一种超氧化物歧化酶苹果及其生产方法与专用生物制剂 【技术领域】
本发明涉及一种具有高含量生物保护酶的苹果及其生产方法与专用生物制剂，特别是涉及一种具有高含量超氧化物歧化酶(SOD)的苹果及其生产方法与专用生物制剂。
背景技术
SOD酶是生物重要保护酶之一，具有增强机体免疫力，防衰老的功能。专利号为93103774.3，发明名称为“一种产生超氧化物歧化酶的芽孢杆菌及其生产方法”的中国发明专利中公开了一株芽孢杆菌，菌株保藏号为CGMCC 0175，该菌株具有较强的产生超氧化物歧化酶的能力。
苹果是深受人们喜爱的水果，也是我国入世后为数不多的具有明显国际竞争力的农产品之一。目前世界苹果年总产量近6000万吨，人均苹果占有量约10公斤，我国为15公斤，高于世界人均水平5公斤，因此对苹果进行品质改进，特别是使苹果具有一些特殊的医疗保健作用意义非常重大。
【发明内容】
本发明地目的是提供一种生产具有高含量超氧化物歧化酶(SOD)苹果的专用生物制剂。
该专用生物制剂的活性成分是3.0×1010cfu/g的芽孢杆菌CGMCC 0175。
所述制剂中还含有所述菌体5-7倍重量份数比的轻质碳酸钙或草炭或腐植酸，轻质碳酸钙或草炭或腐植酸的细度一般为0.08-0.1mm，优选的为0.09mm。
本发明的第二个目的是提供一种具有高含量超氧化物歧化酶(SOD)苹果及其生产方法。
本发明所提供的超氧化物歧化酶(SOD)苹果，含有20-50IU/g的超氧化物歧化酶。
所述苹果的可溶性固形物大于等于14.7％；可滴定酸小于等于0.27g/100ml；硬度为12-18kg/cm2。
一种生产超氧化物歧化酶(SOD)苹果的方法，是向树冠喷雾或/和树干注射苹果专用SOD制剂。
在实际应用中，所述向树冠喷雾苹果专用SOD制剂的方法是，每亩每次用苹果专用SOD生物制剂40-60克，兑水100-200公斤，共喷5-7次，每次间隔25-30天。其中较优选的是每亩每次用50克，共喷6次，
所述树干注射苹果专用SOD制剂，包括以下步骤：1)钻孔，在根茎部钻孔，孔深达髓心部；
2)注射，向孔中注射苹果专用SOD制剂，每亩每次用65-85克，溶于1-3公斤水中，共注射3-5次，其中较优选的是每亩每次用75克，溶于2公斤水中，套袋苹果共注射4次。
上述过程中，钻孔应在根茎部50cm之内，钻孔与树干呈45-80度的夹角，孔径5-5.5mm，钻孔数量2-3个。
苹果专用SOD制剂通过芽孢杆菌在苹果树体内繁殖、转移，提高苹果体内的SOD活性和含量。苹果专用SOD制剂菌株产生的SOD酶有较强的耐温抗热性和抗逆能力，在70℃条件下处理1小时，酶活为原酶活的47％；100℃条件下处理30分钟，酶活为原酶活的37％；对臭氧、高温高酸的耐性很强。用本发明的方法生产的SOD苹果不仅保持了原有苹果的优良性状，而且SOD含量明显提高，具有增强人体免疫力和延缓衰老的功效，在深加工过程中仍可保持较高的SOD酶活。
苹果专用SOD制剂可以与其它栽培管理措施结合实施，不增加工时，同时可以与其它杀虫剂、杀菌剂(杀细菌剂除外)、植物生长调节剂、叶面肥、化学肥料等农化物质混合使用，不影响使用效果。
【具体实施方式】
实施例1、苹果专用SOD生物制剂的生产
一、菌株的发酵生产
1、生产中的技术指标
灭菌条件：温度121-125℃，压力0.11-0.14mpa，时间30min
培养条件：温度28-34℃，压力0.05mpa，通气值1∶1，pH值7-7.5
放罐指标：含菌量≥50亿/ml，芽孢形成≥70％，杂菌率≤0.3％
2、菌种生产
从芽孢杆菌CGMCC 0175原菌种斜面上挑取少许在备用斜面试管内划线，置于28-30℃温箱中培养24h，取出检查，确认无杂菌污染，菌体生长整齐时，再继续培养24-48h，然后涂片、染色，并在油镜下观察，无杂菌污染，孢子整齐时，作为发酵生产的菌种。
3、发酵生产
发酵生产分种子罐培养和发酵罐培养两部分进行，发酵液达到规定指标时及时放罐。
二、制备生物制剂
1、添加吸附剂
向得到的发酵液中投入6倍菌体重量细度为0.09mm的轻质碳酸钙或草炭或腐植酸，然后机械搅拌3-6小时，使芽孢杆菌充分被载体吸附。
2、压滤
采用明流式或暗流式板扛压滤机滤去多余水份。
3、干燥
低温干燥(不超过70℃)，使含水率≤5％。
4、粉碎
用超细度粉碎机粉碎，细度要求为100％通过0.09mm孔径筛，控制细度的目的是为防止使用时堵塞喷头。
5、包装
实施例2、采用树冠喷雾法生产SOD苹果
选用苹果树长势旺盛，已进入生产期的富士苹果果园。
每亩每次用苹果专用SOD生物制剂50克，一般兑水100-200公斤，混和稀释均匀，视树体大小、栽培密度调整用水量。套袋富士，共喷6次，现蕾期喷1次，套袋前幼果期喷1次，套袋后喷3次，每次间隔25-30天，在取袋后喷1次；喷洒应达到叶片、树干、果实等部位稀释液均匀附着，一般应在上午10点前或下午3点后喷施。果园进行正常的栽培管理，收获时得到的苹果即是超氧化物歧化酶苹果，该种苹果的超氧化物歧化酶为20-50IU/g，苹果的可溶性固形物大于等于14.7％；可滴定酸小于等于0.27g/100ml；硬度为12-18kg/cm2。
该实施例的方法也适用于新红星、花冠等品种，对于这些品种，在现蕾期至采收期共喷6次，每次至少间隔25天。
实施例3、采用树干注射法生产SOD苹果
选用苹果树长势旺盛，已进入生产期的果园。
1、钻孔，在根茎部50cm之内，钻与树干夹角45-80度的孔，孔径5-5.5mm，钻孔数量2-3个，深度达髓心部。
2.注射，每亩每次用苹果专用SOD制剂75克，一般溶于2公斤水中，套袋苹果共注射4次，现蕾期(4月底)1次，套袋后3次，时间分别为6月底、7月底、8月底。将单株所需苹果专用SOD制剂稀释液装入滴注袋，垂直挂于距地面1.5米左右高的中心枝杈上，并排出管道中的气体，然后将滴注针头插入钻孔即可进行注射。注射完毕，注孔用干树枝塞紧，与树皮剪平，并堆土保护注孔。在天气晴朗时注射时间一般为2-12小时。注射时，苹果专用SOD制剂至少提前4小时溶解。果园进行正常的栽培管理，收获时得到的苹果即是超氧化物歧化酶苹果，该种苹果的超氧化物歧化酶为20-50IU/g，苹果的可溶性固形物大于等于14.7％；可滴定酸小于等于0.27g/100ml；硬度为12-18kg/cm2。
实施例4、本发明超氧化物歧化酶苹果SOD酶活的测定
一、SOD酶活的测定
SOD酶活的测定采用NBT光化学法
1、NBT反应液的制备：配制pH7.8，50mmol/L的磷酸缓冲液1000ml，加入1.933mg的L-甲硫氨酸(L-Met)，待完全溶解后，放入45.8mg氯化硝基氮蓝四唑(NBT)，0.47mg核黄素(配成0.47mg/ml溶液，吸取1ml加入)和29.0mg乙二胺四乙酸(EDTA)，溶液终浓度：Met为13mmol/L；NBT为6.3×10-3mmol/L；核黄素(VB2)为1.3×10-3mmol/L；EDTA为0.1mmol/L，置于棕色试剂瓶中，用黑布罩遮光，于4℃冰箱中可保存1个月。
2、材料的预处理
苹果果肉用研钵研碎，按照果肉∶50mM磷酸缓冲液＝1∶2的比例加入缓冲液，10000rpm离心10分钟，取上清液进行SOD酶活测定。
3、测定方法
吸取30μl样品，放入10ml透明玻璃小烧杯中，加入3mlNBT反应液，混匀，在28℃SOD光化反应室中，2×15W日光灯光照20分钟(光照为4000勒克司)，在560nm处测定吸光度，以NBT反应液作空白对照，每组设3次重复，整个测定过程除光化反应外，均在避光或弱光条件下进行。同时测试过程中以美国″Sigma″公司、上海宝安公司的标准酶和贵州老来福药业公司生产的SOD口服液作为测试对照。
4、计算
SOD酶活(IU/g)＝(OD对照-OD样品)/(1/2OD对照)×稀释倍数
二、本发明超氧化物歧化酶苹果SOD酶活的测定
测定实施例1和实施例2生产的SOD苹果中的SOD酶活性，结果如表1所示，表明SOD苹果中SOD酶活显著高于普通苹果，且在a＝0.05水平差异显著。说明通过该项技术可以生产出具有高含SOD酶活的SOD保健功能苹果。
表1、SOD苹果中SOD酶活测定结果项目 重复次数 SOD酶活(IU/g)实施例1的SOD苹果 3 22.5B实施例2的SOD苹果 3 35.0A对照 3 2.8C
实施例5、本发明超氧化物歧化酶(SOD)苹果SOD的抗热性测定
将SOD苹果样品在100℃中保持20分钟，测定SOD苹果和对照苹果的SOD酶活性。
测定结果如表2所示，表明，经过热处理后，SOD苹果中仍保持较高的SOD酶活，但对照含有的SOD酶活极低。说明通过该项技术生产的SOD苹果，适于在常温下保存和进行深加工，仍能保持较高的SOD活性。
表2、SOD苹果中SOD的抗热性测定项目 重复次数 SOD酶活(IU/g)实施例1的SOD苹果 3 20.5B实施例2的SOD苹果 3 31.0A对照 3 0.5C