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1、(10)申请公布号 CN 102965289 A (43)申请公布日 2013.03.13 CN 102965289 A *CN102965289A* (21)申请号 201210515360.6 (22)申请日 2012.12.05 CGMCC No.6493 2012.09.03 C12N 1/14(2006.01) A01G 7/06(2006.01) A01H 1/04(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (71)申请人 浙江省农业科学院 地址 310021 浙江省杭州市石桥路 198 号 (72)发明人 方丽 王汉荣 (74)专利代理机构 浙江杭州金通专利事务所。
2、有 限公司 33100 代理人 向庆宁 (54) 发明名称 一种对枇杷枝条和叶片同时致病的真菌以及 用途 (57) 摘要 本发明提供一种对枇杷枝条和叶片同时致病 的真菌， 该真菌为中国普通微生物菌种保藏管理 中心的保藏号为 CGMCC NO.6493 的聚多拟盘多毛 孢 （Pestalotiopsissydowiana） 以及该真菌的用 途。本发明分离纯化的真菌既可以对枇杷的叶片 和枝条致病， 为鉴定筛选抗该真菌的枇杷新品种 提供了新的途径， 可以避免传统方法筛选出现假 抗病的现象。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 2 页 (19)中华。
3、人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 2 页 1/1 页 2 1. 一种对枇杷枝条和叶片同时致病的真菌， 该真菌为中国普通微生物菌种保藏管理 中心的保藏号为 CGMCC NO. 6493 的聚多拟盘多毛孢 （Pestalotiopsis sydowiana）的 NNH-B-4 菌株。 2. 一种筛选枇杷抗病性品种的方法， 该方法包括 ： 通过培养保藏号为 CGMCC NO. 6493 的聚多拟盘多毛孢 （Pestalotiopsis sydowiana）的 NNH-B-4 菌株， 获得分生孢子悬浮 液， 让其浓度为 106个 /mL ； 把。
4、菌丝或分生孢子悬浮液接种到枇杷的枝条和页叶上 ； 接 种处用透明塑料袋包裹， 内置棉花保湿， 置于 20-30的温室大棚培养 48 h ； 然后去除塑 料袋， 进行日常的栽培管理 ； 观察枇杷的枝条感病或抗病情况， 获得抗聚多拟盘多毛孢 （Pestalotiopsis sydowiana）的枇杷品种。 3. 一种利用中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏号为 CGMCC NO. 6493 的聚多拟 盘多毛孢 （Pestalotiopsis sydowiana）的 NNH-B-4 菌株作为枇杷抗病育种的用途。 权 利 要 求 书 CN 102965289 A 2 1/5 页 3 一种对枇杷枝条和叶。
5、片同时致病的真菌以及用途 技术领域 0001 本发明属于植物真菌， 特别是， 属于一种可以同时对枇杷叶片和枝条致病的真菌 以及对该真菌的用途。 背景技术 0002 枇杷 （Eriobotrya japonica） 是一种亚热带果树， 原产中国， 果实酸甜可口， 叶片 可入药， 具有清热、 润肺、 止咳化痰等功效。 0003 拟盘多毛孢属 （Pestalotiopsis）真菌可引起枇杷上多种叶部病害， 在叶片 上形成圆形或不规则形灰褐色病斑， 直径 2-13mm， 发病重时病斑可连接在一起， 病害 后 期 病 斑 处 长 出 黑 色 小 点。 如Pestalotiopsis eriobotrif。
6、olia、Pestalotiopsis eriobotryae-japonica引起的枇杷叶部病害。通常可从叶片的病健交界处分离获得致病 菌， 并纯化保存菌种， 可以利用这些菌种对枇杷进行抗病性鉴定和筛选， 最终获得抗该病原 菌的枇杷新品种， 也可以利用这些菌种进行其它实验研究， 例如用于研究和开发防治或防 止枇杷该病害的药剂。 发明内容 0004 0004 本发明研究小组在枇杷枝条上发现一种新的致病菌， 聚多拟盘多毛孢 （Pestalotiopsis sydowiana）， 该病菌既可以对枇杷的叶片致病， 也可以使枇杷枝条致病。 这与其他以往只在枇杷叶片上发现的拟盘多毛孢属致病菌不同。基于其。
7、在枇杷枝条上的 新致病性状， 该致病菌可以作为枇杷抗病性育种的一种新的便利工具。利用该病原菌进行 抗病性鉴定可以获得的抗该病害的枇杷新品种， 筛选出叶片和枝条均抗聚多拟盘多毛孢 （Pestalotiopsis sydowiana）的枇杷新品种。 0005 一方面， 本发明提供一种对枇杷枝条和叶片同时致病的真菌， 该真菌为中国普通 微生物菌种保藏管理中心的保藏号为CGMCC NO. 6493的聚多拟盘多毛孢 （Pestalotiopsis sydowiana） 一方面， 本发明提供一种用于枇杷枝条抗病性育种筛选的真菌， 该真菌为在中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为 CGMCC。
8、 NO. 6493 的聚多拟盘多毛孢 （Pestalotiopsis sydowiana） 。 0006 优选的方式中， 该病菌既可以让枇杷叶片感病， 又可以让枇杷的枝条发病。 0007 另 一 方 面，本 发 明 提 保 藏 号 为 CGMCC NO. 6493 的 聚 多 拟 盘 多 毛 孢 （Pestalotiopsis sydowiana）真菌， 作为枇杷抗病性育种筛选的应用。 0008 在优选的方式中， 把病菌同时接种在枇杷叶片和枇杷的枝条上。 0009 在一些优选的方式中， 用 106个 /mL 的该真菌的分生孢子悬浮液接种到离体的枇 杷嫩茎或活体的枇杷嫩茎上。 0010 本发明还。
9、提供一种筛选枇杷抗病性品种的方法， 该方法包括 ： 提供保藏 号为 CGMCC NO. 6493 的真菌， 或通过培养保藏号为 6493 的真菌， 聚多拟盘多毛孢 说 明 书 CN 102965289 A 3 2/5 页 4 （Pestalotiopsis sydowiana） ， 获得分生孢子悬浮液， 浓度为 106个 /mL ； 把菌丝或分生孢 子悬浮液接种到枇杷的枝叶上 ； 接种处用透明塑料袋包裹， 内置棉花保湿， 置于 20-30的 温室大棚培养 48 h ； 然后去除塑料袋， 进行日常的栽培管理 ； 观察枇杷的枝条感病或抗病， 获得抗聚多拟盘多毛孢 （Pestalotiopsis s。
10、ydowiana） 的枇杷品种。 0011 保藏信息 编号NNH-B-4的菌株的保藏日期为 ： 2012年9月3日 ， 保藏地址为 ： 北京市朝阳区北 辰西路 1 号院 3 号 中国科学院微生物研究所 ； 保藏单位为 ： 中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心 保藏号为 ： CGMCC No.6493， 中文名称为 ： 聚多拟盘多毛孢 , 拉丁文学名 为 ：Pestalotiopsis sydowiana。 0012 有益效果 本发明分离纯化的真菌即可以对枇杷的叶片和枝条致病， 为鉴定筛选抗该真菌的枇杷 新品种提供了新的途径， 可以避免传统方法筛选出现假抗病的现象。 实施例 0013 实。
11、施例 1 ： 病原分离物的分离纯化 于 2012 年 2 月 15 日采集于浙江宁波宁海的枇杷干枯病的典型病枝， 切取病健交界的 小块茎或叶片组织， 置于弱酸性 PSA 培养基 （土豆 200 g， 蔗糖 20 g， 琼脂 18 g， 水 1000mL， pH 6.0） ， 培养3 d。 对长出的所有不同菌落， 挑取少量菌丝进行分离。 对分离后的不同分离 物进行单胞培养， 获得病原分离物 13 个。这些病原分离物在 25光照培养箱进行培养， 至 产生大量分生孢子器。 0014 实施例 2 ： 致病性接种初步鉴定 对在实施例1中获得的13个病原分离物进行致病性接种鉴定。 鉴定方法采用枇杷离体 嫩。
12、茎接种方法 ： 分别用分离物的菌丝块 （520 mm） 和分生孢子悬浮液 （106个 /mL） 接种离 体的枇杷嫩茎。嫩茎截成 8 cm 长的小段， 菌丝块接种在伤口上， 伤口用棉花保湿， 紧密包裹 嫩茎。分生孢子液用小型喷雾器均匀喷洒在嫩茎上 ； 各处理置于 9 cm 的培养皿中， 于 25 光照培养箱保湿培养 10 d（12 h 光照 /12 h 黑暗） ， 每个处理重复 3 次。其中接种 4 d 和 10 d 后编号为 NNH-B-4 的菌丝块和分生孢子液接种处分别出现了茎部褐变症状。而其他 12 个分离物则与对照相同， 没有明显症状。对照处理为无菌水， 接种方法和处理时间同上。 001。
13、5 实施例 3 ： 致病性接种田间活体鉴定 为了进一步说明NNH-B-4的致病性， 用1年生的原寄主 “宁海白” 枇杷苗进行活体接种 ： 分别用 NNH-B-4 的菌丝块和分生孢子液接种枇杷苗， 接种茎干和叶片， 接种方法同上， 接种 处用透明塑料袋包裹， 内置棉花保湿， 置于20-30的温室大棚培养48 h。 然后去除塑料袋， 进行日常的栽培管理。每个处理 3 个重复。接种 4 d 后， 菌丝块接种的枇杷苗最先出现病 症茎部变褐， 叶片自叶柄沿叶脉向外枯黄变褐 ； 接种 15 d 后， 分生孢子液接种处出现 干枯病的典型病症。因此， 分离物 NNH-B-4 是引起枇杷干枯病的致病真菌。 00。
14、16 实施例 4 ： 病原培养鉴定 于 25培养病原菌 NNH-B-4， 其在 PSA 培养基上形成白色绒毛状菌落， 具痂状轮纹， 背 面密黄色。25培养 7 d 后产生黑色小团状子实体 （485.4 - 385.6m） 。分生孢子 5 细 说 明 书 CN 102965289 A 4 3/5 页 5 胞， 梭形或纺锤形， 直或略弯曲， 20.9-29.87.1-14.5m ； 中间 3 色胞异色， 第 1、 2 色胞深 褐色， 第 3 色胞浅褐色， 分隔处缢缩 ； 顶孢无色， 三角形， 具 2-3 根附属丝， 大角度分开， 长 12.0-33.1m ； 尾孢无色， 三角形或圆锥形， 具中生式。
15、柄 1 根， 长 3.3-7.8m， 尾孢细胞大于 顶孢细胞。根据该分离物的形态特征初步鉴定该菌为Pestalotiopsis sydowiana。 0017 实施例 5 ： 病原菌分子鉴定 用引物 ITS4 （5 -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3） 和 ITS1 （5 - TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3） PCR 扩增该病原菌的 rDNA Internal Transcibed Spacer 序列 (ITS), 经测序获得 一个 550 bp 的序列， 具体序列如下 ： TCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTATAGAGTTTTCTAAAC T。
16、CCCAACCCATGTGAACTTACCTTTTGTTGCCTCGGCAGAAGTTATAGGTCTTCTTATAGCTGCTGCCGGTGGACCA TTAAACTCTTGTTATTTTATGTAATCTGAGCGTCTTATTTTAATAAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTT CTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGA ACGCACCTTGCGCCCATTAGTATTCTAGTGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTTAAGCC。
17、TAGCTTAGTG TTGGGAATCTACTTCTCTTAGGAGTTGTAGTTCCTGAAATACAACGGCGGATTTGTAGTATCCTCTGAGCGTAGTA ATTTTTTTCTCGCTTTTGTTAGGTGCTATAACTCCCAGCCGCTAAACCCCCAATTTTTTGTGGTTGACCTCGGATC AGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA。该序列在 Genbank 中检索发现其与 Pestalotiopsis sydowiana的相似性高达 99%。 0018 综合培养形态与 ITS 分子鉴定结果认为引起枇杷干枯病。
18、的病原菌为拟盘多毛孢 属聚多拟盘多毛孢 （Pestalotiopsis sydowiana） 。 0019 实施例 6 ： 病原菌的用途 Pestalotiopsis属真菌可引起枇杷上多种叶部病害， 在叶片上形成圆形或不规则形 灰褐色病斑， 直径 2-13mm， 发病重时病斑可连接在一起， 病害后期病斑处长出黑色小点。如 Pestalotiopsis eriobotrifolia、Pestalotiopsis eriobotryae-japonica引起的枇杷叶 部病害。尚未有报道由Pestalotiopsis属病原菌引起的枇杷枝条病害。以往的文献资料 报道聚多毛孢对杜鹃、 茶树等植物致病， 。
19、这是首次发现Pestalotiopsis sydowiana能够对 枇杷致病。 其能引起枇杷的嫩茎枯萎， 叶片产生大病斑 （直径大于20 mm） ， 枝条枯死， 严重时 整棵树死亡。 0020 用P. eriobotrifolia（由浙江大学农业生物技术学院徐同教授惠赠）、P. eriobotryae-japonica（由浙江大学农业生物技术学院徐同教授惠赠）和本发明的 P. sydowiana的菌丝块对枇杷离体叶片和枝条进行接种比较。5 mm2的菌丝块对枇杷茎的 接种方法同上， 每个茎接种一个菌丝块 ； 5 mm2的菌丝块等距离放置在枇杷叶片叶脉的一 侧， 每个菌丝块相距约 40 mm， 一。
20、个叶片最多放置 3 个菌丝块， 每个处理重复 3 次。于 25 光照培养箱保湿培养 10 d（12 h 光照 /12 h 黑暗） ， 结果发现P. eriobotrifolia和P. eriobotryae-japonica只能对枇杷叶片致病， 产生小的圆形或不规则形病斑 ； 而本发明的 P. sydowiana对叶片和枝条都有非常好的致病效果。P. sydowiana接种4 d后枝条和叶片 出现病症， 枝条发病处褐变， 僵硬， 长约 5mm ； 枝条病斑扩展稍缓慢， 而叶片病斑扩展迅速， 接种第 8 天时叶片病斑已经大于 20 mm， 其病斑初期主要在叶肉间扩展， 后期侵染叶脉， 导 致叶片。
21、整个死亡。 0021 表1 P. eriobotrifolia、 P. eriobotryae-japonica和P. sydowiana的致病性。 说 明 书 CN 102965289 A 5 4/5 页 6 0022 实施例 7 ： 病原菌的枇杷抗病性筛选作用 提供 10 个供试枇杷品种， 分别为 ： 1- 大钟、 2- 长红 3 号、 3- 宁海白、 4- 大红袍、 5- 野生 枇杷、 6- 杭本地、 7- 解放钟、 8- 东湖早、 9- 白沙、 10- 蒲新本， 从中筛选出抗Psydowiana的 品种。供试菌为本发明的Psydowiana、 Periobotrifolia（对照 CK。
22、,由浙江大学农业生 物技术学院徐同教授惠赠） ； 接种的部位为幼嫩的叶片和枝条， 分别于接种后 4、 8、 12、 16、 20 天观察叶片及枝条的症状， 试验重复 2 次。 0023 “-” 表示无感病症状 ；“+” 表示有感病症状 结果发现， 通过对照筛选的抗病品种为 2, 5 和 6 号 , 但是通过接种本发明的P sydowiana 时候， 只有 5 和 6 号表现出叶片和枝条抗病。从 20 天后的 2 号和 5,6 号叶片病 斑中重又分离出接种病原菌， 鉴定为本发明的Psydowiana。因而确定 5 和 6 号品种为抗 Psydowiana，可作为抗枇杷干枯病的亲本进行育种繁殖或用。
23、作其他用途。而另外枇杷品 种的叶片和枝条出现不同程度感病症状 ； 有些品种接种 4 天后就出现枝叶病症， 有些接种 说 明 书 CN 102965289 A 6 5/5 页 7 12 天左右出现病斑， 枝条发病时间较叶片病症稍晚。而对照菌Periobotrifolia对不同 枇杷品种接种结果发现， 该病原菌仅能对枇杷叶片致病， 发病时间 4-16 天左右， 根据品种 的不同稍有差异。对照菌不能显示不同枇杷品种间在枝条上的抗病性差异。 0024 以上结果可以看出， 利用本发明的病菌Psydowiana可以有效区分枇杷品种对该 病原菌的抗感特性， 从中挑选出在叶片和枝条都表现抗病的品种， 为抗病育。
24、种提供了新的 筛选途径， 让获得的抗病品种更符合预期的要求， 避免了采用传统病菌筛选抗病品种的假 象， 节约了育种时间， 减少育种的成本。 0025 鉴于P.sydowiana对枇杷枝条和叶片的致病性， 目前已发现其对宁海白、 大钟、 长 红 3 号、 大红袍、 东湖早、 蒲新本、 解放钟、 白沙等栽培品种具有较高的致病性， 对野生枇杷、 和杭本地枇杷的致病效果差。根据该病原菌的致病性， 用来作为枇杷抗病育种材料的筛选 工具之一， 可筛选出对该病害具有抗性的栽培枇杷品种， 提高枇杷品种的抗病性， 增加枇杷 品种的多样性， 减少单一品种种植引起的病害大爆发。 0026 本文中用来描述方法的术语和。
25、表达方式并不是唯一不变的， 并且我们没有任何意 图使用这些术语和表达方式来排除描述本发明或者特征的任何相同意义的表达方式， 我们 认同在本发明声明的范围内的各种不同的表达方式。因此， 我们认为尽管在本文中本发明 已经用各种具体方案和任意的特征描述清楚地展示出来， 但是改变本文中揭示的设计的 表达方式还要求助于那些有经验的专业技术人士， 并且这些改变要与本发明附带的声明一 致。 文章、 专利、 专利应用和所有其它文档的内容以及本文中提到的和引证的有用的电子化 信息是结合在一起的， 必须作为一个完整的内容来参考， 发表其中任何一个部分都要特别 指明这一点。 申请者具有将任何和全部的这些文章、 专利。
26、、 专利应用或其它文档的信息和材 料合并入该申请书作为本专利说明书揭示的一部分的权利。 说 明 书 CN 102965289 A 7 1/2 页 8 SEQUENCE LISTING 浙江省农业科学院 一种对枇杷枝条和叶片同时致病的真菌以及用途 3 PatentIn version 3.3 1 20 DNA 人工序列 1 tcctccgctt attgatatgc 20 2 19 DNA 人工序列 2 tccgtaggtg aacctgcgg 19 3 550 DNA Pestalotiopsis sydowiana 3 tccgtaggtg aacctgcgga gggatcatta tag。
27、agttttc taaactccca acccatgtga 60 序 列 表 CN 102965289 A 8 2/2 页 9 acttaccttt tgttgcctcg gcagaagtta taggtcttct tatagctgct gccggtggac 120 cattaaactc ttgttatttt atgtaatctg agcgtcttat tttaataagt caaaactttc 180 aacaacggat ctcttggttc tggcatcgat gaagaacgca gcgaaatgcg ataagtaatg 240 tgaattgcag aattcagtga atca。
28、tcgaat ctttgaacgc accttgcgcc cattagtatt 300 ctagtgggca tgcctgttcg agcgtcattt caacccttaa gcctagctta gtgttgggaa 360 tctacttctc ttaggagttg tagttcctga aatacaacgg cggatttgta gtatcctctg 420 agcgtagtaa tttttttctc gcttttgtta ggtgctataa ctcccagccg ctaaaccccc 480 aattttttgt ggttgacctc ggatcaggta ggaatacccg ctgaacttaa gcatatcaat 540 aagcggagga 550 序 列 表 CN 102965289 A 9 。