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1、10申请公布号CN104244730A43申请公布日20141224CN104244730A21申请号201380020455322申请日2013041812164765520120419EPA23K1/16200601A23K1/1820060171申请人因特奎姆私人控股公司地址西班牙巴塞罗纳72发明人J巴尔塞尔斯特雷斯FJ克雷斯波蒙特罗74专利代理机构中国国际贸易促进委员会专利商标事务所11038代理人王贵杰54发明名称用于减少反刍动物甲烷生成的饲料组合物57摘要本发明涉及用于减少反刍动物中甲烷产生的方法，所述方法包括对所述反刍动物施用包含黄烷酮糖苷的饲料组合物。30优先权数据85PCT国。
2、际申请进入国家阶段日2014101786PCT国际申请的申请数据PCT/EP2013/0581132013041887PCT国际申请的公布数据WO2013/156574EN2013102451INTCL权利要求书1页说明书15页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书15页附图1页10申请公布号CN104244730ACN104244730A1/1页21用于减少反刍动物中甲烷产生的方法，包括通过口服给所述反刍动物施用包含黄烷酮糖苷的饲料组合物，所述黄烷酮糖苷选自新橙皮苷、异柚皮苷、枸橘苷和橙皮苷或其混合物。2权利要求1的方法，其中所述饲料组合物是包含新橙皮苷。
3、和枸橘苷的混合物。3权利要求2的方法，其中所述混合物还包含柚皮苷。4权利要求13任一项的方法，其中所述混合物是天然植物提取物。5权利要求4的方法，其中所述植物提取物是柑橘属植物提取物。6权利要求15任一项的方法，其中所述组合物还包含载体。7权利要求16任一项的方法，其中所述组合物是混合物，其包含2555WT的柚皮苷、1020WT的新橙皮苷、15WT的枸橘苷和足量至100WT的载体。8权利要求7的方法，其中所述组合物包含4050WT的柚皮苷、1115WT的新橙皮苷、35的枸橘苷和足量至100WT的载体。9权利要求68任一项的方法，其中所述载体是海泡石。10权利要求19任一项的方法，其中所述反刍动。
4、物是小牛、母牛、水牛、绵羊、鹿、骆驼或山羊。11权利要求10的方法，其中所述反刍动物是小牛。12权利要求111任一项的方法，其中将所述组合物以固体形式加入到饲料中，其浓度为501000MG/KG干物质。13权利要求12的方法，其中将所述组合物以固体形式加入到饲料中，其浓度为200500MG/KG干物质。权利要求书CN104244730A1/15页3用于减少反刍动物甲烷生成的饲料组合物发明领域0001本发明涉及用于减少反刍动物甲烷生成的新组合物。0002发明背景0003甲烷、二氧化碳和氧化亚氮是具有温室效应的主要气体。0004甲烷CH4是温室气体，其大气浓度在最近的世纪内显著地增加，并且是二氧化。
5、碳之后地球变暖的最大潜在贡献者。对流层效应甲烷水平的增加与人口的全球扩张紧密相关。因此，认为约70的甲烷发出与人类活动相关。废物的陆地填充和农业实践生成甲烷并且将其释放在大气中，其量因世界人口数量的增长而增加。0005反刍动物包括牛CATTLE、水牛BUFFALO、绵羊和山羊具有大前胃，其中发生产生甲烷的发酵。瘤胃消化道由4个胃的隔室构成瘤胃、网胃、皱胃和重瓣胃。它们中最大且最重要的是瘤胃。瘤胃作为发酵隔室起作用。它包含庞大的微生物群体，包括产生甲烷的古细菌，它们分解植物材料。所述微生物通常称作产甲烷菌。古细菌群体利用氢和二氧化碳，即厌氧微生物发酵产物，生成用于生长的能量，从而产生作为终产物的。
6、甲烷。最终，甲烷通过打嗝从瘤胃中放出。0006牛和绵羊产生甲烷代表了降低生产力的碳损耗途径。如果通过甲烷合成损耗的能量可以通过其它生化途径被改道而通常至丙酸合成，则瘤胃发酵可以变得更为有效且可以在动物体重增长或产奶改善方面反映出来。它对生产者而言是成本有效的且提供减少甲烷放出至大气中的有效工具。实际上，因为甲烷在大气中的寿命是12年而二氧化碳和氧化亚氮的寿命分别是100年和120年，所以减少甲烷放出可以对环境具有越来越快速的影响。0007过去使用反刍动物的研究已经证实甲烷产生受膳食影响。通过增加结构/非结构纤维质/淀粉性碳水化合物之比，甲烷放出增加。此外，将脂质源添加到膳食中减少了肠甲烷放出。。
7、尽管与甲烷减少平行，但是高脂肪补充比例减少了瘤胃微生物发酵、饲料摄入和纤维可消化性。大量化学饲料添加剂例如抗生素即离子载体或杀虫剂被导入反刍动物营养物以促进生长，改善饲料利用率和减少甲烷产生。然而，对于动物产品中存在化学残留物和细菌对抗生素的耐药性的发生的担忧已经刺激了寻找更为安全的天然替代品，它们可以用于有机的畜牧场。0008已经证实包含精油、单宁类、皂苷类、类黄酮和许多其它植物次级代谢产物的植物或植物提取物改善瘤胃代谢靶向特异性类型的瘤胃微生物群体。PATRAAAK和SAXENABJ2010、PHYTOCHEMISTRY,7111121198222描述了植物次级代谢产物在抑制瘤胃中甲烷生成。
8、中的应用。对比文件WO2005000035涉及增强瘤胃发酵、特别是减少甲烷生成的方法，由施用从新鲜紫花苜蓿中得到的可溶性紫花苜蓿提取物组成。0009因此，对于包含天然来源的化合物且有效地减少甲烷产生和安全地用于畜牧场的可替代反刍动物饲料组合物存在需求。0010发明概述0011本发明的作者目前已经发现，通过给反刍动物施用包含天然化合物的饲料组合说明书CN104244730A2/15页4物，显著地减少了甲烷放出。0012因此，在一个方面中，本发明涉及减少反刍动物中甲烷产生的方法，所述方法包括通过口服给所述反刍动物施用包含黄烷酮糖苷的饲料组合物，所述黄烷酮糖苷选自新橙皮苷、异柚皮苷、枸橘苷和橙皮苷或。
9、其混合物。0013在本发明的一个具体的实施方案中，所述组合物是包含新橙皮苷和枸橘苷的混合物。在一个更具体的实施方案中，所述混合物还包含柚皮苷。在一个优选的实施方案中，所述混合物是天然植物提取物。在一个更优选的实施方案中，所述植物是柑橘属植物提取物。0014在本发明的一个具体的实施方案中，所述组合物还包含载体。在一个优选的实施方案中，所述载体是海泡石。0015在一个具体的实施方案中，所述组合物是混合物，其包含2555WT的柚皮苷、1020WT的新橙皮苷、15WT的枸橘苷和足量至100WT的载体。在一个优选的实施方案中，所述组合物包含4050WT的柚皮苷、1115WT的新橙皮苷、35的枸橘苷和足量。
10、至100WT的载体。0016在本发明的一个具体的实施方案中，所述反刍动物是小牛CALF、母牛COW、水牛、绵羊、鹿或山羊。在一个优选的实施方案中，所述反刍动物是小牛。0017在一个具体的实施方案中，将本发明的组合物以501000MG/KGDM浓度的固体形式加入到饲料中。在一个优选的实施方案中，以200500MG/KGDM的浓度加入所述组合物。0018附图简述0019图1表示生物气和甲烷产生的分布图。平均值使用应用未补充定量对照品或补充不同类型的类黄酮得到的“体外”模拟系统中的剂量。0020发明详述0021如上所述，本发明的作者已经发现，通过给反刍动物施用包含类黄酮、特别是黄烷酮糖苷类的饲料组合。
11、物，显著地减少了甲烷放出。0022因此，在一个方面中，本发明涉及用于减少反刍动物中甲烷产生的方法，所述方法包括通过口服给所述反刍动物施用包含黄烷酮糖苷的饲料组合物，所述黄烷酮糖苷选自新橙皮苷、异柚皮苷、枸橘苷和橙皮苷或其混合物。0023本文所用的术语“反刍动物”是指任意反刍亚目RUMINANTIA的偶蹄哺乳动物。所述哺乳动物咀嚼反刍食物并且具有4个隔室的胃，其中之一是瘤胃。该类型包括鹿、羚羊、水牛、牛、绵羊、骆驼和山羊。0024本文所用的术语“类黄酮”是指一类在花瓣上产生黄色或红色/蓝色色素沉着的水溶性植物色素。术语“黄烷酮类”是指一种类型的类黄酮。黄烷酮类一般地被7位上的二糖糖基化，得到“黄。
12、烷酮糖苷类”。0025正如下列实施例中所示，发明人已经令人意外地发现，通过给反刍动物施用本发明的饲料组合物显著地减少了甲烷放出。0026可以使用本领域众所周知的方法测定反刍动物的甲烷产量。例如，六氟化硫SF6示踪法是一种技术，其能够使用围绕在母牛颈部的连续对呼气采样的抽成真空的金属气体采样罐测定来自母牛个体的甲烷。其它方法包括开路呼吸室，它们是密封的，和气候控制室，其中居留单个母牛，从而允许分析该动物产生的所有气体。说明书CN104244730A3/15页50027还可以通过红外光谱法、气相色谱法、质谱法和可调谐的激光二极管技术、基于饲料特征的发酵平衡的附件技术例如呼吸测热法预测方程、同位素示。
13、踪物技术等测定放出的甲烷。0028此外，可以在“体外”测定甲烷产量。在这种情况中，从动物中采集瘤胃流体并且在厌氧条件下使用温育培养基温育。0029在本发明的一个具体的实施方案中，所述组合物是包含新橙皮苷和枸橘苷的混合物。在一个更具体的实施方案中，所述混合物包含新橙皮苷、枸橘苷和柚皮苷。在本发明另一个具体的实施方案中，所述混合物是天然植物提取物的形式。在一个优选的实施方案中，所述植物提取物是柑橘属植物提取物且更优选苦橙BITTERORANGE植物提取物，所述提取物包含不同的类黄酮，特别是黄烷酮类糖苷类。在一个优选的实施方案中，所述植物提取物包含新橙皮苷、枸橘苷和柚皮苷的混合物。正如下列实施例中所。
14、示，所述植物提取物是天然植物提取物，其包含约20WT的柚皮苷和40WT的苦橙提取物2527柚皮苷；1113新橙皮苷和35枸橘苷。在具体情况中，所述天然植物提取物是商购的。0030因此，根据本发明，本发明组合物的黄烷酮类可以得自植物，更具体地，得自柑橘属植物。0031本发明组合物中的所有成分是天然来源的且易于得到的产物。此外，如果该组合物是混合物形式，所述混合物易于操作且可以根据本领域专业人员公知的工业化配制方法制备。0032本文所用的术语“柑橘CITRUS”是指柑橘属植物。所述柑橘属植物的实例包括文旦CITRUSMAXIMA柚、枸橼CITRUSMEDICA枸橼、桔CITRUSRETICULAT。
15、E橘子、酸橙CITRUSAURANTIUM苦橙、波斯青柠CITRUSLATIFOLIA波斯青柠、柠檬CITRUSLIMON柠檬、葡萄柚CITRUSPARADISI葡萄柚、甜橙CITRUSSINENSIS甜橙、枳CITRUSTRIFOLIATA枳等。0033用于从植物中分离类黄酮的方法是本领域众所周知的。在具体的情况中，可以由本领域技术人员通过提取、过滤、浓缩、沉淀、净化和最终干燥这样的常规方法从磨碎的柑橘类果实尤其是酸橙中得到苦橙提取物。提取过程可以在二元醇/水系统中进行，其中所述醇选自甲醇、乙醇、丙醇等。优选使用甲醇。作为可替代的非限制性实例，用300ML甲醇提取50G干燥的苦橙。离心该混悬。
16、液以分离残余物，并且真空浓缩母液至最终体积为50ML。在5天过程中在室温下静置得到的液体，过滤以分离不溶物，再次通过硅藻土床过滤，并且喷雾干燥。0034在一个具体的实施方案中，所述黄烷酮可以得自柑橘类植物的果实。例如，柚皮苷是得自一些柠檬的果实例如葡萄柚和苦橙酸橙果皮的糖基化的黄烷酮。它还在果实的果肉和植物的叶、花和种子中被发现。本发明用于分离类黄酮的示例性、非限制性方法是，例如描述在对比文件US2421063A和US2421062A中的那些方法，其中描述了从植物材料中回收柚皮苷的方法，此外，可以根据对比文件US2442110A、US2348215A和US2400693A中所述的方法得到橙皮苷。
17、。同样，可以柑橘对比文件US3375242A中所述的方法得到新橙皮苷。US3375242A描述了用于生产新橙皮苷的方法，其中使柚皮苷与异香草醛反应，产生新橙皮苷查耳酮。然后使该查耳酮环化，得到新橙皮苷。说明书CN104244730A4/15页60035另外，易于得到本发明组合物的黄烷酮类，因为它们是商购的。例如，正如本发明附带的实施例中所示，异柚皮苷、NEOERITROCIN和枸橘苷购自INDOFINECHEMICALCOMPANY,INCUSA。此外，如上所述，本发明所述的天然植物提取物是商购的。0036在本发明的一个具体的实施方案中，所述组合物是混合物，其包含2555WT的柚皮苷、1020。
18、WT的新橙皮苷、15WT的枸橘苷和足量至100WT的载体。在一个更具体的实施方案中，所述组合物包含4050WT的柚皮苷、1115WT的新橙皮苷、35的枸橘苷和足量至100WT的载体。0037根据本发明的另一个优选的实施方案，所述组合物包含载体。在一个具体的实施方案中，所述载体是海泡石。海泡石是沉淀来源的天然存在的粘土矿物。它是不可溶胀的、轻质的、多孔性的粘土，其具有大的比表面积。在化学上，海泡石是含水硅酸镁，其颗粒各自具有针状形态。这种粘土的高表面积和多孔性说明了它对于液体的显著的吸收力。这些特性使得它成为广泛应用的有价值的材料，例如宠物垃圾、动物饲料添加剂、载体、吸收剂、助悬和触变添加剂和增。
19、稠剂。0038根据本发明的方法，当给动物饲喂本发明包含天然来源的类黄酮的组合物时，减少了反刍动物中的甲烷放出/产生。饲喂效率在饲养业中具有经济关联。已知抑制反刍动物中甲烷生成的化合物导致瘤胃发酵转移至产生更期望的脂肪酸分布，从而增加丙酸而不是乙酸的比例，由此瘤胃富有活力的发酵变得更有效参见美国专利号US3,745,221；US3,615,649；和US3,862,333。因此，本发明的另一个目的在于提供用于抑制反刍动物中甲烷生成的方法，其对增加饲料利用效率的瘤胃微生物发酵产生有益效果。正如下列实施例中所示，本发明的组合物降低了产生的甲烷水平并且转变成有利于丙酸的挥发性脂肪酸产生。0039用于测。
20、定挥发性脂肪酸的方法是本领域众所周知的。典型地，使用色谱方法，例如HPLC或带有火焰离子化检测的气相色谱法。0040饲喂方式不限于任意具体的方式且可以在化合物饲料上添加顶肥得到本发明的饲料组合物，或在将本发明的饲料组合物与化合物饲料混合后饲喂。此外，对于饲喂的量没有限制，只要有效地减少甲烷生成，同时营养平衡不受不良影响。0041因此，在本发明的一个优选的实施方案中，将所述组合物以固体形式添加到饲料中。在一个具体的实施方案中，以501000MG/KGDM干物质的浓度添加所述组合物。在一个更具体的实施方案中，以200500MG/KGDM浓度的固体形式添加所述组合物。0042本发明的组合物可以包含其。
21、它饲料成分，例如维生素、酶、无机盐、谷物粉、包含蛋白质的成分、包含碳水化合物的成分、小麦粗粉和/或麦麸。0043本发明的饲料组合物的形状不限于任意具体形式且可以是任意常规的饲料组合物形式，例如粉末和颗粒。此外，可以根据用于生产化合物饲料和饲料补充剂的一般使用的方法生产所述饲料组合物。0044在本发明的一个具体的实施方案中，所述反刍动物是小牛、母牛、水牛、绵羊、鹿、骆驼或山羊。在一个优选的实施方案中，所述反刍动物是小牛。0045现在参照下列实施例更详细地描述本发明，这些实施例决不以预以限定本发明的范围。说明书CN104244730A5/15页7实施例0046材料和方法0047使用基于THEODO。
22、ROUMK等人1994ANIMALFEEDSCIENCEANDTECHNOLOGY,483,P185197；MAURICIO,RM等人1999ANIMALFEEDSCIENCEANDTECHNOLOGY79,321330所述的实验方案，设计按照相同实验方案的两种试验以研究不同的纯类黄酮对瘤胃的影响。0048由半自动压力计测定气体产量，预先计算压力水平与产生的气体体积之间的相关性。0049将接受主要由浓缩物组成9010的混合定量的瘤胃插套管的小牛用作瘤胃的流体供体；饲料组成如表1中所示。采集接种物并且通过双层外科手术用纱布过滤，且保存在恒温罐中。一式三份用预加热的瓶39施用类黄酮表2600MG浓。
23、缩物表1和作为底物的60MG大麦麦杆并且维持在厌氧条件下。类黄酮异柚皮苷、NEOERITROCIN、枸橘苷购自INDOFINECHEMICALCOMPANY,INCUSA。将10ML瘤胃流体和40ML温育培养基加入到瓶中MCDOUGALL,EI1948STUDIESONRUMINANTSALIVA1THECOMPOSITIONANDOUTPUTOFSHEEPSSALIVABIOCHEMJ43199109。一旦瓶充满且施加厌氧条件，则密封瓶并且在热水浴中启动温育过程。在2、4、6、8、12、24、36和48小时进行压力读取。一式三份，分两组或两批温育每种样品。0050表1浓缩物的化学组成0051。
24、说明书CN104244730A6/15页80052CP粗蛋白；NDF中性洗涤剂纤维；DM干物质，ME可代谢的能量005320WT柚皮苷；40WT苦橙提取物；海泡石至100WT。0054表2用于第一次和第二次实验的类黄酮剂量MG/KGDM0055说明书CN104244730A7/15页90056柑橘类植物生物类黄酮复合物005712小时温育后，打开来自每次处理的1个瓶子重复，读取PH并且对瓶子采样用于挥发性脂肪酸JOUANY,JP,1982SCIENCEDESALIMENTS2,131144、乳酸TAYLOR,KACC,1996APPLBIOCHEMBIOTECHNOLENZYMENGBIOTE。
25、CHNOL56,4958和氨CHANEY,AL,MARBACH,EP,1962CLINCHEM8,130132分析。0058使用YU和MORRISON2004提出的技术提取环境DNA。通过QPCR、使用特异性引物对牛链球菌STREPTOCOCCUSBOVIS、埃氏巨球形菌MEGASPHAERAELSDENII和反刍动物月形单胞菌SELENOMONASRUMINANTIUMDNA进行定量TAJIMA,K等人2001APPLENVIRONMICROB67,27662774；OUWERKERK,D等人2002JAPPLMICROBIOL92,753758。使用SAS统计软件包的PROCMIXED程序。
26、SAS,2000,USERSGUIDESTATISTICS,第8版INST,INC,CARY,NC对结果进行统计学分析。最小显著差异用于比较平均值。将其中P005，柚皮苷没有改变P005，而其余的多酚类降低了平均产生水平P005。氨水平超过了阈值水平，以确保适当的微生物发酵50MG/L。显然，新北美圣草苷22784MG/L和BIOFLAVEX混合物20992MG/L分别显示最高和最低的平均值。0101起始VFA浓度在T0记录的恒定值增加。在012H之间的增加高于1272H之间记录的值，这反映出在温育时间过程中逐步的底物发酵即在第一个期限012小时内平均VFA浓度MMOL/L增加为21MMOL/。
27、小时，而在该期限后，这些增加降至平均值为02MMOL/小时。根据矿物混合物的缓冲活性，VFA浓度的增加未反映在培养基酸度的增加中。平均PH值在0、12和72小时分别为681、67700034Y67300033。根据严格的平均值的标准误差证实培养基的稳定性。010222VFA的摩尔比0103使用碳水化合物源主要由淀粉组成；即浓缩物进行培养基补充导VFA分布显著改变，这导致丙酸2003、2820和2645和丁酸在0、12和72小时分别为907、988和1045比例增加，而观察到乙酸比例减少MOL/100MOL；625、5586和5586。然而，增加在不同类黄酮类型中并不是均匀的。培养基中的丙酸比例。
28、因柚皮苷、异柚皮苷、枸橘苷、BIOFLAVEX混合物和新橙皮苷而比对照品改善，但是其余的未改变。应注意在新橙皮苷、柚皮苷和BIOFLAVEX中，对温育时间的响应还显著地受剂量调节DXHP0009。一般而言，观察到甲烷产生表5与丙酸比例表9之间的负相关，包含新北美圣草苷增加了甲烷比例，而在新橙皮苷和BIOFLAVEX的情况中相反的结果是确切的，它们显然抑制甲烷放出对于新橙皮苷、BIOFLAVEX和对照品分别为1370和1366与1458，从而改善了丙酸的比例对于新橙皮苷、BIOFLAVEX与对照品和NEOERITROCIN丙酸比例分别为257和258与244P01和237P005。0104表8未。
29、补充对照品或补充不同类型和剂量的类黄酮的“体外”瘤胃流体培养物中挥发性脂肪酸浓度VFA；MMOL/L和氨NNH3；MG/L。0105说明书CN104244730A1413/15页1501061SEM平均值的标准误差01072剂量02G/KGDMY05G/KGDM底物0108P005，P001，P0001和NS无显著性0109具有不同指数的平均值A、B、C、D表示这些平均值之间的显著性差异P005。0110说明书CN104244730A1514/15页16011121乳酸浓度和微生物分布。0112瘤胃内乳酸浓度与酸中毒功能障碍之间的相关性已经通过实验加以证实。得自温说明书CN104244730A。
30、1615/15页17育12小时的瓶的乳酸浓度值和产生乳酸牛链球菌SBOVIS或消耗反刍动物月形单胞菌SRUMINANTIUM和埃氏巨球形菌MELSDENII的细菌滴度如表10中所示。0113使用不同类黄酮对乳酸浓度的作用是适度的且仅存在的新橙皮苷、橙皮苷和BIOFLAVEX倾向于缓解温育期限中记录的增加CT02216MG/L。预先描述的发酵条件的变化表8和9导致微生物DNA浓度增加，不过，当对比对照品、新北美圣草苷、枸橘苷和橙皮苷滴度时，增加仅在新橙皮苷的情况中达到统计学显著性。本实验处理未改变牛链球菌和反刍动物月形单胞菌滴度，然而，根据从前述实验中得到的结果，与记录的对照值相比，新橙皮苷和BIOFLAVEX混合物均改善了记录的埃氏巨球形菌滴度。0114表10通过QPCR测定的类黄酮在乳酸浓度和细菌DNA浓度MG/ML中的作用和未补充对照品或补充不同类型和剂量的类黄酮的“体外”瘤胃流体培养物中在12小时温育时的反刍动物月形单胞菌、牛链球菌和埃氏巨球形菌瘤胃群体的相对定量。011501161SEM平均值的标准误差0117P005，P001，P0001和NS无显著性0118具有不同指数的平均值A、B、C、D表示这些平均值之间的显著性差异P005。说明书CN104244730A171/1页18图1说明书附图CN104244730A18。