一种治疗泌尿系感染的中药口服制剂及其制备方法 所属技术领域
本发明属于医药品的制备技术领域，具体涉及一种治疗泌尿系感染的中成药口服制剂及其制备方法。
背景技术
泌尿系感染是指上、下尿路的非特异性细菌感染所引起的泌尿系统炎症，包括肾盂肾炎、膀胱炎、尿道炎。现称为尿路感染。尿路感染流行病学资料表明，该病以女性居多，未婚少女发病率为2％，已婚女性发病率增加至5％，这与性生活有关。孕妇尿路感染发生率约为7％。男性极少发生尿路感染，50岁以后因前列腺肥大才较多发生。老年女性和男性的尿路感染发病率可高达10％。尿路感染者常见尿频、尿急、尿痛、耻骨弓上不适、腰痛、甚则寒战、发热、头痛、恶心、呕吐等，严重影响患者的日常生活和工作，严重的尿路感染还可致肾乳头坏死、肾周围脓肿等并发症。
近年来，中医药防治该病证的研究深受重视，从治疗结果来看，中医药在治疗本病方面积累了丰富的经验，显示了其独特的优势和广阔的前景，具有疗效确切且较少毒副作用的特点，目前已有一些治疗本病的中药成方制剂形成。但由于泌尿系感染疾病的发病率高且病理机制复杂，现有的药物制剂尚不能完全满足临床和市场的需要。《中华人民共和国卫生部药品标准》(中药成方制剂十七册)收载品种“泌尿宁颗粒”是由柴胡、黄柏、白芷、五味子、甘草等九味中药制成的颗粒剂，具有清热通淋，利尿止痛，补肾固本的功能。临床上主要用于热淋，小便赤涩热痛及泌尿系感染等疾病的治疗。其制备方法为：以上九味，加水煎煮二次，第一次2小时，第二次1.5小时，合并煎液，静置沉淀24小时，滤过，滤液浓缩至相对密度约为1.3(80℃)的清膏，取清膏1份，加蔗糖4份，糊精1份，制成颗粒，干燥，分装，即得。用法与用量为：开水冲服，一次12g，一日3次。上述制备工艺存在着一定的缺陷，如处方中的所有药物放在一起混合煎煮提取，不能将黄柏、白芷、五味子等所含地主要有效成分有效地提取出来，因此不能充分发挥该配方的治疗作用。另外，从其用法用量及临床实际应用过程中出现的情况来看，由于为颗粒剂，在制备过程中加入了5倍于清膏量的辅料—蔗糖和糊精，因而服用量大，运输携带不便等，同时含有大量糖分，糖尿病患者不易接受，限制了该品种在临床上的广泛使用。
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种有效成分含量高、质量稳定、疗效好、服用剂量小、使用方便的用于治疗泌尿系感染的中成药口服制剂。
本发明的另一目的在于提供该中药口服制剂的制备方法，该制备方法以充分提取各味药中的有效成分，并采用先进的药剂剂型—胶囊剂、片剂。
本发明提供的用于治疗泌尿系感染的中成药口服制剂，由下述重量配比的原料组成：
柴胡 110～130 五味子 90～110 蓄 90～110
黄柏 110～130 白芷 90～110 续断 90～110
桑寄生 90～110 苘麻子 110～130 甘草 90～110。
将上述重量配比的中药原料制成本发明的中药口服制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)取白芷、五味子加6～10倍量65～90％乙醇，回流提取2～4次，每次1～3h。合并乙醇提取液，减压回收乙醇；浓缩成稠膏，低温干燥，粉碎成细粉，备用；
(2)取黄柏加8～12倍量水浸泡1～6h，煎煮2～3次，每次1～3h，滤过，合并滤液，减压浓缩至相对密度为1.05-1.12(60℃测)，加乙醇至醇浓度达45～60％，搅拌，静置，过滤，残渣用45～60％乙醇洗涤至近无色，合并滤液及洗液，减压回收乙醇，浓缩成稠膏，低温干燥，粉碎成细粉，备用；
(3)取柴胡、蓄、续断、桑寄生、苘麻子、甘草六味药，加8～12倍量水浸泡1～6h，煎煮2-4次，每次1～3h，滤过，合并滤液，减压浓缩至相对密度为1.15-1.25(60℃测)，加乙醇至醇浓度达45～60％，搅拌，静置，过滤，滤液减压回收乙醇，浓缩成稠膏，低温干燥，粉碎成细粉，备用；
(4)取上述(1)、(2)、(3)项下细粉，合并，加入羧甲基淀粉钠、微晶纤维素，充分混合均匀，制软材，制粒，干燥，整粒，加入适量硬脂酸镁混匀，装胶囊或压片、包衣，即制得本发明的胶囊剂或片剂。
本发明所使用的原料，要求分别符合《中国药典》2000年版一部各中药项下有关的各项规定。包衣采用薄膜包衣，其辅料欧巴代(opadry AMB)要求符合USP标准。
本发明依据的原理及有益效果：
1.白芷、五味子的提取：白芷的主要有效成分为香豆素类化合物，欧前胡素为其代表成分。药理研究结果表明，白芷中的香豆素类化合物具有抗菌消炎、解热镇痛等药理作用，但香豆素类化合物不溶于水，易溶于有机溶剂；五味子主要含有木脂素类成分，此类成分易溶于有机溶剂，具有强的抗氧化作用、免疫调节作用、抗应激作用，五味子的乙醇浸液具有抗菌消炎作用。因此对于白芷和五味子的提取可选用经济易得、对环境无污染的乙醇作为提取溶剂进行提取。
将白芷、五味子通过混合水煎提取与乙醇回流提取进行比较试验，运用高效液相色谱法分别测定其有效成分欧前胡素和五味子甲素的含量，结果见表一：
表一白芷和五味子水煎与乙醇提取的比较试验
提取方法 欧前胡素(mg/g) 五味子甲素(mg/g)
8倍量水煎煮提取、2次、2h/次 0.0132 0.0133
8倍量80％乙醇提取、2次、2h/次 0.7756 0.3114
由上表可见，本发明的白芷和五味子的乙醇回流提取工艺与水煎提取工艺相比，可大大提高有效成分的提取率，从而提高药效。
2、黄柏的提取：黄柏主要含有小檗碱、黄连碱、药根碱、巴马汀等季铵型生物碱类化学成分，具有抗病原微生物、镇静、解热、提高免疫功能、抗溃疡等多种药理作用，为黄柏药用的主要有效成分，这些成分在热水中溶解性较好，可用水煎煮法提取。为了确定合理的提取方法，将黄柏单独煎煮、黄柏与甘草合煎、黄柏与甘草、桑寄生等8味药物合煎(三组均为每次加10倍量水、煎煮2次，每次1.5h，合并煎液、滤过)后，运用高效液相色谱法分别测定其提取液中小檗碱含量，结果见表二：
表二 黄柏与甘草共煎对小檗碱含量的影响
处理方法 黄柏加甘草合煎 黄柏单煎 黄柏加甘草等8味合煎
小檗碱含量(％) 0.364 0.777 0.204
由表二可见，黄柏与甘草或与甘草、桑寄生等8味药物合煎后，提取液中小檗碱含量显著降低，与黄柏单煎相差1倍或2倍以上。因此，本发明将黄柏采用单独水煎提取的方法进行提取。另外，将提取液浓缩后，用45～60％的乙醇进行醇沉除杂、再制成浸膏粉后用于压片，既可减小服用量，又可显著提高有效成分小檗碱的含量。
3、柴胡、蓄、续断、桑寄生、苘麻子、甘草六味药的提取：柴胡和续断均含皂苷、黄酮类等成分，药理实验表明具有抗炎、解热、镇痛、利尿、抗氧化、抗肿瘤和免疫增强作用。桑寄生、蓄、苘麻子含有蓄苷及槲皮苷等黄酮类成分，其水煎液都具有利尿、抗菌、抗病毒作用。甘草主要含甘草酸及甘草黄酮类成分，具有抗病毒、抗氧化、抗溃疡、调节内分泌及免疫调节作用。以上六味药所含的主要有效成分均可溶解于水，因此可合并一起用水煎提取，既可减小生产成本、又符合中药临床和大生产的实际需要。但水煎液含有大量淀粉、蛋白质、粘液质等非活性成分，增加了服用量，因此选用45～60％的乙醇进行醇沉除杂，以达到去粗取精、减少服用量的目的。
4、本发明剂型为薄膜片剂和胶囊剂，成品规格为0.35～0.5克/片。用法用量为：口服，一日3次，一次3～5片(粒)。与原“泌尿宁颗粒”一次服用12克相比，服用剂量大大减小，因而具有服用方便、易于运输贮存和携带的优点。
5、通过运用高效液相色谱法分别测定本发明和市售“泌尿宁颗粒”中的小檗碱含量，结果表明，本发明每1片(粒)小檗碱含量为1.5mg以上，即一次最低服用量为1.5mg/粒×3粒/次＝4.5mg，而“泌尿宁颗粒”每袋(12克，一次用量)小檗碱含量仅为1.5mg，由此可见本发明口服制剂有效成分之一小檗碱含量高于“泌尿宁颗粒”的2倍以上，从而提高了药效。
6、本发明片剂用全水防潮型欧巴代(Opadry AMB)包衣，具有崩解迅速、机械性能强、防潮性能好等优点，提高了制剂的稳定性和有效性。
7、本发明具有清热通淋，利尿止痛，补肾固本的功效。用于热淋、小便赤涩热痛及泌尿系感染等疾病，具有质量稳定、疗效确切等优点。经药效学试验表明，本发明具有解热、抗菌、抗炎、利尿、镇痛的作用，药效明显优于“泌尿宁颗粒”。
下面结合实施例及主要药效学试验报告对本发明作进一步的说明。
实施例1
(1)取白芷100g、五味子100g，混合，加8倍量80％乙醇，回流提取2次，每次1.5h。合并乙醇提取液，减压回收乙醇，浓缩成稠膏，低温干燥，粉碎成细粉，备用；
(2)取黄柏120g加10倍量水浸泡1h，煎煮2次，每次1.5h，滤过，合并滤液，减压浓缩至相对密度为1.05-1.08(60℃测)，加乙醇至醇浓度达50％，搅拌，静置24h，过滤，残渣用50％乙醇洗涤至近无色，合并滤液及洗液，减压回收乙醇，浓缩至稠膏，低温真空干燥，粉碎成细粉，备用；
(3)取柴胡120g、蓄100g、续断100g、桑寄生100g、苘麻子120g、甘草100g，混合，加10倍量水浸泡1h，煎煮3次，每次1.5h，滤过，合并滤液，减压浓缩至相对密度为1.15-1.25(60℃测)，加乙醇至醇浓度达50％，搅拌，静置24h，过滤，滤液减压回收乙醇，浓缩成稠膏，低温干燥，粉碎成细粉，备用；
(4)取上述(1)、(2)、(3)项下细粉，合并，加入羧甲基淀粉钠、微晶纤维素，充分混合均匀，制软材，制粒，干燥，整粒，加入适量硬脂酸镁混匀，装胶囊，即制得本发明的胶囊剂。
实施例2
(1)取白芷400g、五味子400g，混合，加10倍量70％乙醇，回流提取3次，每次1h。合并乙醇提取液，减压回收乙醇，浓缩成稠膏，低温干燥，粉碎成细粉，备用；
(2)取黄柏480g加12倍量水浸泡3h，煎煮2次，每次2h，滤过，合并滤液，减压浓缩至相对密度为1.12(60℃测)，加乙醇至醇浓度达60％，搅拌，静置18h，过滤，残渣用60％乙醇洗涤至近无色，合并滤液及洗液，减压回收乙醇，浓缩至稠膏，低温真空干燥，粉碎成细粉，备用；
(3)取柴胡480g、蓄400g、续断400g、桑寄生400g、苘麻子480g、甘草400g，混合，加12倍量水浸泡4h，煎煮3次，每次1.5h，滤过，合并滤液，减压浓缩至相对密度为1.20(60℃测)，加乙醇至醇浓度达60％，搅拌，静置20h，过滤，滤液减压回收乙醇，浓缩成稠膏，低温干燥，粉碎成细粉，备用；
(4)取上述(1)、(2)、(3)项下细粉，合并，加入羧甲基淀粉钠、微晶纤维素，充分混合均匀，用适量乙醇制软材，16目筛制颗粒，50℃干燥，整粒，加入适量硬脂酸镁，混匀，压片，用欧巴代(opadry AMB)包薄膜衣，即制得本发明片剂1000片。
实施例3
(1)取白芷110g、五味子90g，混合，加7倍量60％乙醇，回流提取2次，每次2.5h。合并乙醇提取液，减压回收乙醇，浓缩成稠膏，低温干燥，粉碎成细粉，备用；
(2)取黄柏130g加10倍量水浸泡3h，煎煮4次，每次1h，滤过，合并滤液，减压浓缩至相对密度为1.07(60℃测)，加乙醇至醇浓度达50％，搅拌，静置22h，过滤，残渣用50％乙醇洗涤至近无色，合并滤液及洗液，减压回收乙醇，浓缩至稠膏，低温真空干燥，粉碎成细粉，备用；
(3)取柴胡110g、蓄110g、续断90g、桑寄生110g、苘麻子130g、甘草100g，混合，加9倍量水浸泡2h，煎煮3次，每次1.2h，滤过，合并滤液，减压浓缩至相对密度为1.18(60℃测)，加乙醇至醇浓度达53％，搅拌，静置20h，过滤，滤液减压回收乙醇，浓缩成稠膏，低温真空干燥，粉碎成细粉，备用；
(4)取上述(1)、(2)、(3)项下细粉，合并，加入羧甲基淀粉钠、微晶纤维素，充分混合均匀，用适量乙醇制软材，16目筛制颗粒，45℃干燥，12目筛整粒，加入适量硬脂酸镁，混匀，压片，包薄膜衣，即制得本发明片剂。
为证明本发明治疗泌尿系感染的效果及安全性，进行了毒理和药效学试验，研究结果如下：
一、急性毒性试验
急性毒性研究结果表明，本发明灌胃给药后，小鼠活动明显减少，部分出现腹泻，24小时后基本恢复正常，未发现其它毒性反应。小鼠一日最大给药量为179.2g生药/kg，相当于临床成人每日用量344.6倍。
二、长期毒性试验
长期毒性研究结果表明，用本发明大、中、小三个剂量(40.16、20.8、10.4g生药/kg，分别相当于成人用量的80、40、20倍)给大鼠连续灌胃三个月，对大鼠的一般状况、血液学、血液生化学、尿常规、心电图、系统解剖、脏器系数和组织病理学均无明显影响，未发现毒性反应，恢复期亦无延迟性毒性反应，提供大鼠无毒性反应剂量为40.16g生药/kg/日。
三、主要药效学试验
【试验材料】
试验药物：本发明薄膜衣片，0.46g/片，每克实验药物相当于生药5.6g，以蒸馏水配成所需浓度的溶液。对照药、主要试剂及细菌：泌尿宁颗粒；三金片；标准菌株购自中国医学科学院、北京药品生物制品鉴定所、中国医学细菌保藏中心，临床分离菌株由西安交通大学第一医院等提供，均经TAXK-II全自动数字细菌鉴定仪鉴定。
【试验方法及结果】
(一)镇痛试验
小鼠50只，雌雄各半，随机分为5组，每组10只。第一组为阴性对照组，给等容积生理盐水；第二组为阳性对照组，给泌尿宁颗粒28g生药/kg；第三、四、五组为本发明薄膜衣片组，分别给本发明薄膜衣片7、14、28g生药/kg。各组皆灌胃给药，0.2ml/10g，每天1次，连续3天。末次给药1小时后腹腔注射0.6％醋酸溶液0.1ml/10g，观察记录15min内小鼠扭体反应(小鼠腹部贴地、内凹、伸展后肢、扭曲)次数，结果见表1。
表1本发明对小鼠扭体反应的影响(x±s)
组别 剂量 动物数 扭体反应
g生药/kg) (只) (次/15min)
阴性对照组 10 14.9±6.9
泌尿宁颗粒 28 10 9.2±5.0*
本发明小剂量 7 10 13.5±6.7
本发明中剂量 14 10 9.2±5.5
本发明大剂量 28 10 8.5±5.6*
与阴性对照组比较 *P＜0.05
由表1可见，本发明薄膜衣片能抑制醋酸刺激的小鼠扭体反应，与阴性对照组比较，大剂量组有显著性差异(P＜0.05)，提示泌尿宁薄膜衣对醋酸刺激的疼痛有镇痛作用。阳性对照药泌尿宁颗粒也能抑制醋酸刺激的小鼠扭体反应，但作用稍弱于本发明薄膜衣片。
(二)抗炎试验
(1)急性腹腔渗出性炎症试验
小鼠50只，雌雄各半，随机分为5组，每组10只。第一组为阴性对照组，给等容积生理盐水；第二组为阳性对照组，给泌尿宁颗粒28g生药/kg；第三、四、五组为本发明薄膜衣片组，分别给本发明薄膜衣片7、14、28g生药/kg。各组皆灌胃给药，0.2ml/10g，每天1次，连续3天。末次给药1小时后，每鼠静脉注射0.5％伊文思蓝溶液0.1ml/10g，然后腹腔注射0.6％醋酸0.2ml/只，20min后颈椎脱臼处死，剪开腹腔，用6ml生理盐水分次冲洗腹腔，收集洗涤液并加生理盐水至l0ml，3000rpm离心15min。取上清夜于590nm比色，由标准曲线计算伊文思蓝含量。结果见表2。
表2本发明薄膜衣片对小鼠急性腹腔渗出性炎症的影响(x±s)
组别 剂量 动物数 伊文思蓝量 抑制率
(g生药/kg) (只) (μg/ml) (％)
阴性对照组 10 2.6±1.4
泌尿宁颗粒 28 10 1.3±0.8* 47.54
本发明小剂量 7 10 1.7±0.8 34.62
本发明中剂量 14 10 1.4±1.0* 46.15
本发明大剂量 28 10 1.1±0.6** 57.69
与阴性对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
由表2可见，本发明薄膜衣片可使小鼠腹腔伊文思蓝渗出量减少，与阴性对照组比较，中、大剂量组均有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01)，提示本发明薄膜衣片可抑制醋酸刺激的小鼠急性渗出性炎症反应。阳性对照药泌尿宁颗粒也能抑制醋酸刺激的小鼠急性渗出性炎症反应，但作用弱于本发明片剂。
(2)大鼠足跖水肿法
大鼠50只，随机分为5组，每组10只。第一组为阴性对照组，给等容积蒸馏水；第二组为阳性对照组，给泌尿宁颗粒20g生药/kg；第三、四、五组为本发明薄膜衣片小、中、大剂量组，分别给本发明薄膜衣片5、10、20g生药/kg。各组灌胃给药，每天1次，0.2ml/100g，连续3天。末次给药60min后，每鼠右后足跖皮内注射10％鸡蛋清0.1ml致炎。致炎前及致炎后30min、1h、2h、4h用大鼠足趾容积测定仪测量大鼠右后足爪容积，以致炎前后足爪容积之差作为肿胀度，结果见表3。
表3本发明薄膜衣片对大鼠急性炎症的影响(x±s，n＝10)
组别 剂量 肿胀度(mm)
(g生药/kg) 30min 1h 2h 4h
阴性对照组 0.40±0.24 0.73±0.32 0.66±0.14 0.40±0.12
泌尿宁颗粒 20 0.34±0.16 0.47±0.23* 0.27±0.13* 0.17±0.13
本发明小剂量 5 0.34±0.24 0.62±0.24 0.46±0.18* 0.37±0.17
本发明中剂量 10 0.32±0.21 0.61±0.33 0.46±0.24* 0.32±0.12
本发明大剂量 20 0.32±0.20 0.45±0.12* 0.44±0.23* 0.27±0.15*
与阴性对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
由表3可见，本发明薄膜衣片可抑制鸡蛋清诱发的大鼠急性炎症的发生和发展，与阴性对照组比较，小、中剂量给药后2h有显著性差异(P＜0.05)，大剂量组给药后1h、2h、4h有显著性差异(P＜0.05)。说明本发明薄膜农片有抗大鼠急性渗出性炎症作用。阳性对照药泌尿宁颗粒也能抑制鸡蛋清诱发的大鼠急性渗出性炎症反应，在4h时作用弱于本发明薄膜衣片。
(三)对正常家兔的利尿作用
健康家兔40只，随机分为5组，每组8只。第一组为阴性对照组，给生理盐水；第二组为阳性对照组，给泌尿宁颗粒10.4g生药/kg、第三、四、五组为本发明薄膜衣片组，分别给本发明薄膜衣片2.6、5.2、10.4g生药/kg。首先给家兔以水负荷，30ml/kg，然后静脉注射3％戊巴比妥钠1ml/kg麻醉，仰卧固定于手术台，剪去下腹部毛，在耻骨联合上方沿正中线做长约5cm切口，打开腹腔，暴露膀胱。然后切开膀胱，插入、固定膀胱漏斗以收集尿液。手术结束后停留20min，然后收集30min尿量。灌胃给药，5ml/kg。给药后开始收集尿量，共4次(第1次0～30min，第二次30～60min，第三次60～90min，第四次90～120min)，每次30min。结果见表4。
表4本发明对正常家兔的利尿作用(x±s)
组别 剂量 动物数 尿量(ml)
(g生药/kg) (只) 给药前 给药后30min 60min 90min 120min
阴性对照组 8 1.73±0.79 1.26±1.19 1.79±1.24 2.25±0.79 2.10±0.98
泌尿宁颗粒 10.4 8 1.56±0.49 2.66±4.45 3.24±2.63 5.09±3.83* 3.58±2.15
本发明小剂量 2.6 8 1.73±2.11 2.84±3.25 3.04±2.92 2.43±1.85 1.54±0.52
本发明中剂量 5.2 8 1.90±0.68 3.05±2.33 3.01±1.82 3.63±1.65* 3.03±1.92
本发明大剂量 10.4 8 1.71±0.89 3.09±2.74 5.36±4.63* 6.49±5.1* 4.89±3.57*
与阴性对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
由表4可见，本发明薄膜衣片可增加正常家兔的尿量，与阴性对照组比较，中剂量组给药后90min有显著性差异(P＜0.05)，大剂量组给药后60min、90min、120min均有显著性差异(P＜0.05)，提示本发明薄膜衣片对家兔具有利尿作用。阳性对照药泌尿宁颗粒对家兔也有利尿作用，但作用弱于本发明薄膜衣片。
(四)解热试验
健康家兔40只，随机分为5组，每组8只。第一组为阴性对照组，给生理盐水；第二组为阳性对照组，给泌尿宁颗粒10.4g生药/kg、第三、四、五组为泌尿宁薄膜衣片组，分别给泌尿宁薄膜衣片2.6、5.2、10.4g生药/kg。各组以5ml/kg灌胃给药后，在每只兔股四头肌处注射用高压灭菌并用肉汤培养液10倍稀释的大肠杆菌液2ml，在注射死菌液后1、2、3、5、8、12 h时测定每只兔肛温。将各给药组动物体温与基础体温之差与模型组体温之差进行比较。结果见表5。
表5泌尿宁薄膜衣片对死大肠杆菌引起兔体温升高的影响(x±s，n＝8)
组别 剂量 用药后体温
(g生药/kg) 正常 致热后 1h 2h 3h 5h 8h 12h
阴性对照组 39.04±0.10 41.61±0.29 41.86±0.19 41.80±0.17 41.76±0.13 41.53±0.18 40.64±0.22 39.90±0.26
泌尿宁颗粒 10.4 39.04±0.09 41.43±0.29 41.63±0.20* 41.48±0.29* 41.38±0.25**40.89±0.32**40.29±0.34* 39.95±0.33
本发明 2 6 38.95±0.09 41.55±0.23 41.77±0.17 41.70±0.17 41.69±0.25 41.34±0.14* 40.64±0.19 40.08±0.30
本发明 5.2 39.04±0.11 41.68±0.24 41.64±0.17* 41.57±0.20* 41.43±0.25**41.03±036** 40.13±0.17**39.63±0.24*
本发明 10.4 39.06±0.09 41.50±0.35 41.64±0.19* 41.49±0.21**41.28±0.19**40.31±0.22**40.10±0.24**39.45±0.16*
与阴性对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
由表5可见，泌尿宁薄膜衣片可降低大肠杆菌引起兔体温升高，与阴性对照组比较，小剂量组给药后5h有显著性差异(P＜0.05)；中剂量组给药后1h、2h、3h、5h、8h、12h有显著性差异(P＜0.05，P＜0.01)；大剂量组给药后1h、2h、3h、5h、8h、12h均有显著性差异(P＜0.05，P＜0.01)，提示泌尿宁薄膜衣片对大肠杆菌引起兔体温升高有抑制作用。阳性对照药泌尿宁颗粒对大肠杆菌引起兔体温升高也有抑制作用，但作用弱于泌尿宁薄膜衣片。
(五)体外抗菌试验
1.本发明薄膜衣片MIC和MBC的测定
1.1对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌、表皮葡萄球菌、不动杆菌、变形杆菌、肠炎沙门氏菌标准株和临床分离株MIC和MBC的测定：将本发明薄膜衣片用MH肉汤由10％(560mg生药/ml)进行连续二倍梯度稀释，将各浓度药液分别加到96孔培养板，0.2ml/孔。再依次加入浓度为106CFU/ml的试验菌液10μl/孔，同时设立细菌对照以及培养基对照。置室温作用12h，于普通培养箱37℃培养24h观察结果。无细菌生长孔中所含最小药物浓度为MIC。再依次将未见细菌生长孔的培养物分别吸取0.1ml点种于MH平板，置普通培养箱37℃培养24h，无细菌生长接种区域对应的最小药物浓度为MBC，结果见表6～7。
1.2对酿脓链球菌、粪链球菌、淋病奈瑟氏菌标准株MIC和MBC的测定：将本发明薄膜衣片用含0.5％小牛血清的MH肉汤由10％(560mg生药/ml)进行连续二倍梯度稀释，将各浓度药液分别加到96孔培养板，0.2ml/孔。再依次加入浓度为106CFU/ml的试验菌液10μl/孔，同时设立细菌对照以及培养基对照。置室温作用12h，于5％CO2培养箱37℃培养48h观察结果。无细菌生长孔中所含最小药物浓度为MIC。再依次将未见细菌生长各孔的培养物分别吸取0.1ml转染到营养平板(酿脓链球菌、粪链球菌接种血平板，淋球菌接种巧克力色平板)，置5％CO2培养箱37℃培养48h，无细菌生长接种区域对应的最小药物浓度为MBC，结果见表5～6。
1.3对白色念珠菌标准株和临床分离MIC和MBC的测定：将本发明薄膜衣片用沙保弱氏(SB)肉汤由10％(560mg生药/ml)进行连续二倍梯度稀释，将各浓度药液分别加到96孔培养板，0.2ml/孔。再依次加入浓度为106CFU/ml的试验菌液10μl/孔，同时设立细菌对照以及培养基对照。置室温作用12h，于普通培养箱37℃培养48h观察结果。无细菌生长孔中所含最小药物浓度为MIC。再依次将未见细菌生长各孔的培养物分别吸取0.1ml点种于SB平板，置普通培养箱37℃培养48h，无细菌生长接种区域所对应的最小药物浓度为MBC，结果见表6～7。
表6本发明薄膜衣片对标准菌株的MIC和MBC
菌株 MIC(mg生药/ml) MBC(mg生药/ml)
大肠埃希氏菌ATCC25922株 70 140
金黄色葡萄球菌ATCC25925株 2.185 8.75
绿脓假单胞菌ATCC27853株 70 140
表皮葡萄球菌ATCC26069株 4.375 7.75
酿脓链球菌32300株 4.375 17.5
不动杆菌25003株 17.5 70
粪链球菌ATCC10541株 8.75 17.5
淋病奈瑟氏菌20106株 1.0938 4.375
变形杆菌49010株 35 70
肠炎沙门氏菌50040株 17.5 35
白色念珠菌85021株 2.1875 8.75
表7本发明对473株临床分离菌株的MIC、MIC50、MIC90和MBC(mg生药/ml)
菌株 株数 MIC MIC50 MIC90 MBC
大肠杆菌 155 35～140 64.5806 81.5126 70～280
金黄葡菌 115 1.0938～8.75 3.8794 4.0514 4.375～17.5
表皮葡菌 50 2.185～8.75 3.9804 4.1038 4.375～17.5
不动杆菌 38 8.75～70 20.7237 24.5717 17.5～140
变形杆菌 85 17.5～70 34.5882 48.3146 35～140
白念球菌 30 0.5469～4.375 1.6401 1.9306 2.185～8.75
由表6可见，本发明薄膜衣片对试验所选用的大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌、表皮葡萄球菌、酿脓链球菌、不动杆菌、粪链球菌、淋病奈瑟氏菌、变形杆菌、肠炎沙门氏菌、白色假丝酵母菌的标准株均有较明显的抑制和灭活作用，其MBC为MIC的2～4倍。由表7可见，本发明薄膜衣片对试验所选用的473株临床分离菌株均有一定的抑制和灭活作用，其MBC为MIC的2～4倍。
2.培养条件对本发明薄膜衣片MIC的影响
选取大肠埃希氏菌ATCC25922株和表皮葡萄球菌ATCC26069株，改变培养条件，分别测定本发明薄膜衣片对受试细菌的MIC。
2.1pH的影响：参照试验1MIC测定方法，将培养液的pH分别调到5.7、7.2、8.5，分别测定各自的MIC，结果见表8。
表8pH对本发明薄膜农片MIC的影响
MIC (mg生药/ml)
pH 大肠埃希氏菌 表皮葡萄球菌
ATCC25922株 ATCC26069株
5.7 70 4.375
7.2 70 4.375
8.5 70 4.375
由表8可见，改变培养液的pH，不影响本发明薄膜衣片对大肠埃希氏菌ATCC25922株和表皮葡萄球菌ATCC26069株的MIC。
2.2细菌接种量的影响：参照试验1MIC测定方法，将试验菌液浓度依次改变为106、108、1010CFU/ml，每孔接种10μl，进行MIC测定，结果见表9。
表9 细菌接种量对本发明薄膜衣片MIC的影响
细菌接种量 MIC(mg生药/ml)
(CFU/ml) 大肠埃希氏菌 表皮葡萄球菌
ATCC25922株 ATCC26069株
106 70 4.375
108 70 4.375
1010 70 4.37
由表9可见，改变细菌接种量，不影响本发明薄膜衣片对大肠埃希氏菌ATCC25922株和表皮葡萄球菌ATCC26069株的MIC。
(六)体内抗菌试验
1.试验菌最小致死量的测定
将ICR小鼠随机分组，每组10只，雌雄各半。将试验菌液用含5％胃膜素的生理盐水10倍连续梯度稀释，用每一稀释菌液腹腔注射感染一组小鼠，感染量0.2ml/10g，以5％胃膜素生理盐水为对照，观察7天，记录各组小鼠死亡情况，以致小鼠全部死亡的最小浓度细菌量作为最小致死量(MLD)。结果表明，变形杆菌49010株的最小致死量2×107CFU/kg。
2.本发明薄膜衣片对感染小鼠0％(ED0)和100％(ED100)保护量的测定
ICR小鼠随机分组，每组10只，雌雄各半。用试验菌100％MLD腹腔注射感染小鼠。将本发明薄膜衣片由20％开始用生理盐水做5倍连续梯度稀释，每一稀释度药液灌胃给药一组小鼠，0.2ml/10g(起始给药量22.4g生药/kg)，每日1次，连续7天，同时设立感染对照和正常对照组，观察7天内小鼠死亡情况。小鼠全部死亡的最大给药量为0％保护量，小鼠全部存活的最小给药量为100％保护量。结果表明，本发明薄膜农片对变形杆菌49010株感染小鼠的ED100为22.4g生态平衡药/kg，ED0为0.35g生药/kg。
3.本发明薄膜衣片贴对变形杆菌49010株感染小鼠50％(ED50)保护量的测定
ICR小鼠随机分组，每组10只，雌雄各半。用变形杆菌49010株100％MLD菌液腹腔注射感染小鼠。将本发明薄膜衣片用生理盐水由20％开始做1∶2连续5个梯度稀释，每一梯度药液灌胃给药一组小鼠。给药量0.2ml/10g(起始给药量22.4g生药/kg)，每日1次，连续7天。感染对照组和正常对照组同法给等容积生理盐水，阳性对照设两组，分别给三金片和泌尿宁颗粒。观察7天内小鼠死亡情况，计算本发明薄膜衣片对变形杆菌49010株感染小鼠的ED50及95％可信限，结果见表10。
表10本发明薄膜衣片对变形杆菌49010株感染小鼠的保护作用
组别 剂量 对数剂量 动物数 死亡数 存活率
(g生药/kg) (只) (只) (％)
空白对照组 10 0 100
感染对照组 10 10 0
三金片 7.8 0.8921 10 3 70
泌尿宁颗粒 11.2 1.0492 10 3 70
本发明片 11.2 1.0492 10 1 90
本发明片 5.6 0.7482 10 4 60
本发明片 2.8 0.4472 10 7 30
本发明片 1.4 0.1462 10 9 10
本发明片 0.7 0.1549 10 10 0
结果表明，本发明薄膜衣片对变形杆菌49010株感染小鼠的ED50为6.0062g生药/kg，95％可信限为4.1957～8.6038g生药/kg。
【试验结论】
本发明薄膜衣片体外对泌尿道感染常见细菌大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌、表皮葡萄球菌、酿脓链球菌、不动杆菌、粪链球菌、淋病奈瑟氏菌、变形杆菌、肠炎沙门氏菌、白色假丝酵母菌有较明显的抑制和灭活作用，改变pH和细菌接种量不影响本发明薄膜衣片对大肠埃希氏菌和表皮葡萄球菌的抗菌作用；灌胃给药，体内对变形杆菌感染小鼠有保护作用；能抑制醋酸刺激的小鼠急性渗出性炎症反应和鸡蛋清诱发的大鼠急性炎症反应；抑制醋酸刺激的小鼠扭体反应；对家兔具有利尿作用。对家兔灌胃给药，能抑制死大肠杆菌引起的兔体温升高。结果说明，本发明薄膜衣片具有抗菌、抗炎、利尿、解热、镇痛作用，作用优于泌尿宁颗粒。