高分子阿霉素键合药及其制备方法 【技术领域】
本发明属于化学键合药物技术领域， 尤其涉及一种高分子阿霉素键合药及其制备方法。 背景技术 阿霉素， 又名羟柔红霉素、 羟正定霉素、 多柔比星或 ADR， 是一种蒽环抗生素类广谱 抗肿瘤药物， 为细胞周期非特异性药， 对 S 期作用最强， 对 M、 G1 和 G2 期也有作用， 其作用机 制主要是嵌入 DNA 分子， 破坏核酸结构和抑制生物大分子的合成。阿霉素主要用于治疗急 性白血病、 恶性淋巴瘤、 肝癌、 肺癌、 胃癌、 食道癌、 宫颈癌、 膀胱癌、 睾丸癌、 甲状腺癌、 软组 织肿瘤、 骨肉瘤和神经母细胞癌等。目前， 静脉滴注是阿霉素最主要的临床给药方式， 然而 静脉滴注后药物会迅速分布全身， 缺少对肿瘤组织的靶向， 能达到肿瘤部位并发挥疗效的 阿霉素比例很低， 致使其生物利用度不高， 效率低下， 需要频繁给药， 从而对身体的正常组 织和器官造成巨大的毒副作用。
为解决临床上存在的问题， 阿霉素新剂型的开发一直是研究者关注的热点。 其中， 纳米尺度的药物传输系统， 如脂质体， 聚合物纳米颗粒， 胶束等发展较为迅速。 其中， 由两亲 性嵌段共聚物或接枝共聚物自组装成的胶束成为药物载体的研究重点。 胶束包载药物的方 式主要分为两种， 一种是物理包载， 一种是化学键合。相对于物理包载， 化学键合由于能够 提供更稳定的药物包载方式、 更持续的药物释放和更长的药物释放时间而获得了广泛的研 究。
公开号为 101234204A 的中国专利公开了一种高分子阿霉素键合药， 首先在聚乙 二醇、 溶剂和催化剂的存在下进行脂肪族环酯的开环聚合得到聚乙二醇 - 聚乳酸嵌段共 聚物， 再将该嵌段共聚物的端羟基转化为端羧基， 在缩合剂的存在下与阿霉素进行酰胺化 反应， 得到在水溶液中可以自组装得到稳定载有阿霉素的纳米粒子， 即高分子阿霉素键合 药； 公开号为 101234205A 的中国专利公开了一种具有靶向功能的高分子阿霉素键合药， 由两种聚乙二醇 - 聚乳酸嵌段共聚物混合组装而成， 第一种聚乙二醇 - 聚乳酸嵌段共聚物 的聚乳酸链端接有阿霉素， 第二种聚乙二醇 - 聚乳酸嵌段共聚物的聚乙二醇链端接有乳 糖， 该键合药物中， 阿霉素受聚乙二醇和聚乳酸的双重保护， 具有缓释功能 ； 乳糖具有靶向 功能， 能够实现阿霉素的靶向输送， 因此， 该阿霉素键合药能够在肿瘤组织内缓释。但是， 上述两种键合药存在连结的化学键过于稳定、 载药量低、 阿霉素的释放缺乏智能性等问题。 Biomaterials(Vol.31， p1360-1371， 2010) 公开了一种在聚酰胺 - 胺树枝状高分子的表面 氨基上键合聚乙二醇单甲醚和顺 -3- 羧基戊烯二酸酐修饰的羧基化阿霉素而得到的高分 子阿霉素键合药， 该键合药在肿瘤组织和细胞的酸性条件下可以快速释放， 从而实现药物 释放的智能性， 但是该键合药所使用的载体材料为聚酰胺 - 胺树枝状高分子， 其制备过程 繁琐、 生物相容性差， 不利于键合药的实际应用。
发明内容有鉴于此， 本发明要解决的技术问题在于提供高分子阿霉素键合药及其制备方 法， 本发明提供的高分子阿霉素键合药制备过程简单， 生物相容性较好， 不仅可以实现在肿 瘤部位的聚集， 而且具有 pH 值响应性， 具有良好的应用前景。
本发明提供了一种具有式 (I) 或式 (II) 结构的高分子阿霉素键合药 ：
其中， R1 为烷基 ； R 选自式 (11) ～ (14) 结构中的一种 ：
mPEG 具有式 (15) 结构 ：式 (15) 中， n 为聚合度， 10 ≤ n ≤ 120 ；
式 (I) 或式 (II) 中， m 为聚合度， 所述高分子阿霉素键合药的数均分子量为 1000 ～ 100000 ；
式 (I) 或式 (II) 中， i、 j 和 k 分别为 -R、 -mPEG 和 -NH2 在所述高分子阿霉素键合 药中的摩尔比， 满足以下条件 ： i+j+k ＝ 1， 0.1 ≤ i ≤ 0.8， 0.05 ≤ j ≤ 0.2。
优选的， i、 j 和 k 满足以下条件 ： 0.15 ≤ i ≤ 0.75， 0.1 ≤ j ≤ 0.15。
本发明还提供了一种高分子阿霉素键合药的制备方法， 包括以下步骤 ：
a) 具有式 (III) 结构的聚乙二醇单甲醚、 羧基化阿霉素衍生物、 1-(3- 二甲氨基丙 基 )-3- 乙基碳二亚胺· 盐酸盐和 N- 羟基琥珀酰亚胺在有机溶剂中反应， 得到反应混合液， 所述羧基化阿霉素衍生物具有式 (IV-a)、 式 (IV-b)、 式 (IV-c) 或式 (IV-d) 结构 ：
式 (III) 中， n 为聚合度， 10 ≤ n ≤ 120 ；b) 向所述步骤 a) 得到的反应混合液中加入聚 (L- 赖氨酸 ) 或壳聚糖， 反应后得到 高分子阿霉素键合药。
优选的， 所述具有式 (III) 结构的聚乙二醇单甲醚、 羧基化阿霉素衍生物与聚 (L- 赖氨酸 ) 或壳聚糖主链上的氨基的摩尔比为 (5 ～ 20) ∶ (10 ～ 80) ∶ 100。
优选的， 所述聚 (L- 赖氨酸 ) 或壳聚糖的分子量为 1000 ～ 60000。
优选的， 所述羧基化阿霉素衍生物按照以下方法制备 ：
阿霉素· 盐酸盐、 酸酐和三乙胺在有机溶剂中发生反应， 得到羧基化的阿霉素衍生 物， 所述酸酐为 1， 2- 二羧基环己烯酸酐、 2， 3- 二甲基马来酸酐、 2， 2， 3， 3- 四甲基丁二酸酐 或顺 -3- 羧基戊烯二酸酐。
优选的， 所述阿霉素· 盐酸盐、 酸酐和三乙胺的摩尔比为 1 ∶ (0.5 ～ 2) ∶ (0.5 ～ 2)。
优选的， 所述具有式 (III) 结构的聚乙二醇单甲醚按照以下方法制备 ：
聚乙二醇单甲醚和丁二酸酐在有机溶剂中反应， 得到具有式 (III) 结构的聚乙二 醇单甲醚。
优选的， 所述聚乙二醇单甲醚的数均分子量为 500 ～ 5000。
优选的， 所述聚乙二醇单甲醚和所述丁二酸酐的摩尔比为 1 ∶ (3 ～ 8)。
与现有技术相比， 本发明以具有式 (III) 结构的聚乙二醇单甲醚、 具有式 (IV-a)、 式 (IV-b)、 式 (IV-c) 或式 (IV-d) 结构的羧基化阿霉素衍生物和聚 (L- 赖氨酸 ) 或壳聚糖 为原料， 使其发生缩合反应后得到具有式 (I) 或式 (II) 结构的高分子阿霉素键合药。本发 明提供的高分子阿霉素键合药具有亲水基团和疏水基团， 可以在水中组装成核壳结构的纳 米粒子， 通过增强的渗透和滞留效应实现药物在肿瘤部位的聚集 ； 本发明提供的高分子阿 霉素键合药具有 pH 响应性， 包裹在纳米粒子内部的阿霉素在肿瘤组织或肿瘤细胞内的 pH 值条件下可以快速释放， 从而增强药物效果。另外， 本发明以聚氨基酸或壳聚糖为原料， 其 不仅具有良好的生物相容性， 而且制备过程简单， 有利于得到的高分子阿霉素键合药的深 入利用。 附图说明
图 1 为本发明实施例 1 提供的聚 (L- 赖氨酸 ) 的核磁共振氢谱图 ；
图 2 为本发明实施例 1 提供的聚 (L- 赖氨酸 ) 的红外谱图 ；
图 3 为本发明实施例 5 得到的羧基化阿霉素衍生物的核磁共振氢谱图 ；
图 4 为本发明实施例 5 得到的羧基化阿霉素衍生物的红外分析谱图 ；
图 5 为本发明实施例 13 得到的高分子阿霉素键合药的核磁共振氢谱图 ；
图 6 为本发明实施例 13 得到的高分子阿霉素键合药的红外分析谱图 ；
图 7 为本发明实施例提供的高分子阿霉素键合药的累积释放曲线。 具体实施方式
本发明提供了一种具有式 (I) 或式 (II) 结构的高分子阿霉素键合药 ：
mPEG 具有式 (15) 结构 ：式 (15) 中， n 为 聚 合 度， 10 ≤ n ≤ 120， 优 选 的， 20 ≤ n ≤ 110 ； 更 优 选 的， 25 ≤ n ≤ 100 ；
式 (I) 或式 (II) 中， m 为聚合度， 所述高分子阿霉素键合药的数均分子量为 1000 ～ 100000， 优选为 2000 ～ 90000， 更优选为 3000 ～ 80000 ；
式 (I) 或式 (II) 中， i、 j 和 k 分别为 -R、 -mPEG 和 -NH2 在所述高分子阿霉素键合 药中的摩尔比， 满足以下条件 ： i+j+k ＝ 1， 0.1 ≤ i ≤ 0.8， 0.05 ≤ j ≤ 0.2 ； 优选的， i、 j 和 k 满足以下条件 ： 0.15 ≤ i ≤ 0.75， 0.1 ≤ j ≤ 0.15 ； 更优选的， i、 j 和 k 满足以下条件 ： 0.2 ≤ i ≤ 0.7， 0.12 ≤ j ≤ 0.14。
在所述具有式 (I) 结构的高分子阿霉素键合药中， 其主链为聚 (L- 赖氨酸 )， 其侧 链上的氨基部分与羧基化的聚乙二醇单甲醚发生缩合， 部分与羧基化的阿霉素衍生物发生 缩合， 得到具有式 (I) 结构的高分子阿霉素键合药 ； 在所述具有式 (II) 结构的高分子阿霉 素键合药中， 其主链为壳聚糖， 其侧链上的氨基部分与羧基化的聚乙二醇单甲醚发生缩合， 部分与羧基化的阿霉素衍生物发生缩合， 得到具有式 (II) 结构的高分子阿霉素键合药。
在所述具有式 (I) 或式 (II) 结构的高分子阿霉素键合药中， 除了主链不同以外， 其他参数， 如聚合度、 羧基化的聚乙二醇单甲醚与氨基发生缩合的比例、 羧基化的阿霉素与 氨基发生缩合的比例等均具有相同的范围， 可以采用相同的数值， 本领域技术人员可以通 过控制反应条件实现。 本发明还提供了一种高分子阿霉素键合药的制备方法， 包括以下步骤 ：
a) 具有式 (III) 结构的聚乙二醇单甲醚、 羧基化阿霉素衍生物、 1-(3- 二甲氨基丙 基 )-3- 乙基碳二亚胺· 盐酸盐和 N- 羟基琥珀酰亚胺在有机溶剂中反应， 得到反应混合液， 所述羧基化阿霉素衍生物具有式 (IV-a)、 式 (IV-b)、 式 (IV-c) 或式 (IV-d) 结构 ：
式 (III) 中， n 为聚合度， 10 ＜ n ＜ 120 ；
b) 向所述步骤 a) 得到的反应混合液中加入聚 (L- 赖氨酸 ) 或壳聚糖， 反应后得到 高分子阿霉素键合药。
本发明以原料来源广泛、 制备过程简单的聚 (L- 赖氨酸 ) 或壳聚糖为原料， 制备得 到的高分子阿霉素键合药具有亲水基团和疏水基团， 可以在水中组装成核壳结构的纳米粒 子， 通过增强的渗透和滞留效应实现药物在肿瘤部位的聚集 ； 本发明提供的高分子阿霉素 键合药具有 pH 响应性， 包裹在纳米粒子内部的阿霉素在肿瘤组织或肿瘤细胞内的 pH 值条 件下可以快速释放， 从而增强药物效果。
本 发 明 首 先 将 具 有 式 (III) 结 构 的 聚 乙 二 醇 单 甲 醚、 羧 基 化 阿 霉 素 衍 生 物、 1-(3- 二甲氨基丙基 )-3- 乙基碳二亚胺· 盐酸盐和 N- 羟基琥珀酰亚胺在有机溶剂混合， 得 到反应混合液。
所述具有式 (III) 结构的聚乙二醇单甲醚按照以下方法制备 ：
聚乙二醇单甲醚和丁二酸酐在有机溶剂中反应， 得到具有式 (III) 结构的聚乙二 醇单甲醚。
首先将所述聚乙二醇单甲醚和丁二酸酐溶解于有机溶剂中， 聚乙二醇单甲醚与丁 二酸酐发生反应， 得到具有式 (III) 结构的聚乙二醇单甲醚。其中， 所述有机溶剂优选为吡 啶； 所述聚乙二醇单甲醚的数均分子量优选为 500 ～ 5000， 更优选为 1000 ～ 4500， 最优选 为 1500 ～ 4000 ； 所述聚乙二醇单甲醚与所述丁二酸酐的摩尔比优选为 1 ∶ (3 ～ 8)， 更优 选为 1 ∶ (4 ～ 7)。 所述聚乙二醇单甲醚和所述丁二酸酐优选在搅拌的条件下发生反应， 所 述反应的温度优选为 10℃～ 40℃， 更优选为 15℃～ 35℃， 最优选为 20℃～ 30℃， 时间优选 为 10h ～ 50h， 更优选为 15h ～ 40h， 最优选为 20h ～ 30h。反应结束后， 将得到的反应混合 物用乙醚沉降、 过滤、 洗涤、 25℃下真空干燥 24h 后， 得到具有式 (III) 结构的聚乙二醇单甲 醚。
所述羧基化阿霉素衍生物具有式 (IV-a)、 式 (IV-b)、 式 (IV-c) 或式 (IV-d) 结构， 优选为按照以下方法制备 ：
阿霉素· 盐酸盐、 酸酐和三乙胺在有机溶剂中发生反应， 得到羧基化的阿霉素衍生 物， 所述酸酐为 1， 2- 二羧基环己烯酸酐、 2， 3- 二甲基马来酸酐、 2， 2， 3， 3- 四甲基丁二酸酐 或顺 -3- 羧基戊烯二酸酐。
在无水条件下， 将阿霉素·盐酸盐、 酸酐和三乙胺溶解于有机溶剂中， 阿霉素·盐 酸盐和酸酐发生反应， 得到羧基化的阿霉素衍生物。所述有机溶剂优选为 N， N- 二甲基甲酰 胺； 所述阿霉素· 盐酸盐、 酸酐和三乙胺的摩尔比优选为 1 ∶ (0.5 ～ 2) ∶ (0.5 ～ 2)， 更优
选为 1 ∶ (1 ～ 1.5) ∶ (1 ～ 1.5)。所述阿霉素·盐酸盐和酸酐优选在搅拌的条件下发生 反应， 所述反应的温度优选为 10℃～ 40℃， 更优选为 15℃～ 35℃， 最优选为 20℃～ 30℃， 时间优选为 10h ～ 50h， 更优选为 15h ～ 40h， 最优选为 20h ～ 30h。反应结束后， 将得到的 反应混合物倒入 20 倍体积的乙酸乙酯中稀释， 然后用饱和氯化钠水溶液洗涤、 干燥、 过滤、 浓缩后得到羧基化阿霉素衍生物。
在本发明中， 所述酸酐为 1， 2- 二羧基环己烯酸酐、 2， 3- 二甲基马来酸酐、 2， 2， 3， 3- 四甲基丁二酸酐或顺 -3- 羧基戊烯二酸酐， 当所述酸酐为 1， 2- 二羧基环己烯酸酐时， 得 到的羧基化阿霉素衍生物具有式 (IV-a) 结构 ； 当所述酸酐为 2， 3- 二甲基马来酸酐时， 得到 的羧基化阿霉素衍生物具有式 (IV-b) 结构 ； 当所述酸酐为 2， 2， 3， 3- 四甲基丁二酸酐时， 得 到的羧基化阿霉素衍生物具有式 (IV-c) 结构 ； 当所述酸酐为顺 -3- 羧基戊烯二酸酐时， 得 到的羧基化阿霉素衍生物具有式 (IV-d) 结构。
本发明首先将具有式 (III) 结构的聚乙二醇单甲醚和羧基化阿霉素衍生物与 1-(3- 二甲氨基丙基 )-3- 乙基碳二亚胺·盐酸盐和 N- 羟基琥珀酰亚胺在有机溶剂中进行 活化反应， 得到反应混合液。其中， 所述具有式 (III) 结构的聚乙二醇单甲醚和羧基化阿霉 素衍生物的和、 1-(3- 二甲氨基丙基 )-3- 乙基碳二亚胺·盐酸盐和 N- 羟基琥珀酰亚胺的 摩尔比优选为 1 ∶ (3 ～ 8) ∶ (1 ～ 4)， 更优选为 1 ∶ (4 ～ 7) ∶ (2 ～ 3) ； 所述有机溶剂 优选为二甲基亚砜 ； 所述活化反应优选在搅拌条件下进行， 所述反应的温度优选为 10℃～ 40℃， 更优选为 15℃～ 35℃， 最优选为 20℃～ 30℃， 时间优选为 10h ～ 50h， 更优选为 15h ～ 40h， 最优选为 20h ～ 30h。 活化反应完毕后， 得到反应混合液， 向所述反应混合液中加入聚 (L- 赖氨酸 ) 或 壳聚糖， 具有式 (III) 结构的聚乙二醇单甲醚和羧基化阿霉素衍生物与聚 (L- 赖氨酸 ) 或 壳聚糖上的氨基反应后， 得到具有式 (I) 或式 (II) 结构的高分子阿霉素键合药。在本发 明中， 所述具有式 (III) 结构的聚乙二醇单甲醚、 羧基化阿霉素衍生物与聚 (L- 赖氨酸 ) 或壳聚糖主链上的氨基的摩尔比优选为 (5 ～ 20) ∶ (10 ～ 80) ∶ 100， 更优选为 (10 ～ 15) ∶ (15 ～ 75) ∶ 100 最优选为 (12 ～ 14) ∶ (20 ～ 70) ∶ 100 ； 所述聚 (L- 赖氨酸 ) 的 数均分子量优选为 1000 ～ 60000， 更优选为 1500 ～ 50000， 最优选为 2000 ～ 40000 ； 所述壳 聚糖的数均分子量优选为 1000 ～ 60000， 更优选为 1500 ～ 50000， 最优选为 2000 ～ 40000 ； 所述具有式 (III) 结构的聚乙二醇单甲醚和羧基化阿霉素衍生物与聚 (L- 赖氨酸 ) 或壳聚 糖上的氨基优选在搅拌的条件下发生反应， 反应温度优选为 10℃～ 40℃， 更优选为 15℃～ 35℃， 最优选为 20℃～ 30℃， 时间优选为 10h ～ 50h， 更优选为 15h ～ 40h， 最优选为 20h ～ 30h。
反应完毕后， 将得到的反应产物用截留分子量为 3500Dalton 的透析袋透析 24h， 冻干后即可得到具有式 (I) 结构或式 (II) 结构的高分子阿霉素键合药。 当原料为聚 (L- 赖 氨酸 ) 时， 得到具有式 (I) 结构的高分子阿霉素键合药 ； 当原料为壳聚糖时， 得到具有式 (II) 结构的高分子阿霉素键合药。
本发明对所述壳聚糖的来源没有特殊限制， 市场上购买即可。
本发明对所述聚 (L- 赖氨酸 ) 的来源没有特殊限制， 优选按照以下方法制备 ：
在无水条件下， 将 ε- 苄氧羰基 -L- 赖氨酸 -N- 羧酸酐用无水 N， N- 二甲基甲酰 胺溶解， 并在搅拌下加入引发剂， 其中， 引发剂与 ε- 苄氧羰基 -L- 赖氨酸 -N- 羧酸酐的摩
尔比为 1 ∶ 5 ～ 500， 在 25℃， 搅拌子搅拌条件下反应 72h， 反应结束后， 把溶液倒入体积为 溶剂 10 倍量的乙醚中沉降， 过滤， 洗涤， 25℃真空干燥 24h， 得到聚 (ε- 苄氧羰基 -L- 赖氨 酸 )。其中， 所述引发剂为正己胺或己二胺等本领域技术人员熟知的引发剂。
将聚 (ε- 苄氧羰基 -L- 赖氨酸 ) 在 25℃下用三氟乙酸溶解， 然后在搅拌子搅拌 下加入溴化氢质量含量为 33％的溴化氢 / 冰醋酸混合溶液， 其中， 溴化氢与聚 (ε- 苄氧羰 基 -L- 赖氨酸 ) 中苄氧羰基的摩尔比为 1 ∶ 4， 在 25℃下反应 1h， 产物用乙醚沉降， 过滤， 洗 涤， 25℃下真空干燥 24h， 得到聚 (L- 赖氨酸 )。
得到高分子阿霉素键合药后， 对所述高分子阿霉素键合药在 pH 值分别为 5.5、 6.8 和 7.4 时进行药物释放， 结果表明， 本发明提供的高分子阿霉素键合药具有 pH 响应性， 包裹 在纳米粒子内部的阿霉素在肿瘤组织或肿瘤细胞内的 pH 值条件下可以快速释放， 从而增 强药物效果。
本发明以具有式 (III) 结构的聚乙二醇单甲醚、 具有式 (IV-a)、 式 (IV-b)、 式 (IV-c) 或式 (IV-d) 结构的羧基化阿霉素衍生物和聚 (L- 赖氨酸 ) 或壳聚糖为原料， 使其发 生缩合反应后得到具有式 (I) 或式 (II) 结构的高分子阿霉素键合药。本发明提供的高分 子阿霉素键合药具有亲水基团和疏水基团， 可以在水中组装成核壳结构的纳米粒子， 通过 增强的渗透和滞留效应实现药物在肿瘤部位的聚集 ； 本发明提供的高分子阿霉素键合药具 有 pH 响应性， 包裹在纳米粒子内部的阿霉素在肿瘤组织或肿瘤细胞内的 pH 值条件下可以 快速释放， 从而增强药物效果。另外， 本发明以聚氨基酸或壳聚糖为原料， 其不仅具有良好 的生物相容性， 而且制备过程简单， 有利于得到的高分子阿霉素键合药的深入利用。
为了进一步说明本发明， 以下结合实施例对本发明提供的高分子阿霉素键合药及 其制备方法进行详细描述。
以 下 各 实 施 例 中， 反应产率＝实际得到的产物质量 / 理论得到的产物质 量 ×100％。
实施例 1 ～ 4 不同数均分子量聚 (L- 赖氨酸 ) 的制备
分别将 3.0631g(0.01mol)ε- 苄氧羰基 -L- 赖氨酸 -N- 羧酸酐单体放入 4 个干燥 的反应瓶中， 分别加入 30mL 无水 N， N- 二甲基甲酰胺将所述单体溶解。在搅拌下分别加入 0.0020mol、 0.00007mol、 0.00003mol 和 0.00002mol 正己胺， 然后将得到的混合溶液在 25℃ 搅拌下反应 72h， 反应结束后， 将得到的反应溶液用 300mL 乙醚沉降、 过滤、 用乙醚洗涤三次 后， 25℃下真空干燥 24h， 分别得到聚 (ε- 苄氧羰基 -L- 赖氨酸 ) ；
取 1g 上述制备的聚 (ε- 苄氧羰基 -L- 赖氨酸 )， 分别在 25℃下用 10mL 三氟乙酸 溶解， 然后在搅拌条件下分别加入 3mL 溴化氢质量含量为 33％的溴化氢 / 冰醋酸溶液， 得到 反应混合液， 将所述反应混合液在 25℃下搅拌 1h， 将得到的产物用 150mL 乙醚沉降、 过滤、 用乙醚洗涤三次， 25℃下真空干燥 24h 后， 得到聚 (L- 赖氨酸 )， 结果参见表 1。
对实施例 1 制备的聚 (L- 赖氨酸 ) 进行核磁共振分析， 结果参见图 1， 图 1 为本 发明实施例 1 提供的聚 (L- 赖氨酸 ) 的核磁共振氢谱图， 其中， 曲线 A 为聚 (ε- 苄氧羰 基 -L- 赖氨酸 ) 的核磁共振氢谱图 ； 曲线 B 为聚 (L- 赖氨酸 ) 的核磁共振氢谱图 ； 对实施 例 1 聚 (L- 赖氨酸 ) 进行红外分析， 结果参见图 2， 图 2 为本发明实施例 1 提供的聚 (L- 赖 氨酸 ) 的红外谱图， 其中， 曲线 A 为聚 (ε- 苄氧羰基 -L- 赖氨酸 ) 的红外谱图 ； 曲线 B 为聚 (L- 赖氨酸 ) 的红外谱图 ； 由图 1 和图 2 可知， 本发明得到了聚 (L- 赖氨酸 )。表 1 本发明实施例 1 ～ 4 提供的聚 (L- 赖氨酸 ) 的数均分子量表 1 中， A/I 为 ε- 苄氧羰基 -L- 赖氨酸 -N- 羧酸酐与正己胺的摩尔投料比 ； Mn1 为 1 聚 (ε- 苄氧羰基 -L- 赖氨酸 ) 的数均分子量， 由 H NMR 测试得到 ； DP 为由数均分子量计算 得到的聚 (ε- 苄氧羰基 -L- 赖氨酸 ) 的平均聚合度 ； 反应产率 1 为聚 (ε- 苄氧羰基 -L- 赖 氨酸 ) 的反应产率 ； Mn2 为聚 (L- 赖氨酸 ) 的数均分子量， 由 1H NMR 测试得到 ； 反应产率 2 为 聚 (L- 赖氨酸 ) 的反应产率。
实施例 5
称取 580.0mg(0.001mol) 阿霉素· 盐酸盐、 156.1mg(0.001mol) 顺 -3- 羧基戊烯二 酸酐和 101.2mg(0.001mol) 三乙胺放入干燥的反应瓶中， 加入 5mL 无水 N， N- 二甲基甲酰胺 溶解， 在 25℃、 搅拌子搅拌条件下反应 24h， 反应结束后， 将得到的反应混合液倒入 100mL 的 乙酸乙酯中稀释， 用饱和氯化钠水溶液洗涤， 干燥， 过滤， 浓缩得到羧基化的阿霉素衍生物。
对所述羧基化的阿霉素衍生物进行核磁共振分析， 结果参见图 3， 图 3 为本发明实 施例 5 得到的羧基化阿霉素衍生物的核磁共振氢谱图 ； 对所述羧基化的阿霉素衍生物进行 红外分析， 结果参见图 4， 图 4 为本发明实施例 5 得到的羧基化阿霉素衍生物的红外分析谱 图， 由图 3 和图 4 可知， 本发明实施例制备的羧基化阿霉素衍生物具有式 (IV-d) 结构。
实施例 6 羧基化的阿霉素衍生物的合成
称取 580.0mg(0.001mol) 阿霉素· 盐酸盐、 152.2mg(0.001mol)1， 2- 二羧基环己烯 酸酐和 101.2mg(0.001mol) 三乙胺放入干燥反应瓶中， 加入 5mL 无水 N， N- 二甲基甲酰胺溶 解， 在 25℃、 搅拌子搅拌条件下反应 24h， 反应结束后， 将得到的反应混合液倒入 100mL 的乙 酸乙酯中稀释， 用饱和氯化钠水溶液洗涤、 干燥、 过滤、 浓缩后得到羧基化的阿霉素衍生物。
对所述羧基化的阿霉素衍生物进行核磁共振分析和红外分析， 结果表明， 本发明 实施例制备的羧基化阿霉素衍生物具有式 (IV-a) 结构。
实施例 7 羧基化的阿霉素衍生物的合成
称取 580.0mg(0.001mol) 阿霉素· 盐酸盐、 126.1mg(0.001mol)2， 3- 二甲基马来酸 酐和 101.2mg(0.001mol) 三乙胺放入干燥的反应瓶中， 加入 5mL 无水 N， N- 二甲基甲酰胺溶 解， 在 25℃、 搅拌子搅拌条件下反应 24h， 反应结束后， 把得到的反应混合液倒入 100mL 的乙 酸乙酯中稀释， 用饱和氯化钠水溶液洗涤、 干燥、 过滤、 浓缩得到羧基化的阿霉素衍生物。
对所述羧基化的阿霉素衍生物进行核磁共振分析和红外分析， 结果表明， 本发明 实施例制备的羧基化阿霉素衍生物具有式 (IV-b) 结构。
实施例 8
称取 580.0mg(0.001mol) 阿霉素· 盐酸盐， 156.2mg(0.001mol)2， 2， 3， 3- 四甲基丁
二酸酐和 101.2mg(0.001mol) 三乙胺放入干燥的反应瓶中， 加入 5mL 无水 N， N- 二甲基甲酰 胺溶解， 在 25℃， 搅拌子搅拌条件下反应 24h， 反应结束后， 把得到的反应混合液倒入 100mL 的乙酸乙酯中稀释， 用饱和氯化钠水溶液洗涤， 干燥， 过滤， 浓缩得到羧基化的阿霉素衍生 物。
对所述羧基化的阿霉素衍生物进行核磁共振分析和红外分析， 结果表明， 本发明 实施例制备的羧基化阿霉素衍生物具有式 (IV-c) 结构。
实施例 9 ～ 12 不同数均分子量的羧基化聚乙二醇单甲醚的制备
分 别 称 取 5g 数 均 分 子 量 为 500(0.01mol)、 1000(0.005mol)、 2000(0.0025mol) 和 5000(0.001mol) 的聚乙二醇单甲醚， 放入 4 个反应瓶中， 然后每个反应瓶中分别加入 5.0035g(0.05mol)、 2.5018g(0.025mol)、 1.2509g(0.0125mol) 和 0.5004g(0.005mol) 的丁 二酸酐， 然后分别加入 50mL 吡啶溶解得到溶液， 在 25℃、 搅拌子搅拌条件下反应 24h， 反应 结束后， 将得到的反应产物用乙醚沉降、 过滤、 洗涤、 25℃下真空干燥 24h 后， 得到羧基化聚 乙二醇单甲醚， 结果参见表 2。
表 2 本发明实施例 9 ～ 12 制备的羧基化聚乙二醇单甲醚的数均分子量
表 2 中， Mn 为羧基化聚乙二醇单甲醚的数均分子量， 由 1H NMR 测试得到。
实施例 13 ～ 15 高分子阿霉素键合药的合成
分 别 称 取 3 份 0.1630g(0.0000776mol) 实 施 例 11 制 备 的 羧 基 化 的 聚 乙 二 醇 单 甲 醚， 分 别 与 0.2598g(0.000388mol) 实 施 例 7 制 备 的 羧 基 化 的 阿 霉 素 衍 生 物、 0.2715g(0.000388mol) 实施例 8 制备的羧基化的阿霉素衍生物和 0.2715g(0.000388mol) 实施例 5 制备的羧基化的阿霉素衍生物混合 ； 然后分别加入 0.4463g1-(3- 二甲氨基丙 基 )-3- 乙基碳二亚胺· 盐酸盐和 0.1072gN- 羟基琥珀酰亚胺， 放入 3 个反应瓶中， 加入 5mL 二甲基亚砜溶解反应体系， 搅拌子搅拌条件下反应 24h， 然后， 分别加入 1mL 浓度为 0.1g -1 mL 的实施例 2 制备的聚 (L- 赖氨酸 )， 搅拌子搅拌条件下继续反应 24h， 反应结束后， 将得 到的反应混合物用截留分子量为 3500Dalton 的透析袋透析 24h， 冻干， 分别得到高分子阿 霉素键合药。
对实施例 13 制备的高分子阿霉素键合药进行核磁共振分析， 结果参见图 5， 图5为 本发明实施例 13 得到的高分子阿霉素键合药的核磁共振氢谱图 ； 对所述高分子阿霉素键 合药进行红外分析， 结果参见图 6， 图 6 为本发明实施例 13 得到的高分子阿霉素键合药的 红外分析谱图， 由图 5 和图 6 可知， 本发明实施例制备的高分子阿霉素键合药具有式 (I) 结 构， 其中， i 为 0.5， j 为 0.1， k 为 0.4。
实施例 16 ～ 19 高分子阿霉素键合药的合成
分 别 将 0.1448g(0.00006897mol)、 0.1630g(0.0000776mol)、
0.1635g(0.00007784mol) 和 0.1636g(0.00007792mol) 实 施 例 11 制 备 的 羧 基 化 的 聚 乙 二醇单甲醚； 0.2399g(0.000345mol)、 0.2699g(0.000388mol)、 0.2707g(0.000389mol) 和 0.2710g(0.00039mol) 实施例 6 制备的羧基化的阿霉素衍生物 ； 0.3966g、 0.4463g、 0.4476g 和 0.4481g1-(3- 二甲氨基丙基 )-3- 乙基碳二亚胺·盐酸盐和 0.0952g、 0.1072g、 0.1075g 和 0.1076gN- 羟基琥珀酰亚胺， 放入 4 个反应瓶中， 加入 5mL 二甲基亚砜溶解反应体系， 搅 -1 拌子搅拌条件下反应 24h， 然后分别加入 1mL 浓度为 0.1g mL 实施例 1 制备的聚 (L- 赖 氨 酸 )(0.0006897mol， -NH2)、 实 施 例 2 制 备 的 聚 (L- 赖 氨 酸 )(0.000776mol， -NH2)、 实 施例 3 制备的聚 (L- 赖氨酸 )(0.0007784mol， -NH2) 和实施例 4 制备的聚 (L- 赖氨酸 ) (0.0007792mol， -NH2)， 搅拌子搅拌条件下继续反应 24h， 反应结束后， 分别将得到的反应混 合液用截留分子量为 3500Dalton 的透析袋透析 24h， 冻干， 分别得到高分子阿霉素键合药 ；
分别对所述高分子阿霉素键合药进行核磁共振分析和红外分析， 结果表明， 其均 具有式 (I) 结构， 其中， i 均为 0.5， j 均为 0.1， k 均为 0.4。
实施例 20 ～ 22 分子阿霉素键合药的合成
称 取 0.0815g(0.0000388mol)， 0.2445g(0.0001164mol) 和 0.3259g(0.0001552mol) 实 施 例 11 制 备 的 羧 基 化 聚 乙 二 醇 单 甲 醚，分 别 与 0.2699g(0.000388mol) 实施例 6 制备的羧基化的阿霉素衍生物混合后， 分别加入 0.4091g、 0.4835g 和 0.5207g1-(3- 二甲氨基丙基 )-3- 乙基碳二亚胺·盐酸盐和 0.0982g、 0.1161g 和 0.125gN- 羟基琥珀酰亚胺， 放入 3 个反应瓶中， 加入 5mL 二甲基亚砜溶解反应体系， 搅拌 -1 子搅拌条件下反应 24h， 然后， 分别加入 1mL 浓度为 0.1g mL 实施例 2 制备的聚 (L- 赖氨 酸 )(0.000776mol， -NH2)， 搅拌子搅拌条件下继续反应 24h， 反应结束后， 将得到的反应混合 物用截留分子量为 3500Dalton 的透析袋透析 24h， 冻干， 得到高分子阿霉素键合药。
分别对所述高分子阿霉素键合药进行核磁共振分析和红外分析， 结果表明， 其均 具有式 (I) 结构， 其中， i、 j、 k 取值见表 3。
表 3 本发明实施例 20 ～ 22 制备得到的高分子阿霉素键合药 i、 j、 k 取值
实施例 23 ～ 25 高分子阿霉素键合药的合成
称取 3 份 0.1630g(0.0000776mol) 实施例 11 制备的羧基化的聚乙二醇单甲醚 ； 分 别与 0.054g(0.0000776mol， 0.2159g(0.0003104mol) 和 0.4319g(0.0006208mol) 实施例 6 制备的羧基化的阿霉素衍生物混合 ； 再分别加入 0.1488g、 0.3719g 和 0.6695g1-(3- 二甲氨 基丙基 )-3- 乙基碳二亚胺· 盐酸盐和 0.0357g、 0.0893g 和 0.1608gN- 羟基琥珀酰亚胺， 放 入 3 个反应瓶中， 加入 5mL 二甲基亚砜溶解反应体系， 搅拌子搅拌条件下反应 24h， 然后， 分 -1 别加入 1mL 浓度为 0.1g mL 的实施例 2 制备的聚 (L- 赖氨酸 )(0.000776mol， -NH2)， 搅拌子 搅拌条件下继续反应 24h， 反应结束后， 将得到的反应混合物用截留分子量为 3500Dalton 的透析袋透析 24h， 冻干， 得到高分子阿霉素键合药。
分别对所述高分子阿霉素键合药进行核磁共振分析和红外分析， 结果表明， 其均 具有式 (I) 结构， 其中， i、 j、 k 取值见表 4。
表 4 本发明实施例 23 ～ 25 制备得到的高分子阿霉素键合药 i、 j、 k 取值
实施例 26 ～ 28 高分子阿霉素键合药的合成
分 别 称 取 0.0466g(0.0000776mol) 实 施 例 9 制 备 的 羧 基 化 聚 乙 二 醇 单 甲 醚， 0.0854g(0.0000776mol) 实 施 例 10 制 备 的 羧 基 化 聚 乙 二 醇 单 甲 醚 和 0.3958g(0.0000776mol) 实 施 例 12 制 备 的 羧 基 化 聚 乙 二 醇 单 甲 醚 ； 分别与 0.2699g(0.000388mol) 实 施 例 6 制 备 的 羧 基 化 的 阿 霉 素 衍 生 物 混 合 ； 分别加入 0.4463g1-(3- 二甲氨基丙基 )-3- 乙基碳二亚胺· 盐酸盐和 0.1072gN- 羟基琥珀酰亚胺， 放 入 3 个反应瓶中， 加入 5mL 二甲基亚砜溶解反应体系， 搅拌子搅拌条件下反应 24h， 然后分别 -1 -NH2)， 搅拌子搅 加入 1mL 浓度为 0.1g mL 实施例 2 制备的聚 (L- 赖氨酸 )(0.000776mol， 拌条件下继续反应 24h， 反应结束后， 反应体系用截留分子量为 3500Dalton 的透析袋透析 24h， 冻干， 得到高分子阿霉素键合药。
分别对所述高分子阿霉素键合药进行核磁共振分析和红外分析， 结果表明， 其均 具有式 (I) 结构， 其中， i 均为 0.5， j 均为 0.1， k 均为 0.4。
实施例 29 ～ 32 高分子阿霉素键合药的合成
称 取 4 份 0.1303g(0.00006205mol) 实 施 例 11 制 备 的 羧 基 化 的 聚 乙 二 醇 单 甲 醚； 分别与 0.2158g(0.0003103mol) 实施例 6 制备的羧基化的阿霉素衍生物混合 ； 再分 别加入 0.3569g1-(3- 二甲氨基丙基 )-3- 乙基碳二亚胺· 盐酸盐和 0.0857gN- 羟基琥 珀酰亚胺， 放入 4 个反应瓶中， 加入 5mL 二甲基亚砜溶解反应体系， 搅拌子搅拌条件下反 -1 应 24h， 然后， 分别加入 1mL 浓度为 0.1g mL 的数均分子量为 1000(0.000621mol， -NH2)、 20000(0.000621mol， -NH2)、 40000(0.000621mol， -NH2) 和 60000(0.000621mol， -NH2) 的脱 乙酰度为 100％的壳聚糖， 搅拌子搅拌条件下继续反应 24h， 反应结束后， 将得到的反应混 合物用截留分子量为 3500Dalton 的透析袋透析 24h， 冻干， 得到高分子阿霉素键合药。
分别对所述高分子阿霉素键合药进行核磁共振分析和红外分析， 结果表明， 其均 具有式 (II) 结构， 其中， i 均为 0.5， j 均为 0.1， k 均为 0.4。
实施例 33 ～ 35 高分子阿霉素键合药的合成
分 别 称 取 0.0652g(0.0000310mol) 、 0.1955g(0.0000931mol) 和 0.2606g(0.0001241mol) 实 施 例 11 制 备 的 羧 基 化 的 聚 乙 二 醇 单 甲 醚 ； 分别与 0.2158g(0.000310mol) 实 施 例 6 制 备 的 羧 基 化 的 阿 霉 素 衍 生 物 混 合 ； 然后分别加入 0.3271g、 0.3866g 和 0.4163g1-(3- 二甲氨基丙基 )-3- 乙基碳二亚胺· 盐酸盐和 0.0786g、 0.0928g 和 0.1gN- 羟基琥珀酰亚胺， 放入 3 个反应瓶中， 加入 5mL 二甲基亚砜溶解反应 体系， 搅拌子搅拌条件下反应 24h， 然后， 分别加入 1mL 浓度为 0.1g mL-1 的数均分子量为
20000(0.000621mol， -NH2) 的脱乙酰度为 100％的壳聚糖， 搅拌子搅拌条件下继续反应 24h， 反应结束后， 将得到的反应混合物用截留分子量为 3500Dalton 的透析袋透析 24h， 冻干， 分 别得到高分子阿霉素键合药。
分别对所述高分子阿霉素键合药进行核磁共振分析和红外分析， 结果表明， 其均 具有式 (II) 结构， 其中， i、 j、 k 取值见表 5。
表 5 本发明实施例 33 ～ 35 制备得到的高分子阿霉素键合药 i、 j、 k 取值
实施例 36 ～ 38 高分子阿霉素键合药的合成
称取 3 份 0.1303g(0.00006205mol) 实施例 11 制备的羧基化的聚乙二醇单甲醚 ； 分 别 与 0.0432g(0.00006205mol)、 0.1727g(0.0002482mol) 和 0.3453g(0.0004964mol) 实施例 6 制备的羧基化的阿霉素衍生物混合； 分 别 继 续 加 入 0.119g、 0.2973g 和 0.5353g1-(3- 二 甲 氨 基 丙 基 )-3- 乙 基 碳 二 亚 胺· 盐 酸 盐 和 0.0286g、 0.0714g 和 0.1285gN- 羟基琥珀酰亚胺， 放入 3 个反应瓶中， 加入 5mL 二甲基亚砜溶解反应体系， 搅 拌 子 搅 拌 条 件 下 反 应 24h， 然 后， 分 别 加 入 1mL 浓 度 为 0.1g mL-1 的 数 均 分 子 量 为 20000(0.000621mol， -NH2) 的脱乙酰度为 100％的壳聚糖， 搅拌子搅拌条件下继续反应 24h， 反应结束后， 将得到反应混合液用截留分子量为 3500Dalton 的透析袋透析 24h， 冻干， 得到 高分子阿霉素键合药。
分别对所述高分子阿霉素键合药进行核磁共振分析和红外分析， 结果表明， 其均 具有式 (II) 结构， 其中， i、 j、 k 取值见表 6。
表 6 本发明实施例 36 ～ 38 制备得到的高分子阿霉素键合药 i、 j、 k 取值
实施例 39 ～ 41 高分子阿霉素键合药的合成
分 别 称 取 0.0372g(0.0000621mol) 实 施 例 9 制 备 的 羧 基 化 聚 乙 二 醇 单 甲 醚、 0.0683g(0.0000621mol) 实 施 例 10 制 备 的 羧 基 化 聚 乙 二 醇 单 甲 醚、 和 0.3165g(0.0000621mol 实 施 例 12 制 备 的 羧 基 化 的 聚 乙 二 醇 单 甲 醚 ； 分别与 0.2158g(0.000310mol) 实 施 例 6 制 备 的 羧 基 化 的 阿 霉 素 衍 生 物 混 合 ； 继续分别加入 0.3569g1-(3- 二甲氨基丙基 )-3- 乙基碳二亚胺·盐酸盐和 0.857gN- 羟基琥珀酰亚胺， 放 入 3 个反应瓶中， 加入 5mL 二甲基亚砜溶解反应体系， 搅拌子搅拌条件下反应 24h， 然后， -1 分别加入 1mL 浓度为 0.1g mL 的数均分子量为 20000(0.000621mol， -NH2) 的脱乙酰度为 100％的壳聚糖， 搅拌子搅拌条件下继续反应 24h， 反应结束后， 将得到的反应产物用截留分
子量为 3500Dalton 的透析袋透析 24h， 冻干， 得到高分子阿霉素键合药。
分别对所述高分子阿霉素键合药进行核磁共振分析和红外分析， 结果表明， 其均 具有式 (II) 结构， 其中， i 为 0.5， j 为 0.1， k 为 0.4。
实施例 42 ～ 43 高分子阿霉素键合药的合成
称 取 3 份 0.1303g(0.00006205mol) 实 施 例 11 制 备 的 羧 基 化 的 聚 乙 二 醇 单甲醚； 分 别 与 0.2078g(0.000310mol) 实 施 例 7 制 备 的 羧 基 化 的 阿 霉 素 衍 生 物、 0.2171g(0.000310mol) 实施例 8 制备的羧基化的阿霉素衍生物和 0.2171g(0.000310mol) 实施例 5 制备的羧基化的阿霉素衍生物混合 ； 再分别继续加入 0.3569g1-(3- 二甲氨基丙 基 )-3- 乙基碳二亚胺· 盐酸盐和 0.857gN- 羟基琥珀酰亚胺， 放入 3 个反应瓶中， 加入 5mL 二 甲基亚砜溶解反应体系， 搅拌子搅拌条件下反应 24h， 然后， 分别加入 1mL 浓度为 0.1g mL-1 的数均分子量为 20000(0.000621mol， -NH2) 的脱乙酰度为 100％的壳聚糖， 搅拌子搅拌条件 下继续反应 24h， 反应结束后， 将得到的反应产物用截留分子量为 3500Dalton 的透析袋透 析 24h， 冻干， 得到高分子阿霉素键合药。
分别对所述高分子阿霉素键合药进行核磁共振分析和红外分析， 结果表明， 其均 具有式 (II) 结构， 其中， i 为 0.5， j 为 0.1， k 为 0.4。
实施例 44
将实施例 13 制备的高分子阿霉素键合药分别在 pH 值为 5.5、 6.8 和 7.4 的情况下 进行药物释放， 结果参见图 7， 图 7 为本发明实施例提供的高分子阿霉素键合药的累积释放 曲线。由图 7 可知， 本发明提供的高分子阿霉素键合药具有 pH 响应性， 包裹在纳米粒子内 部的阿霉素在肿瘤组织或肿瘤细胞内的 pH 值条件下可以快速释放， 从而增强药物效果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式， 应当指出， 对于本技术领域的普通技术人 员来说， 在不脱离本发明原理的前提下， 还可以做出若干改进和润饰， 这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。