一种新的硫酸依替米星有关物质的检测方法.pdf

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摘要
申请专利号:

CN201010297029.2

申请日:

2010.09.29

公开号:

CN102435679A

公开日:

2012.05.02

当前法律状态:

授权

有效性:

有权

法律详情:

授权|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 30/02申请日:20100929|||公开

IPC分类号:

G01N30/02; G01N30/26; G01N30/34

主分类号:

G01N30/02

申请人:

无锡济民可信山禾药业股份有限公司; 江西济民可信集团有限公司

发明人:

吴凌云; 汪豪; 张智杰; 夏冰; 俞婷; 易斌

地址:

214028 江苏省无锡市新区长江南路12号

优先权:

专利代理机构:

代理人:

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内容摘要

本发明涉及一种新的氨基糖苷类抗生素硫酸依替米星有关物质的检测方法,该方法包括以下步骤:精密称取硫酸依替米星有关物质对照品各适量,分别加水制成一定浓度的对照品储备溶液;精密吸取以上各氨基糖苷有关物质对照品储备液各适量,转移至同一容量瓶中,加水稀释至刻度,制备成氨基糖苷杂质混合对照品溶液,流动相:A相:水-氨水-冰醋酸(96∶3.6∶0.4),B相:甲醇。采用梯度洗脱的方法,用HPLC-ELSD进行测定,面积归一化法计算其含量。

权利要求书

1: 一种硫酸依替米星杂质含量检测方法, 其特征在于, 经过以下步骤 : 精密称取氨基 糖苷有关物质 ETM-10, ETM-7, ETM-12, ETM-6, ETM-5, ETM-3 对照品各适量, 分别加水制成 每 1ml 分别含相关杂质约 0.001-10mg 的对照品储备溶液 ; 精密吸取以上各有关物质对照品 储备溶液适量, 转移至同一容量瓶中, 加水稀释至刻度, 制备成有关物质混合对照品溶液, 其中各有关物质浓度为 1-1000μg/ml, 色谱柱 : Gemini NX C18(4.6mm×150mm, 5μm) ; 流动 相: A相: 水 - 氨水 - 冰醋酸 (98 ~ 75 ∶
2: 0 ~ 5.0 ∶ 0.1 ~ 1.0), B相: 甲醇, 采用梯度洗 脱的方法, 用 HPLC-ELSD 进行测定, 面积归一化法计算其含量。 流动相梯度 2. 如权利要求 1 所述的检测方法, 有关物质对照品储备溶液的浓度为 0.001-10mg。
3: 如权利要求 1 所述的检测方法, 有关物质混合对照品溶液的浓度为 1-1000μg/ml。 4. 如权利要求 1 所述的检测方法, 检测用流动相由 A 相和 B 相组成, 其中 A 相 : 水-氨 水 - 冰醋酸 (98 ~ 75 ∶ 2.0 ~ 5.0 ∶ 0.1 ~ 1.0), B相: 甲醇。 5. 如权利要求 1 所述的检测方法, 采用梯度洗脱的方法, 流动相梯度为 : 流动相梯度 6. 如权利要求 1 所述的检测方法, 采用 HPLC-ELSD 进行测定, 面积归一化法计算其含 量。 7. 如权利要求 1 所述的检测方法, 其特征在于, 经过以下步骤 : 精密称取氨基糖苷有关物质对照品 (ETM-10, ETM-7, ETM-12, ETM-6, ETM-5, ETM-3 ; 均 从原料药硫酸依替米星中分离得到, 纯度均> 95% ) 各适量, 分别加水制成每 1ml 分别含 相关杂质约 0.001-10mg 的对照品储备溶液 ; 精密吸取以上各氨基糖苷有关物质对照品储 备液各适量, 转移至同一容量瓶中, 加水稀释至刻度, 制备成氨基糖苷类有关物质混合对照 2 品溶液, 其中各有关物质浓度为 1-500μg/ml)。色谱柱 : Gemini NX C18(4.6mm×150mm, 5μm)。流动相 : A相: 水 - 氨水 - 冰醋酸 (98 ~ 85 ∶ 2.0 ~ 4.0 ∶ 0.1 ~ 0.5), B相: 甲 醇。采用梯度洗脱的方法, 用 HPLC-ELSD 进行测定, 面积归一化法计算其含量。 8. 如权利要求 1 所述的检测方法, 其特征在于, 经过以下步骤 : 精密称取氨基糖苷有关物质对照品 (ETM-10, ETM-7, ETM-12, ETM-6, ETM-5, ETM-3 ; 均 从原料药硫酸依替米星中分离得到, 纯度均> 95% ) 各适量, 分别加水制成每 1ml 分别含 相关杂质约 0.001-10mg 的对照品储备溶液 ; 精密吸取以上各氨基糖苷有关物质对照品储 备液各适量, 转移至同一容量瓶中, 加水稀释至刻度, 制备成氨基糖苷类有关物质混合对照 品溶液, 其中各有关物质浓度为 10-300μg/ml)。色谱柱 : Gemini NX C18(4.6mm×150mm, 5μm)。流动相 : A相: 水 - 氨水 - 冰醋酸 (96 ∶ 3.6 ∶ 0.4), B相: 甲醇。采用梯度洗脱的 方法, 用 HPLC-ELSD 进行测定, 面积归一化法计算其含量。 流动相梯度 在上述的方法中一般可以采用如下的色谱条件 ; 流速 0.8ml/min ; 柱温 : 30℃ ; 进样量 : 10μl ; ELSD 参数 : 漂移管温度 : 105℃ ; 载气流速 : 2.6L/min ; Gain 值 : 1。
4: 6mm×150mm, 5μm) ; 流动 相: A相: 水 - 氨水 - 冰醋酸 (98 ~ 75 ∶ 2.0 ~
5: 0 ∶ 0.1 ~ 1.0), B相: 甲醇, 采用梯度洗 脱的方法, 用 HPLC-ELSD 进行测定, 面积归一化法计算其含量。 流动相梯度 2. 如权利要求 1 所述的检测方法, 有关物质对照品储备溶液的浓度为 0.001-10mg。 3. 如权利要求 1 所述的检测方法, 有关物质混合对照品溶液的浓度为 1-1000μg/ml。 4. 如权利要求 1 所述的检测方法, 检测用流动相由 A 相和 B 相组成, 其中 A 相 : 水-氨 水 - 冰醋酸 (98 ~ 75 ∶ 2.0 ~ 5.0 ∶ 0.1 ~ 1.0), B相: 甲醇。 5. 如权利要求 1 所述的检测方法, 采用梯度洗脱的方法, 流动相梯度为 : 流动相梯度
6: 如权利要求 1 所述的检测方法, 采用 HPLC-ELSD 进行测定, 面积归一化法计算其含 量。
7: 如权利要求 1 所述的检测方法, 其特征在于, 经过以下步骤 : 精密称取氨基糖苷有关物质对照品 (ETM-10, ETM-7, ETM-12, ETM-6, ETM-5, ETM-3 ; 均 从原料药硫酸依替米星中分离得到, 纯度均> 95% ) 各适量, 分别加水制成每 1ml 分别含 相关杂质约 0.001-10mg 的对照品储备溶液 ; 精密吸取以上各氨基糖苷有关物质对照品储 备液各适量, 转移至同一容量瓶中, 加水稀释至刻度, 制备成氨基糖苷类有关物质混合对照 2 品溶液, 其中各有关物质浓度为 1-500μg/ml)。色谱柱 : Gemini NX C18(4.6mm×150mm, 5μm)。流动相 : A相: 水 - 氨水 - 冰醋酸 (98 ~ 85 ∶ 2.0 ~ 4.0 ∶ 0.1 ~ 0.5), B相: 甲 醇。采用梯度洗脱的方法, 用 HPLC-ELSD 进行测定, 面积归一化法计算其含量。
8: 如权利要求 1 所述的检测方法, 其特征在于, 经过以下步骤 : 精密称取氨基糖苷有关物质对照品 (ETM-10, ETM-7, ETM-12, ETM-6, ETM-5, ETM-3 ; 均 从原料药硫酸依替米星中分离得到, 纯度均> 95% ) 各适量, 分别加水制成每 1ml 分别含 相关杂质约 0.001-10mg 的对照品储备溶液 ; 精密吸取以上各氨基糖苷有关物质对照品储 备液各适量, 转移至同一容量瓶中, 加水稀释至刻度, 制备成氨基糖苷类有关物质混合对照 品溶液, 其中各有关物质浓度为 10-300μg/ml)。色谱柱 : Gemini NX C18(4.6mm×150mm, 5μm)。流动相 : A相: 水 - 氨水 - 冰醋酸 (96 ∶ 3.6 ∶ 0.4), B相: 甲醇。采用梯度洗脱的 方法, 用 HPLC-ELSD 进行测定, 面积归一化法计算其含量。 流动相梯度 在上述的方法中一般可以采用如下的色谱条件 ; 流速 0.8ml/min ; 柱温 : 30℃ ; 进样量 : 10μl ; ELSD 参数 : 漂移管温度 : 105℃ ; 载气流速 : 2.6L/min ; Gain 值 : 1。

说明书


一种新的硫酸依替米星有关物质的检测方法

    技术领域 :
     本发明涉及一种新的氨基糖苷类抗生素硫酸依替米星有关物质的检测方法。 具体 的讲是一种新的采用 HPLC-ELSD 仪器、 采用梯度洗脱的方法检测硫酸依替米星有关物质的 方法。 背景技术 :
     硫酸依替米星 (Etimicin sulfate) 是我国科研人员自行研制的, 拥有自主知识产 权的高效、 低毒、 抗耐药菌的新一代半合成氨基糖苷类抗生素, 是唯一获得国家一类新药证 书的抗感染药物。
     硫酸依替米星注射液适用于对其敏感的大肠杆菌、 克雷伯氏肺炎杆菌、 沙雷氏杆 菌属、 枸橼酸杆菌、 肠杆菌属、 不动杆菌属、 变形杆菌属、 嗜血流感杆菌、 绿脓杆菌和葡萄球 菌等引起的各种感染。临床研究显示本品对以下感染有较好的疗效 : 呼吸道感染 : 如急性 支气管炎、 慢性支气管炎急性发作、 社区肺部感染等。肾脏和泌尿生殖系统感染 : 如急性肾 盂肾炎、 膀胱炎、 慢性肾盂肾炎或慢性膀胱炎急性发作等。皮肤软组织和其它感染 : 如皮肤 及软组织感染, 外伤、 创伤和手术产后的感染及其他敏感菌感染。
     目 前, 生产硫酸依替米星使用的工艺均为专利报道的工艺 ( 申请号: 93112412.3)。其主要步骤为 : 庆大霉素 C1a 碱在溶剂中加入醋酸钴、 乙酸酐, 生成 3, 2, , 6, - 三 -N- 乙酰基庆大霉素 C1a(P1), 经过提取浓缩, 浓缩液通入硫化氢气体除去钴离子, 得到纯度为 90% -95%的 P1, 然后加入乙醛, 在 0-5℃冰水浴中用还原剂氢化, 得到 3, 2, , 6, - 三 -N- 乙酰基 -1-N 乙基庆大霉素 C1a(P2), 经吸附型大孔树脂分离后得到纯度较高的 P2, 纯度较高的 P2 加入 1N 的氢氧化钠溶液, 水解回流 48 小时, 水解液经吸附型大孔树脂分 离得到纯度为 90%以上的 1-N- 乙基庆大霉素 C1a( 依替米星 ) 溶液, 加酸成盐, 活性炭脱 色, 冷冻干燥, 即得依替米星盐。
     硫酸依替米星是一种多结构产品, 生产中难于提纯, 主要杂质为 : ETM-10, ETM-7, ETM-12, ETM-6, ETM-5, ETM-3, 它们的结构分别为 :
     ETM-10 结构式 :
     ETM-7 结构式 :
     ETM-12 结构式 :
     ETM-6 结构式 :
     ETM-5 结构式 :
     ETM-3 结构式 :2010 版中国药典公开了一种硫酸依替米星有关物质的测定方法, 该方法采用 HPLC 法, 用 0.2mol/L 三氟乙酸 - 甲醇 (84 ∶ 16) 作为流动相, 但这个流动相腐蚀性过强, 有 关物质检测的灵敏度和准确度偏低, 且三氟乙酸不适用于 LC-MS 测定, 影响后续一些研究 工作的开展。
     本发明通过对流动相的缓冲体系、 梯度条件及 ELSD 参数进行优化, 建立了依替米 星的有关物质定量分析的色谱条件, 提供一种全新的有关物质检测方法。本发明所述的方 法, 其流动相腐蚀性低, 灵敏度和准确度高, 并且不干扰后续的 LC-MS 测定, 为依替米星后 续的一些研究工作开展创造有利条件。
     发明内容 : 本发明提供一种硫酸依替米星杂质含量检测方法 : 该方法步骤如下 : 精密称取 氨基糖苷有关物质对照品 (ETM-10, ETM-7, ETM-12, ETM-6, ETM-5, ETM-3 ; 均从原料药硫 酸依替米星中分离得到, 纯度均> 95% ) 各适量, 分别加水制成每 1ml 分别含相关杂质约 0.001-10mg 的对照品储备溶液 ; 精密吸取以上各氨基糖苷有关物质对照品储备液各适量, 转移至同一容量瓶中, 加水稀释至刻度, 制备成氨基糖苷类有关物质混合对照品溶液, 其中 各有关物质浓度为 1-1000μ g/ml)。色谱柱 : Gemini NX C18(4.6mm×150mm, 5μm)。流动 相: A相: 水 - 氨水 - 冰醋酸 (98 ~ 75 ∶ 2.0 ~ 5.0 ∶ 0.1 ~ 1.0), B相: 甲醇。采用梯度 洗脱的方法, 用 HPLC-ELSD 进行测定, 面积归一化法计算其含量。
     优选的 :
     精密称取氨基糖苷有关物质对照品 (ETM-10, ETM-7, ETM-12, ETM-6, ETM-5, ETM-3 ; 均从原料药硫酸依替米星中分离得到, 纯度均> 95% ) 各适量, 分别加水制成每 1ml 分别 含相关杂质约 0.001-10mg 的对照品储备溶液 ; 精密吸取以上各氨基糖苷有关物质对照品 储备液各适量, 转移至同一容量瓶中, 加水稀释至刻度, 制备成氨基糖苷类有关物质混合对 照品溶液, 其中各有关物质浓度为 1-500μg/ml)。色谱柱 : Gemini NX C18(4.6mm×150mm, 5μm)。流动相 : A相: 水 - 氨水 - 冰醋酸 (98 ~ 85 ∶ 2.0 ~ 4.0 ∶ 0.1 ~ 0.5), B相: 甲 醇。采用梯度洗脱的方法, 用 HPLC-ELSD 进行测定, 面积归一化法计算其含量。
     更优选的 :
     精密称取氨基糖苷有关物质对照品 (ETM-10, ETM-7, ETM-12, ETM-6, ETM-5, ETM-3 ; 均从原料药硫酸依替米星中分离得到, 纯度均> 95% ) 各适量, 分别加水制成每 1ml 分别 含相关杂质约 0.001-10mg 的对照品储备溶液 ; 精密吸取以上各氨基糖苷有关物质对照品 储备液各适量, 转移至同一容量瓶中, 加水稀释至刻度, 制备成氨基糖苷类有关物质混合
     对照品溶液, 其中各有关物质浓度为 10-300μg/ml)。流动相 : A相: 水 - 氨水 - 冰醋酸 (96 ∶ 3.6 ∶ 0.4), B相: 甲醇。采用梯度洗脱的方法, 用 HPLC-ELSD 进行测定, 面积归一化 法计算其含量。
     流动相梯度
     在上述的方法中一般可以采用如下的色谱条件 ;
     流速 0.8ml/min ;
     柱温 : 30℃ ;
     进样量 : 10μl ;
     ELSD 参数 :
     漂移管温度 : 105℃ ;
     载气流速 : 2.6L/min ;
     Gain 值 : 1。
     以下试验可以表明本发明上述的检测方法的优点以及该方法的优越的可行性、 准 确性和可靠性。
     一: 专属性试验
     取硫酸依替米星原料药适量, 精密称定, 加水溶解制成约 2mg/ml 的供试品溶液, 按照上述方法进行测定 ; 取有关物质对照品各适量, 精密称定, 加水溶解制成约 1 ~ 2mg/ml 的杂质对照品溶液。按照上述方法进行测定。测定图谱见图 1-7 :
     以上实验图谱检测表明, 采用该方法测定各硫酸依替米星有关物质的含量, 分离 度良好, 峰对称性良好, 无明显干扰。
     二: 精密度试验
     取以上氨基糖苷杂质混合对照品溶液, 按上述色谱条件, 连续进样 6 次, 进样量为 10μl, ETM-10 峰面积的 RSD 值为 2.73%, ETM-7 的 RSD 值为 1.84%, ETM-12 的 RSD 值为 1.70%, ETM-6 的 RSD 值为 1.72%, ETM-5 的 RSD 值为 1.45%, ETM-3 的 RSD 值为 1.93%, 结果见 Tab.2。
     Tab.2 精密度试验结果
     三: 定量限
     当样品峰高约为噪音的 10 倍, 即 S/N 为 10 的进样量作为定量限。6 个氨基糖苷杂 质对照品的定量限试验结果分别为 : ETM-10 : 100ng ; ETM-7 : 100ng ; ETM-12 : 250ng ; ETM-6 : 130ng ; ETM-5 : 130ng, ETM-3 : 150ng。
     四 . 线性关系考察 :
     取氨基糖苷杂质混合对照品溶液, 分别进样 1, 2, 5, 10, 20, 40μl, 以峰面积的对数 值为横坐标, 进样量 (μg) 的对数值为纵坐标, 绘制标准曲线, 6 个氨基糖苷有关物质的回 归方程分别为 :
     y = 0.6983x-2.1021, r = 0.9991(ETM-10) ;
     y = 0.6894x-2.1366, r = 0.9993(ETM-7) ;
     y = 0.7514x-2.1383, r = 0.9964(ETM-12) ;
     y = 0.7158x-2.1673, r = 0.9988(ETM-6) ;
     y = 0.7290x-2.2268, r = 0.9990(ETM-5) ;
     y = 0.7754x-2.1775, r = 0.9990(ETM-3)。
     标准曲线图分别见图 8- 图 13。
     五: 样品的有关物质含量测定
     取杂质混合对照品溶液、 供试品溶液, 按 2 项色谱条件进样分析 ( 进样体积为 10μl), 用外标法计算得到各氨基糖苷有关物质的含量。氨基糖苷有关物质混合对照品的 HPLC-ELSD 色谱图见 Fig.7, 硫酸依替米星 ( 样品 1) 的 HPLC-ELSD 色谱图见 Fig.8, 硫酸依 替米星 ( 样品 2) 的 HPLC-ELSD 色谱图见 Fig.9。氨基糖苷有关物质含量测定结果如下。
     硫酸依替米星的氨基糖苷杂质含量测定结果 ( 样品 1)
     硫酸依替米星的氨基糖苷杂质含量测定结果 ( 样品 2)附图说明 :
     图 1、 硫酸依替米星的 HPLC-ELSD 色谱图
     图 2、 有关物质 ETM-10 的 HPLC-ELSD 色谱图
     图 3、 有关物质 ETM-7 的 HPLC-ELSD 色谱图
     图 4、 有关物质 ETM-12 的 HPLC-ELSD 色谱图
     图 5、 有关物质 ETM-6 的 HPLC-ELSD 色谱图
     图 6、 有关物质 ETM-5 的 HPLC-ELSD 色谱图 图 7、 有关物质 ETM-3 的 HPLC-ELSD 色谱图 图 8、 ETM-10 的标准曲线图 图 9、 ETM-7 的标准曲线图 图 10、 ETM-12 的标准曲线图 图 11、 ETM-6 标准曲线图 图 12、 ETM-5 的标准曲线图 图 13、 ETM-3 的标准曲线图 图 14、 氨基糖苷有关物质混合对照品的 HPLC-ELSD 色谱图 [ETM-10(4.9min), ETM-7(5.4min), ETM-12(13.4min), ETM-6(19.3min), ETM-5(20.6min), ETM-3(27.9min)] 图 15、 硫酸依替米星 ( 样品 1) 的 HPLC-ELSD 色谱图 图 16、 硫酸依替米星 ( 样品 2) 的 HPLC-ELSD 色谱图具体实施方式 :
     以下通过实施例进一步说明本发明, 但不作为对本发明的限制。
     实施例 1
     精密称取氨基糖苷有关物质对照品 (ETM-10, ETM-7, ETM-12, ETM-6, ETM-5, ETM-3 ; 均从原料药硫酸依替米星中分离得到, 纯度均> 95% ) 各适量,分别加水制成每 1ml 分别 含相关杂质约 0.001-10mg 的对照品储备溶液 ; 精密吸取以上各氨基糖苷有关物质对照品 储备液各适量, 转移至同一容量瓶中, 加水稀释至刻度, 制备成氨基糖苷类有关物质混合对 照品溶液, 其中各有关物质浓度为 500μg/ml)。色谱柱 : Gemini NX C18(4.6mm×150mm, 5μm)。流动相 : A相: 水 - 氨水 - 冰醋酸 (96 ∶ 3.6 ∶ 0.4), B相: 甲醇。采用梯度洗脱的 方法, 用 HPLC-ELSD 进行测定, 面积归一化法计算其含量。
     实施例 2精密称取氨基糖苷有关物质对照品 (ETM-10, ETM-7, ETM-12, ETM-6, ETM-5, ETM-3 ; 均从原料药硫酸依替米星中分离得到, 纯度均> 95% ) 各适量, 分别加水制成每 1ml 分别 含相关杂质约 0.001-10mg 的对照品储备溶液 ; 精密吸取以上各氨基糖苷有关物质对照品 储备液各适量, 转移至同一容量瓶中, 加水稀释至刻度, 制备成氨基糖苷类有关物质混合对 照品溶液, 其中各有关物质浓度为 300μg/ml)。色谱柱 : Gemini NX C18(4.6mm×150mm, 5μm)。流动相 : A相: 水 - 氨水 - 冰醋酸 (96 ∶ 3.6 ∶ 0.4), B相: 甲醇。采用梯度洗脱的 方法, 用 HPLC-ELSD 进行测定, 面积归一化法计算其含量。

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1、(10)申请公布号 CN 102435679 A (43)申请公布日 2012.05.02 CN 102435679 A *CN102435679A* (21)申请号 201010297029.2 (22)申请日 2010.09.29 G01N 30/02(2006.01) G01N 30/26(2006.01) G01N 30/34(2006.01) (71)申请人 无锡济民可信山禾药业股份有限公 司 地址 214028 江苏省无锡市新区长江南路 12 号 申请人 江西济民可信集团有限公司 (72)发明人 吴凌云 汪豪 张智杰 夏冰 俞婷 易斌 (54) 发明名称 一种新的硫酸依替米星有关物。

2、质的检测方法 (57) 摘要 本发明涉及一种新的氨基糖苷类抗生素硫酸 依替米星有关物质的检测方法, 该方法包括以下 步骤 : 精密称取硫酸依替米星有关物质对照品各 适量, 分别加水制成一定浓度的对照品储备溶液 ; 精密吸取以上各氨基糖苷有关物质对照品储备液 各适量, 转移至同一容量瓶中, 加水稀释至刻度, 制备成氨基糖苷杂质混合对照品溶液, 流动相 : A 相 : 水 - 氨水 - 冰醋酸 (96 3.6 0.4), B 相 : 甲醇。 采用梯度洗脱的方法, 用HPLC-ELSD进行测 定, 面积归一化法计算其含量。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专。

3、利申请 权利要求书 2 页 说明书 7 页 附图 6 页 CN 102435685 A1/2 页 2 1. 一种硫酸依替米星杂质含量检测方法, 其特征在于, 经过以下步骤 : 精密称取氨基 糖苷有关物质 ETM-10, ETM-7, ETM-12, ETM-6, ETM-5, ETM-3 对照品各适量, 分别加水制成 每1ml分别含相关杂质约0.001-10mg的对照品储备溶液 ; 精密吸取以上各有关物质对照品 储备溶液适量, 转移至同一容量瓶中, 加水稀释至刻度, 制备成有关物质混合对照品溶液, 其中各有关物质浓度为1-1000g/ml, 色谱柱 : Gemini NX C18(4.6mm1。

4、50mm, 5m) ; 流动 相 : A 相 : 水 - 氨水 - 冰醋酸 (98 75 2.0 5.0 0.1 1.0), B 相 : 甲醇, 采用梯度洗 脱的方法, 用 HPLC-ELSD 进行测定, 面积归一化法计算其含量。 流动相梯度 2. 如权利要求 1 所述的检测方法, 有关物质对照品储备溶液的浓度为 0.001-10mg。 3. 如权利要求 1 所述的检测方法, 有关物质混合对照品溶液的浓度为 1-1000g/ml。 4. 如权利要求 1 所述的检测方法, 检测用流动相由 A 相和 B 相组成, 其中 A 相 : 水 - 氨 水 - 冰醋酸 (98 75 2.0 5.0 0.1 。

5、1.0), B 相 : 甲醇。 5. 如权利要求 1 所述的检测方法, 采用梯度洗脱的方法, 流动相梯度为 : 流动相梯度 6. 如权利要求 1 所述的检测方法, 采用 HPLC-ELSD 进行测定, 面积归一化法计算其含 量。 7. 如权利要求 1 所述的检测方法, 其特征在于, 经过以下步骤 : 精密称取氨基糖苷有关物质对照品 (ETM-10, ETM-7, ETM-12, ETM-6, ETM-5, ETM-3 ; 均 从原料药硫酸依替米星中分离得到, 纯度均 95 ) 各适量, 分别加水制成每 1ml 分别含 相关杂质约 0.001-10mg 的对照品储备溶液 ; 精密吸取以上各氨基糖。

6、苷有关物质对照品储 备液各适量, 转移至同一容量瓶中, 加水稀释至刻度, 制备成氨基糖苷类有关物质混合对照 权 利 要 求 书 CN 102435679 A CN 102435685 A2/2 页 3 品溶液, 其中各有关物质浓度为 1-500g/ml)。色谱柱 : Gemini NX C18(4.6mm150mm, 5m)。流动相 : A 相 : 水 - 氨水 - 冰醋酸 (98 85 2.0 4.0 0.1 0.5), B 相 : 甲 醇。采用梯度洗脱的方法, 用 HPLC-ELSD 进行测定, 面积归一化法计算其含量。 8. 如权利要求 1 所述的检测方法, 其特征在于, 经过以下步骤 。

7、: 精密称取氨基糖苷有关物质对照品 (ETM-10, ETM-7, ETM-12, ETM-6, ETM-5, ETM-3 ; 均 从原料药硫酸依替米星中分离得到, 纯度均 95 ) 各适量, 分别加水制成每 1ml 分别含 相关杂质约 0.001-10mg 的对照品储备溶液 ; 精密吸取以上各氨基糖苷有关物质对照品储 备液各适量, 转移至同一容量瓶中, 加水稀释至刻度, 制备成氨基糖苷类有关物质混合对照 品溶液, 其中各有关物质浓度为 10-300g/ml)。色谱柱 : Gemini NX C18(4.6mm150mm, 5m)。流动相 : A 相 : 水 - 氨水 - 冰醋酸 (96 3.。

8、6 0.4), B 相 : 甲醇。采用梯度洗脱的 方法, 用 HPLC-ELSD 进行测定, 面积归一化法计算其含量。 流动相梯度 在上述的方法中一般可以采用如下的色谱条件 ; 流速 0.8ml/min ; 柱温 : 30 ; 进样量 : 10l ; ELSD 参数 : 漂移管温度 : 105 ; 载气流速 : 2.6L/min ; Gain 值 : 1。 权 利 要 求 书 CN 102435679 A CN 102435685 A1/7 页 4 一种新的硫酸依替米星有关物质的检测方法 技术领域 : 0001 本发明涉及一种新的氨基糖苷类抗生素硫酸依替米星有关物质的检测方法。 具体 的讲是一。

9、种新的采用 HPLC-ELSD 仪器、 采用梯度洗脱的方法检测硫酸依替米星有关物质的 方法。 背景技术 : 0002 硫酸依替米星(Etimicin sulfate)是我国科研人员自行研制的, 拥有自主知识产 权的高效、 低毒、 抗耐药菌的新一代半合成氨基糖苷类抗生素, 是唯一获得国家一类新药证 书的抗感染药物。 0003 硫酸依替米星注射液适用于对其敏感的大肠杆菌、 克雷伯氏肺炎杆菌、 沙雷氏杆 菌属、 枸橼酸杆菌、 肠杆菌属、 不动杆菌属、 变形杆菌属、 嗜血流感杆菌、 绿脓杆菌和葡萄球 菌等引起的各种感染。临床研究显示本品对以下感染有较好的疗效 : 呼吸道感染 : 如急性 支气管炎、 慢。

10、性支气管炎急性发作、 社区肺部感染等。肾脏和泌尿生殖系统感染 : 如急性肾 盂肾炎、 膀胱炎、 慢性肾盂肾炎或慢性膀胱炎急性发作等。皮肤软组织和其它感染 : 如皮肤 及软组织感染, 外伤、 创伤和手术产后的感染及其他敏感菌感染。 0004 目 前, 生 产 硫 酸 依 替 米 星 使 用 的 工 艺 均 为 专 利 报 道 的 工 艺 ( 申 请 号 : 93112412.3)。其主要步骤为 : 庆大霉素 C1a 碱在溶剂中加入醋酸钴、 乙酸酐, 生成 3, 2, , 6, - 三 -N- 乙酰基庆大霉素 C1a(P1), 经过提取浓缩, 浓缩液通入硫化氢气体除去钴离子, 得到纯度为 90 -。

11、95的 P1, 然后加入乙醛, 在 0-5冰水浴中用还原剂氢化, 得到 3, 2, , 6, - 三 -N- 乙酰基 -1-N 乙基庆大霉素 C1a(P2), 经吸附型大孔树脂分离后得到纯度较高的 P2, 纯度较高的 P2 加入 1N 的氢氧化钠溶液, 水解回流 48 小时, 水解液经吸附型大孔树脂分 离得到纯度为 90以上的 1-N- 乙基庆大霉素 C1a( 依替米星 ) 溶液, 加酸成盐, 活性炭脱 色, 冷冻干燥, 即得依替米星盐。 0005 硫酸依替米星是一种多结构产品, 生产中难于提纯, 主要杂质为 : ETM-10, ETM-7, ETM-12, ETM-6, ETM-5, ETM。

12、-3, 它们的结构分别为 : 0006 ETM-10 结构式 : 0007 0008 ETM-7 结构式 : 说 明 书 CN 102435679 A CN 102435685 A2/7 页 5 0009 0010 ETM-12 结构式 : 0011 0012 ETM-6 结构式 : 0013 0014 ETM-5 结构式 : 0015 0016 ETM-3 结构式 : 0017 说 明 书 CN 102435679 A CN 102435685 A3/7 页 6 0018 2010 版中国药典公开了一种硫酸依替米星有关物质的测定方法, 该方法采用 HPLC法, 用0.2mol/L三氟乙酸-甲。

13、醇(8416)作为流动相, 但这个流动相腐蚀性过强, 有 关物质检测的灵敏度和准确度偏低, 且三氟乙酸不适用于 LC-MS 测定, 影响后续一些研究 工作的开展。 0019 本发明通过对流动相的缓冲体系、 梯度条件及 ELSD 参数进行优化, 建立了依替米 星的有关物质定量分析的色谱条件, 提供一种全新的有关物质检测方法。本发明所述的方 法, 其流动相腐蚀性低, 灵敏度和准确度高, 并且不干扰后续的 LC-MS 测定, 为依替米星后 续的一些研究工作开展创造有利条件。 发明内容 : 0020 本发明提供一种硫酸依替米星杂质含量检测方法 : 该方法步骤如下 : 精密称取 氨基糖苷有关物质对照品 。

14、(ETM-10, ETM-7, ETM-12, ETM-6, ETM-5, ETM-3 ; 均从原料药硫 酸依替米星中分离得到, 纯度均 95 ) 各适量, 分别加水制成每 1ml 分别含相关杂质约 0.001-10mg 的对照品储备溶液 ; 精密吸取以上各氨基糖苷有关物质对照品储备液各适量, 转移至同一容量瓶中, 加水稀释至刻度, 制备成氨基糖苷类有关物质混合对照品溶液, 其中 各有关物质浓度为 1-1000 g/ml)。色谱柱 : Gemini NX C18(4.6mm150mm, 5m)。流动 相 : A 相 : 水 - 氨水 - 冰醋酸 (98 75 2.0 5.0 0.1 1.0),。

15、 B 相 : 甲醇。采用梯度 洗脱的方法, 用 HPLC-ELSD 进行测定, 面积归一化法计算其含量。 0021 优选的 : 0022 精密称取氨基糖苷有关物质对照品 (ETM-10, ETM-7, ETM-12, ETM-6, ETM-5, ETM-3 ; 均从原料药硫酸依替米星中分离得到, 纯度均 95 ) 各适量, 分别加水制成每 1ml 分别 含相关杂质约 0.001-10mg 的对照品储备溶液 ; 精密吸取以上各氨基糖苷有关物质对照品 储备液各适量, 转移至同一容量瓶中, 加水稀释至刻度, 制备成氨基糖苷类有关物质混合对 照品溶液, 其中各有关物质浓度为 1-500g/ml)。色谱。

16、柱 : Gemini NX C18(4.6mm150mm, 5m)。流动相 : A 相 : 水 - 氨水 - 冰醋酸 (98 85 2.0 4.0 0.1 0.5), B 相 : 甲 醇。采用梯度洗脱的方法, 用 HPLC-ELSD 进行测定, 面积归一化法计算其含量。 0023 更优选的 : 0024 精密称取氨基糖苷有关物质对照品 (ETM-10, ETM-7, ETM-12, ETM-6, ETM-5, ETM-3 ; 均从原料药硫酸依替米星中分离得到, 纯度均 95 ) 各适量, 分别加水制成每 1ml 分别 含相关杂质约 0.001-10mg 的对照品储备溶液 ; 精密吸取以上各氨基。

17、糖苷有关物质对照品 储备液各适量, 转移至同一容量瓶中, 加水稀释至刻度, 制备成氨基糖苷类有关物质混合 说 明 书 CN 102435679 A CN 102435685 A4/7 页 7 对照品溶液, 其中各有关物质浓度为 10-300g/ml)。流动相 : A 相 : 水 - 氨水 - 冰醋酸 (96 3.6 0.4), B 相 : 甲醇。采用梯度洗脱的方法, 用 HPLC-ELSD 进行测定, 面积归一化 法计算其含量。 0025 流动相梯度 0026 0027 在上述的方法中一般可以采用如下的色谱条件 ; 0028 流速 0.8ml/min ; 0029 柱温 : 30 ; 0030。

18、 进样量 : 10l ; 0031 ELSD 参数 : 0032 漂移管温度 : 105 ; 0033 载气流速 : 2.6L/min ; 0034 Gain 值 : 1。 0035 以下试验可以表明本发明上述的检测方法的优点以及该方法的优越的可行性、 准 确性和可靠性。 0036 一 : 专属性试验 0037 取硫酸依替米星原料药适量, 精密称定, 加水溶解制成约 2mg/ml 的供试品溶液, 按照上述方法进行测定 ; 取有关物质对照品各适量, 精密称定, 加水溶解制成约 1 2mg/ml 的杂质对照品溶液。按照上述方法进行测定。测定图谱见图 1-7 : 0038 以上实验图谱检测表明, 采。

19、用该方法测定各硫酸依替米星有关物质的含量, 分离 度良好, 峰对称性良好, 无明显干扰。 0039 二 : 精密度试验 0040 取以上氨基糖苷杂质混合对照品溶液, 按上述色谱条件, 连续进样 6 次, 进样量为 10l, ETM-10 峰面积的 RSD 值为 2.73, ETM-7 的 RSD 值为 1.84, ETM-12 的 RSD 值为 1.70, ETM-6 的 RSD 值为 1.72, ETM-5 的 RSD 值为 1.45, ETM-3 的 RSD 值为 1.93, 结果见 Tab.2。 0041 Tab.2 精密度试验结果 0042 说 明 书 CN 102435679 A C。

20、N 102435685 A5/7 页 8 0043 三 : 定量限 0044 当样品峰高约为噪音的 10 倍, 即 S/N 为 10 的进样量作为定量限。6 个氨基糖苷杂 质对照品的定量限试验结果分别为 : ETM-10 : 100ng ; ETM-7 : 100ng ; ETM-12 : 250ng ; ETM-6 : 130ng ; ETM-5 : 130ng, ETM-3 : 150ng。 0045 四 . 线性关系考察 : 0046 取氨基糖苷杂质混合对照品溶液, 分别进样 1, 2, 5, 10, 20, 40l, 以峰面积的对数 值为横坐标, 进样量 (g) 的对数值为纵坐标, 绘。

21、制标准曲线, 6 个氨基糖苷有关物质的回 归方程分别为 : 0047 y 0.6983x-2.1021, r 0.9991(ETM-10) ; 0048 y 0.6894x-2.1366, r 0.9993(ETM-7) ; 0049 y 0.7514x-2.1383, r 0.9964(ETM-12) ; 0050 y 0.7158x-2.1673, r 0.9988(ETM-6) ; 0051 y 0.7290x-2.2268, r 0.9990(ETM-5) ; 0052 y 0.7754x-2.1775, r 0.9990(ETM-3)。 0053 标准曲线图分别见图 8- 图 13。。

22、 0054 五 : 样品的有关物质含量测定 0055 取杂质混合对照品溶液、 供试品溶液, 按 2 项色谱条件进样分析 ( 进样体积为 10l), 用外标法计算得到各氨基糖苷有关物质的含量。氨基糖苷有关物质混合对照品的 HPLC-ELSD 色谱图见 Fig.7, 硫酸依替米星 ( 样品 1) 的 HPLC-ELSD 色谱图见 Fig.8, 硫酸依 替米星 ( 样品 2) 的 HPLC-ELSD 色谱图见 Fig.9。氨基糖苷有关物质含量测定结果如下。 0056 硫酸依替米星的氨基糖苷杂质含量测定结果 ( 样品 1) 0057 0058 硫酸依替米星的氨基糖苷杂质含量测定结果 ( 样品 2) 说。

23、 明 书 CN 102435679 A CN 102435685 A6/7 页 9 0059 附图说明 : 0060 图 1、 硫酸依替米星的 HPLC-ELSD 色谱图 0061 图 2、 有关物质 ETM-10 的 HPLC-ELSD 色谱图 0062 图 3、 有关物质 ETM-7 的 HPLC-ELSD 色谱图 0063 图 4、 有关物质 ETM-12 的 HPLC-ELSD 色谱图 0064 图 5、 有关物质 ETM-6 的 HPLC-ELSD 色谱图 0065 图 6、 有关物质 ETM-5 的 HPLC-ELSD 色谱图 0066 图 7、 有关物质 ETM-3 的 HPLC。

24、-ELSD 色谱图 0067 图 8、 ETM-10 的标准曲线图 0068 图 9、 ETM-7 的标准曲线图 0069 图 10、 ETM-12 的标准曲线图 0070 图 11、 ETM-6 标准曲线图 0071 图 12、 ETM-5 的标准曲线图 0072 图 13、 ETM-3 的标准曲线图 0073 图 14、 氨基糖苷有关物质混合对照品的 HPLC-ELSD 色谱图 0074 ETM-10(4.9min), ETM-7(5.4min), ETM-12(13.4min), 0075 ETM-6(19.3min), ETM-5(20.6min), ETM-3(27.9min) 00。

25、76 图 15、 硫酸依替米星 ( 样品 1) 的 HPLC-ELSD 色谱图 0077 图 16、 硫酸依替米星 ( 样品 2) 的 HPLC-ELSD 色谱图 具体实施方式 : 0078 以下通过实施例进一步说明本发明, 但不作为对本发明的限制。 0079 实施例 1 0080 精密称取氨基糖苷有关物质对照品 (ETM-10, ETM-7, ETM-12, ETM-6, ETM-5, ETM-3 ; 均从原料药硫酸依替米星中分离得到, 纯度均 95 ) 各适量, 分别加水制成每 1ml 分别 含相关杂质约 0.001-10mg 的对照品储备溶液 ; 精密吸取以上各氨基糖苷有关物质对照品 储。

26、备液各适量, 转移至同一容量瓶中, 加水稀释至刻度, 制备成氨基糖苷类有关物质混合对 照品溶液, 其中各有关物质浓度为 500g/ml)。色谱柱 : Gemini NX C18(4.6mm150mm, 5m)。流动相 : A 相 : 水 - 氨水 - 冰醋酸 (96 3.6 0.4), B 相 : 甲醇。采用梯度洗脱的 方法, 用 HPLC-ELSD 进行测定, 面积归一化法计算其含量。 0081 实施例 2 说 明 书 CN 102435679 A CN 102435685 A7/7 页 10 0082 精密称取氨基糖苷有关物质对照品 (ETM-10, ETM-7, ETM-12, ETM-。

27、6, ETM-5, ETM-3 ; 均从原料药硫酸依替米星中分离得到, 纯度均 95 ) 各适量, 分别加水制成每 1ml 分别 含相关杂质约 0.001-10mg 的对照品储备溶液 ; 精密吸取以上各氨基糖苷有关物质对照品 储备液各适量, 转移至同一容量瓶中, 加水稀释至刻度, 制备成氨基糖苷类有关物质混合对 照品溶液, 其中各有关物质浓度为 300g/ml)。色谱柱 : Gemini NX C18(4.6mm150mm, 5m)。流动相 : A 相 : 水 - 氨水 - 冰醋酸 (96 3.6 0.4), B 相 : 甲醇。采用梯度洗脱的 方法, 用 HPLC-ELSD 进行测定, 面积归。

28、一化法计算其含量。 说 明 书 CN 102435679 A CN 102435685 A1/6 页 11 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102435679 A CN 102435685 A2/6 页 12 图 4 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 102435679 A CN 102435685 A3/6 页 13 图 7 图 8 图 9 说 明 书 附 图 CN 102435679 A CN 102435685 A4/6 页 14 图 10 图 11 图 12 说 明 书 附 图 CN 102435679 A CN 102435685 A5/6 页 15 图 13 图 14 图 15 说 明 书 附 图 CN 102435679 A CN 102435685 A6/6 页 16 图 16 说 明 书 附 图 CN 102435679 A 。

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