凝血酶试剂以及检查试剂套装 【技术领域】
本发明涉及稳定的含有凝血酶的组成物(凝血酶试剂)及其检查试剂套装。更具体地说，涉及在临床医学，特别是纤维蛋白原定量领域使用的稳定的凝血酶试剂及其检查试剂套装。
背景技术
将纤维蛋白原转化为纤维蛋白的酵素凝血酶，在血液凝固反应过程中起了非常重要的作用。在临床检查领域，由于使用凝血酶测定纤维蛋白原的浓度，凝血酶阻害物质的活性，例如抗凝血酶活性、水蛭素活性，并进一步测定化学合成阻碍剂的活性而被广泛使用。
但是，由于一般情况下凝血酶并不稳定，需要长期保存时，通常进行冻结干燥处理再保存。另外，迄今为止，人们做了使凝血酶稳定的多种尝试，如下述文献所述：
日本专利公开昭和56年-39782号公报
日本专利公开昭和56年-68607号公报
日本专利公开昭和60年-112721号公报
日本专利公开昭和63年-192723号公报
日本专利公开昭和64年-40433号公报
日本专利公开平成1年-93536号公报
日本专利公开平成2年-53732号公报
日本专利公开平成4年-320683号公报
日本专利公开平成7年-33799号公报
日本专利公开平成7年-165604号公报
日本专利公开平成9年-328436号公报
日本专利公开平成10年-52267号公报
日本专利公告昭和58年-26956号公报
日本专利公告平成3年-76292号公报
日本专利公告平成7年-64747号公报
日本专利公告平成8年-13750号公报
但是，这些中的任何一项作为凝血酶的稳定方法都不够完美，特别是作为临床检查诊断药使用，还没有表现出足够的稳定性。
【发明内容】
本发明的目地在于，提供稳定的含有凝血酶的组成物(凝血酶试剂)及其检查试剂套装。
本发明的发明者们认真反复研究，结果，注意到凝血酶由于自身的分解而不稳定这一事实，通过适量添加具有抗凝血酶活性作用的阻害剂的方式来安定凝血酶，并看到了效果。并且，如果与其他的稳定剂并用，效果会更好。在发现这些的基础上，他们完成了本发明。
本发明提供了一种含有凝血酶和具有抗凝血酶作用的阻害剂的检查试剂。
较佳的，上述的阻害剂是一种具有抗凝血酶作用的蛋白酶拮抗剂。
较佳的，上述的阻害剂是选自：苯甲脒、p-氨基苯甲脒、m-氨基苯甲脒、苯胍、阿加曲班、加贝脂、甲磺酸萘莫司他中的一种或多种。
较佳的，上述的阻害剂是苯甲脒或其诱导体。
较佳的，上述的检查试剂含有所述的阻害剂0.1～30mM。
较佳的，上述的检查试剂含有凝血酶10～500U/mL。
较佳的，上述的检查试剂含有钙离子、有机酸、表面活性剂、以及蛋白质中的一种或两种以上的、具有安定凝血酶功能的化合物。
较佳的，上述的检查试剂为凝固功能检查试剂。
较佳的，上述的功能检查试剂为纤维蛋白原定量试剂。
本发明还提供了一种含有检体稀释用的缓冲液与凝血酶试剂的检查试剂套装，该检查试剂套装含有凝血酶和具有抗凝血酶作用的阻害剂。
较佳的，上述的阻害剂是具有抗凝血酶作用的蛋白酶拮抗剂。
较佳的，上述的阻害剂是选自苯甲脒、p-氨基苯甲脒、m-氨基苯甲脒、苯胍、阿加曲班、加贝脂、甲磺酸萘莫司他的一种以上阻害剂。
较佳的，上述的阻害剂是苯甲脒或其诱导体。
较佳的，上述的阻害剂含量为0.1～30mM。
较佳的，上述的凝血酶含量10～500U/mL。
较佳的，上述的凝血酶试剂含有钙离子、有机酸、表面活性剂、以及蛋白质中的一种或两种以上的、具有安定凝血酶功能化合物。
较佳的，上述的检查试剂套装是凝固功能检查试剂套装。
较佳的，上述的凝固功能检查试剂套装是纤维蛋白原定量试剂套装中的检查试剂套装。
【附图说明】
图1：在制备的、凝血酶活性为200U/mL的溶液中添加各浓度苯甲脒时的稳定效果(实施例1)。
图2：在制备的、凝血酶活性为100U/mL的溶液中添加各浓度苯甲脒时的稳定效果(实施例2)。
图3：在含有各浓度的凝血酶的溶液中添加苯甲脒时的稳定效果(实施例3)。
图4：在制备的、凝血酶活性为100U/mL的溶液中，添加含有0、0.1～30.0mM苯甲脒的苯甲脒氯酸盐时的稳定效果。
图5：在制备的、凝血酶活性为200U/mL的溶液中，添加含有0、0.1～30.0mM苯甲脒的苯甲脒氯酸盐时的稳定效果。
符号说明
No.1：凝血酶的活性为200U/mL，没有添加苯甲脒
No.2：凝血酶的活性为200U/mL，添加苯甲脒5mM
No.3：凝血酶的活性为200U/mL，添加苯甲脒10mM
No.4：凝血酶的活性为100U/mL，没有添加苯甲脒
No.5：凝血酶的活性为100U/mL，添加苯甲脒2.5mM
No.6：凝血酶的活性为100U/mL，添加苯甲脒5mM
【具体实施方式】
本发明中检查试剂(凝血酶试剂)所含的“凝血酶”无论是来自动物、人类血浆，还是使用基因工学手法制备的都可以。凝血酶试剂无论是液状品、冻结品，还是干燥品都可以，制剂过程中所含的凝血酶含量，调整到达到激发其活性目的的活性值就好，并没有特殊限定。
在本发明中，所谓的具有抗凝血酶作用的“阻害剂”，可以举具有抗凝血酶作用的蛋白酶拮抗剂为例，具体的可以举苯甲脒(盐酸盐)、p-氨基苯甲脒、m-氨基苯甲脒、苯胍、阿加曲班、加贝脂、甲磺酸萘莫司他为例，苯甲脒及其诱导体尤为合适。
使凝血酶试剂中含有阻害剂0.1～30mM，较理想的是0.1～20mM，更理想的是2.5～15mM。凝血酶试剂中所含凝血酶浓度并没有特殊限定，从实用角度来说，一般使用活性为10～500U/m的，较理想的是活性为50～200U/mL的。
作为稳定剂的上述阻害剂既可以单独使用，也可以与其他众所周知的稳定剂结合使用。可结合使用的其它稳定剂并没有特殊限定，例如，可以使用钙离子、有机酸、界面活性剂、蛋白质等。
钙离子的具体例子，可以列举乳酸钙、葡糖酸钙、葡糖醛酸钙、酒石酸钙等水溶性钙化合物。可以选择这些钙化合物的一种或两种以上结合使用。钙化合物的含量并没有特殊限定，只要能使钙化合物对凝血酶的稳定作用发挥出来即可，例如，凝血酶试剂中的浓度只要在5mM～100mM之间就可以，比较理想的是10mM～50mM。
有机酸的具体例子可以举出甲酸、醋酸、丙酸、酪酸、吉草酸、草酸、丙二酸、琥珀油、葡糖酸、乳酸、葡糖醛酸、甘氨胆酸、酒石酸、苹果酸、柠檬油、酒石酸、戊二酸、氨基醋酸、己酸等。使用这些有机酸的游离酸或有机酸盐都可以。并且，可以选择一种或两种以上结合使用。
有机酸的添加量并没有特殊限定，只要能使有机酸对凝血酶的稳定作用发挥出来即可，例如，凝血酶试剂中的浓度只要在5mM～100mM之间就可以，比较理想的是10mM～50mM。
界面活性剂的具体例子，可以举出阴离子界面活性剂中的十二烷基硫酸钠、十二烷基磺酸钠、十二烷基-N-肌氨酸钠、胆汁酸钠、脱氧胆酸钠、牛磺去氧胆酸钠等；阳离子界面活性剂有十六烷基三甲基溴化铵、十四烷基铵溴化物、十二烷基吡啶氯化物等；两性离子界面活性剂有CHAPS、CHAPSO、棕榈卵磷脂、十二烷基-N-三甲铵基乙内盐、十二烷基-β-丙氨酸等；非离子界面活性剂有异辛酸葡糖甙酶、肽酰2-硫基乙醇、癸酰基-N-甲基甘氨酸氧化酶、聚氧乙烯十二烷酸酯、聚氧乙烯七甲基己基乙醚、聚氧乙烯异烯烃苯酚乙醚(ToraitonX系列)、聚氧乙烯壬基酚乙醚、聚氧乙烯脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酯(Tween系列)。
在这些界面活性剂中，使用非离子界面活性剂效果特别好。另外，也可以在这些界面活性剂中选择一种或两种以上结合使用。
界面活性剂的添加量并没有特殊限定，只要能使界面活性剂对凝血酶的稳定作用发挥出来即可。举例来说，使用时在凝血酶试剂中的浓度为0.001～1％(重量/容量)即可，比较理想的是0.005～0.1％(重量/容量)。
蛋白质的具体例子，可以举出清蛋白、凝胶、球蛋白，可在上述蛋白质中选择一种或两种以上结合使用。
蛋白质的添加量并没有特殊限定，只要能使蛋白质对凝血酶的稳定作用发挥出来即可。举例来说，使用时在凝血酶试剂中的浓度为0.05～10％(重量/容量)即可，比较理想的是0.1～5％(重量/容量)。
选择使用上述用于凝血酶稳定的阻害剂以及其他的稳定剂时，要考虑到凝血酶处于溶液状态保存、干燥状态保存、冻结状态保存以及干燥品溶解、冻结品融解时对凝血酶酵素活性的影响。并且，无论是单独使用阻害剂，还是与其它稳定剂并用，都需要进行调整，使凝血酶液状品中含有上述药剂，在干燥品或冻结品最终变成液态时也含有上述药剂，发挥其稳定作用。
本发明的“凝血酶试剂”，在凝血酶中，多少会含有上述阻害剂。另外，除了添加这些阻害剂外，还可以从缓冲剂、具有凝血酶稳定功能的其它稳定剂，以及为了为了发挥测定再现性而添加的高分子多糖类，和合成高分子类中选择一种或两种以上并用。
缓冲剂适宜选择pH值在4～9范围内、具有缓冲功能的。例如，可以从柠檬酸、磷酸、醋酸、咪唑、GTA、HEPES、MOPS、BIS-TRIS、TRIS、MOPSO、ADA、MES等中选择一种或两种以上并用。这些缓冲机的添加量，并没有特殊限定，只要能使其缓冲机缓冲作用发挥出来即可。举例来说，在凝血酶试剂中的浓度在5～1000mM即可，比较理想的是50～500mM。
高分子多糖类的具体例子可以举出葡聚糖40、葡聚糖70、葡聚糖200,000、葡聚糖500,000、フィコ一ル等。另外，可以从这些高分子多糖类中选择一种或两种以上并用。高分子多糖类的添加量并没有特殊限定，只要能发挥其再现性即可。举例来说，在凝血酶试剂中的浓度为0.1～10％(重量/容量)即可，比较理想的是0.3～3％(重量/容量)。
作为合成高分子类的具体例子，可以举出聚乙烯醇500、聚乙烯醇1500、聚乙烯醇2000、聚乙二醇1500、聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇ル6000、聚乙二醇8000、聚乙二醇20000以及聚乙烯吡咯烷酮等。另外，可以从这些合成高分子类中选择一种或两种以上结合使用。合成高分子类的添加量并没有特殊限定，只要能发挥其再现性即可。举例来说，在凝血酶试剂中的浓度为0.1～10％(重量/容量)即可，比较理想的是0.3～3％(重量/容量)。
另外，凝血酶试剂是液状品、冻结品或干燥品皆可，特别是在干燥品中添加精致水或/和缓冲液，使之溶解，效果尤为理想。
另外，也可以在凝血酶试剂中添加适当的防腐剂。防腐剂可以从卷须霉素、丙酸或安息香酸钠等中选择一种或两种以上结合使用。根据需要，也可使用含有氯化钠等盐和氨基酸糖等一般稳定剂的物质。
上文记载的浓度，是在溶液品中，或在使用干燥品等溶解时的浓度。
检查试剂套装或多或少地含有稀释检体以及标准液的检体稀释用缓冲液以及上述凝血酶试剂。作为检体稀释用缓冲液，可以列举出MES、Bis-Tris、ADA、PIPES、ACES、MOPSO、BES、MOPS、TES、HEPES、DIPSO、TAPSO、POPSO、HEPPSO、EPPS、Tricine、Bicine、TAPS、CHES、CAPSO、CAPS等优质缓冲液、巴比妥酸缓冲剂。
本发明的检查试剂以及检查试剂套装可以作为凝固功能检查试剂，特别是纤维蛋白原定量试剂使用。具体地说，是将标注液稀释成为5倍、10倍、20倍(稀释倍数可作适当调整)的检体稀释用缓冲液。然后，将各稀释标准液0.2mL在37℃条件下加温3分钟，在事先加温的检查试剂中加入凝血酶试剂0.1mL，测定凝固时间。接下来，绘制各稀释标准液的测定值图。将血浆检体用检体稀释用缓冲液稀释10倍(稀释倍数可作适当调整)，用同样的方式测定稀释检体，以得到的凝固时间为基础，可以从图求出浓度。
另外，本发明的检查试剂以及检查试剂套装也可以用来测定凝血酶阻害物质的活性，例如，抗凝血酶活性、水蛭素的活性，还可以进一步测定化学合成阻害剂的活性。
列举以下实施例进一步详细地说明本发明，但本发明并不仅限于这些实施例。
实施例1
按照下述浓度在凝血酶试剂(国际试剂公司生产)中添加苯甲脒氯酸盐。本凝血酶试剂是由200U/mL的凝血酶和醋酸以及含有乳酸钙的缓冲液制成的、pH值为6.0的溶液。
No.1：凝血酶溶液(没有添加苯甲脒)。
No.2：在No.1中添加苯甲脒，使之成为5mM的苯甲脒氯酸盐。
No.3：在No.1中添加苯甲脒，使之成为10mM的苯甲脒氯酸盐。
测定上述试料在37℃情况下保存0、1、2、4以及8周时各凝血酶残存活性。测定方法按造日本药局规定的方法。测定结果如图1所示：未添加苯甲脒的组(No.1)经过8周后，凝血酶活性降到50％以下；添加苯甲脒氯酸盐的组(No.2、No.3)，凝血酶活性残留大约在75％以上。
实施例2
把实施例1的No.1所述的凝血酶溶液，按照实施例1所示用缓冲液稀释，制备为凝血酶活性为100U/mL的溶液，添加苯甲脒氯酸盐，使之达到下列浓度，调查此时的凝血酶稳定效果。
No.4：凝血酶溶液(100U/mL，没有添加苯甲脒)
No.5：在No.4中添加苯甲脒，使之成为2.5mM的苯甲脒氯酸盐。
No.6：在No.4中添加苯甲脒，使之成为5mM的苯甲脒氯酸盐。
关于上述试料，采取与实施例1同样的方式，测定各试料的凝血酶残存活性。测定结果如图2所示：未添加苯甲脒的组(No.4)经过8周后，凝血酶活性降到50％以下；添加苯甲脒氯酸盐的组，凝血酶活性残留大约在75％以上。
实施例3
把实施例1的No.1所述的凝血酶溶液，按照实施例1所示用缓冲液稀释，制备为凝血酶活性为100U/mL、120U/mL、150U/mL以及200U/mL的溶液，分别添加苯甲脒，使苯甲脒氯酸盐的浓度分别为0、2.5mM、5.0mM、7.5mM、10.0mM、12.5mM以及15.0mM，在37℃条件下保存8周，调查此时的凝血酶稳定效果。
测定结果如图3所示：在各种浓度的含有凝血酶的溶液中，未添加苯甲脒的组，凝血酶活性降到50％以下；添加苯甲脒氯酸盐2.5mM的组，凝血酶活性残留在70％以上的；添加7.5mM的组，凝血酶活性残留在80％以上。
实施例4
把实施例1的No.1所述的凝血酶溶液，按照实施例1所示用缓冲液稀释，制备为凝血酶活性为100U/mL及200U/mL的溶液，分别添加苯甲脒，使苯甲脒氯酸盐的浓度分别为0、0.1mM、1.0mM、5.0mM、10.0mM、20.0mM以及30.0mM，在37℃条件下保存7、14以及21日，调查此时的凝血酶稳定效果。
测定结果如图4以及5所示：在各种浓度的含有凝血酶的溶液中，通过添加苯甲脒氯酸盐，可以便凝血酶稳定。
实施例5检查试剂套装
这里的检查试剂套装，是以凝固功能检查试剂套装中的纤维蛋白原定量试剂套装为实施例的。
用TC缓冲液(国际试剂公司生产，相当于检体稀释用缓冲液)把判断纤维蛋白原浓度的标准液稀释到5倍、10倍、20倍(稀释倍数可作适当调整)。然后，将各稀释标准液0.2mL在37℃条件下加温3分钟，加入事先加温的凝血酶试剂(国际试剂公司生产，通过添加苯甲脒氯酸盐，使之成为10mM的苯甲脒)0.1mL，测定凝固时间。接下来，绘制各稀释标准液的测定值图。将血浆检体用TC缓冲液稀释10倍(稀释倍数可作适当调整)，用同样的方式测定稀释检体，以得到的凝固时间为基础，可以从图求出纤维蛋白原的浓度。
发明的效果
如上文所述，通过添加本发明的凝血酶阻害剂，具体地说是苯甲脒及其诱导体，使凝血酶稳定化。通过进一步辅助添加有机酸，获得更稳定的效果。本发明的凝血酶安定方法以及通过该安定方法得到的含有凝血酶的组成物(凝血酶试剂)，提供了前所未有的稳定的凝血酶试剂，非常有用的临床检查用试剂以及其套装。