和环节动物纲、GEHYREAANARTHROPODA；蠕虫或蠕形动物VERMES，包括轮虫纲、毛颚动物门、NEMATOIDEA、棘头虫纲ACANTHOCEPHALA、纽形动物门NEMERTINA、涡虫纲TURBELLARIA、吸虫纲、绦虫纲CESTOIDEA、中生动物MESOZEA。拟软体动物门MOLLUSCOIDEA，包括腕足类和苔藓动物门；软体动物门，包括头足纲、腹足纲、。
44、翼足目PTEROPODA、掘足纲SCAPHOPODA、瓣鳃类LAMELLIBRANCHIATA或无头亚目ACEPHALA；棘皮动物门，包括海参纲HOLOTHURIOIDEA、海胆纲、海星纲ASTERIOIDEA、蛇尾纲OPHIUROIDEA和海百合纲CRINOIDEA；腔肠动物门，包括珊瑚虫纲或水螅体；栉水母类和水螅纲或水母类ACALEPHS；SPONGIOZOA或多孔动物门，包括海绵；和原生动物，包括纤毛虫纲和根足纲。如本文使用的术语动物，还指以下非限制性实例人、灵长类动物、狗、猫、奶牛、小羊、猪、阉猪、家禽、马、母马、骡、雄性动物JACK、雌性动物JENNY、驹、犊、一岁动物、公牛、牛、绵。
45、羊、山羊、美洲鸵、野牛、水牛、羔羊、小山羊、小猪、母鸡、小鸡、火鸡、鸭、鹅、鸵鸟、其他鸟类或家禽、兔、野兔、豚鼠、仓鼠、小鼠、大鼠、和其他啮齿动物、鱼、和水生物种或两栖动物。如本文使用的术语“动物”还指转基因动物。0091如本文使用的术语“受试者”是指是医学或科学研究的目标的动物。0092二辛可宁酸BCA蛋白测定法是用于确定溶液中的蛋白的总水平的生化测定例如，05G/ML至15MG/ML。总蛋白浓度通过样品溶液与蛋白浓度成比例的从绿色至紫色颜色变化来呈现，然后其可使用比色分析技术来测量。0093自1926年以来，明矾是美国用于人类使用的唯一批准的佐剂，但其仅产生体液免疫应答TH2型。此外，明矾。
46、佐剂疫苗具有许多缺点，包括在常规冻干和冷冻时效力损失MAA等人，JPHARMSCI2003；92231932。许多目前可用的疫苗的冷储藏，对制药企业和供应商是严重的问题，特别是在发展中国家。0094本文描述的实施方案提供了能够刺激两组免疫系统包括体液对于细胞外病原体和细胞对于细胞内病原体的有效的佐剂制剂。此外，本公开内容提供了可在环境温度下物理稳定的并适合于冷冻干燥，因此消除了对冷链存储的需要的疫苗和递送制剂。此外，菊糖乙酸酯是新颖的TLR激动剂并且当配制为颗粒时刺激免疫系统。本文中提供了使说明书CN104203218A1412/28页15用INAC作为疫苗佐剂的许多其他优势的一些。0095本。
47、公开内容以下提供了菊糖的水溶性多晶型物IN的纳米颗粒和微粒制剂和其合成的衍生物菊糖乙酸酯INAC的制备以及这些制剂作为免疫增强剂的用途的详情。卵白蛋白OVA可被用作模式抗原。包含OVA的IN或INAC微粒可由双乳液溶剂蒸发方法来制备。体外释放研究显示，大多数掺入的OVA95分别由IN颗粒和INAC颗粒在16小时和528小时22天内释放。0096小鼠中免疫研究显示，包封在IN微粒中的OVA比未包封游离的OVA产生更强的抗体应答仅TH2型。与使用明矾FDA批准的唯一佐剂作为佐剂的组相比，该结果在应答的类型上相似并且在强度上更大。例如，应答的强度可高达明矾作为佐剂的组的应答的强度的约4倍、或约2至约。
48、4倍。然而，包含OVA的INAC微粒比结合了明矾的OVA产生显著更高的抗体应答。0097例如，在接受包含OVA的INAC微粒的小鼠中的总IGG应答比接受明矾结合的OVA的小鼠中的大多达约90倍。另外，在接受包含OVA的INAC微粒的小鼠中的IGG1应答比接受明矾结合的OVA的小鼠中的大多达约75倍。此外，在接受包含OVA的INAC微粒的小鼠中的IGG2A应答比接受明矾结合的OVA的小鼠中的大多达约1200倍。因此，装载OVA的INAC颗粒可比其他结合至OVA的佐剂产生显著更高的抗体应答。例如，装载OVA的INAC颗粒可比明矾结合的OVA产生如以下显著更高的滴度总IGG至少约5100倍更高、至少。
49、约10150倍更高、或至少约10200倍更高；IGGL至少约10100倍更高、至少约1585倍更高、或至少约2080倍更高；以及IGG2A至少约21500倍更高、至少约1001500倍更高、或至少约5001500倍更高。0098显著地，INAC微粒产生TH1型和TH2型两种免疫应答，这是现代疫苗递送技术中需要的。公开的实施例由皮内ID途径进行的事实进一步强调了INAC颗粒在疫苗递送技术，诸如微针，或者使用ID途径的其他递送方法中作为佐剂的潜在用途。0099本公开内容还显示了可通过调节剂量、粒径纳米与微米和施用途径进行操作的免疫应答的程度。不同大小的INAC颗粒可通过使用缓冲液、表面活性剂、溶剂和其他赋形剂的选择组合来制备。由于其免疫刺激效应，这些多个制剂具有广泛用途的潜能。本文描述的组合物可被用于提供具有显著高细胞和体液的免疫应答特性和改进的安全特性的新颖和成本有效的疫苗佐剂。0100本文描述的佐剂制剂比明矾作为佐剂提供更强的免疫应答。本发明的佐剂制剂刺激体液介导的免疫TH2；对于胞外病原体和细胞介导的免疫TH1；对于胞内病原体两者的产生，这是比其他佐剂，包括明矾，显著有益的。此外，在常规冷冻干燥和冷冻时。