一种脱水穿心莲内酯及其氨基酸酯衍生物的制备方法.pdf

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1、10申请公布号CN104045612A43申请公布日20140917CN104045612A21申请号201410289467222申请日20140625C07D307/5820060171申请人哈尔滨珍宝制药有限公司地址150060黑龙江省哈尔滨市开发区哈平路集中区烟台一路8号72发明人方同华周广红贾文娟朱自力徐秀杰74专利代理机构北京路浩知识产权代理有限公司11002代理人王文君54发明名称一种脱水穿心莲内酯及其氨基酸酯衍生物的制备方法57摘要本发明涉及一种脱水穿心莲内酯的氨基酸酯衍生物盐酸盐如式结构所示化合物的制备方法，该方法包括酯化反应和脱保护成盐酸盐，最终制备成脱水穿心莲内酯的氨基酸。

2、酯衍生物盐酸盐。本发明所述的脱水穿心莲内酯的氨基酸酯衍生物的制备方法工艺稳定可控、操作简便，易于工业化；制备的脱水穿心莲内酯的氨基酸酯衍生物纯度高、收率高、成分稳定，能够大大避免了不良反应事件的发生。51INTCL权利要求书2页说明书11页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书11页10申请公布号CN104045612ACN104045612A1/2页21一种脱水穿心莲内酯的氨基酸酯衍生物盐酸盐如式结构所示化合物的制备方法该方法的合成路线如下反应式中R1、R2各自独立为H、甘氨酰、L丙氨酰、L亮氨酰、L缬氨酰等氨基酸的残基；但取代基R1，R2不能同时为H。2根据权。

3、利要求1所述的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤1酯化反应脱水穿心莲内酯与叔丁氧羰基氨基酸溶于有机溶剂，温度控制在035之间，随后依次加入缩合剂和碱，搅拌下进行酯化反应，得到羟基酯化的脱水穿心莲内酯衍生物粗品，在室温下反应210小时，薄层色谱法检测至反应完成，过滤，滤液用有机溶剂萃取，有机相先后用饱和盐水，稀盐酸和碳酸氢钠溶液萃洗，干燥后浓缩脱除溶剂，权利要求书CN104045612A2/2页3再用醇稀释，然后倒入10倍体积水中，搅拌，再次过滤，干燥，得到羟基酯化的脱水穿心莲内酯衍生物；2脱保护成盐酸盐羟基酯化的脱水穿心莲内酯衍生物与盐酸溶液在有机溶剂中反应，温度控制在025之间，在室温下继。

4、续反应25小时，过滤，滤饼用乙醇淋洗，干燥，即得。3根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述脱水穿心莲内酯、叔丁氧羰基氨基酸、缩合剂和碱的重量比为12525003008。4根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述缩合剂为二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺或1乙基3二甲基氨基丙基碳二亚胺盐酸盐的一种或几种，优选为二异丙基碳二亚胺；所述叔丁氧羰基氨基酸为N叔丁氧羰基甘氨酸；所述碱为二甲氨基吡啶；所述脱水穿心莲内酯与叔丁氧羰基氨基酸溶于有机溶剂中的有机溶剂为四氢呋喃，乙酸乙酯，二氯甲烷，N,N二甲基甲酰胺，N,N二乙基甲酰胺的一种或几种，优选有机溶剂为DMFN,N二甲基甲酰胺；萃取所用的有机。

5、溶剂为乙酸乙酯；所述用醇稀释时所用的醇为异丙醇。5根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤2中所述盐酸与羟基酯化的脱水穿心莲内酯衍生物、有机溶剂的比520ML1G120ML。6根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤2中所述盐酸溶液为盐酸的醇溶液，其中醇溶液为异丙醇，盐酸的浓度为015MOL/L，是将015MOL的盐酸溶于1L异丙醇中；所述有机溶剂为四氢呋喃、N,N二甲基甲酰胺、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇、乙醇或异丙醇的一种或几种，优选有机溶剂为乙醇。反应的条件温度025，反应时间054小时。7根据权利要求16任一项所述的方法，其特征在于，所述脱水穿心莲内酯由以下方法制备取穿心莲内酯。

6、，加入有机溶剂中溶解，穿心莲内酯与有机溶剂的重量/体积G/ML比为1152，在穿心莲内酯重量0510的催化剂存在下搅拌加热至80130，回流112小时，反应完成后过滤，然后加入到310倍量的水中，加入和搅拌同步进行，静置18小时，过滤，用水淋洗除尽吡啶，干燥，得脱水穿心莲内酯粗品，用粗品重量210倍量体积的4080乙醇重结晶，即得脱水穿心莲内酯精制品。8根据权利要求7所述的方法，其特征在于，穿心莲内酯与有机溶剂的重量体积比G/ML为11518；催化剂的用量为穿心莲内酯重量的0823；所述水的用量为穿心莲内酯的57倍。9根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂为氯仿、吡啶、环己烷、二氯。

7、甲烷或1,2二氯乙烷的一种或几种，优选溶剂为吡啶。10根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述催化剂可为亚硫酸钠、甲苯磺酸钠、硫酸铝、氧化铝、三氧化钨的一种或几种，优选亚硫酸钠或氧化铝或二者混合。权利要求书CN104045612A1/11页4一种脱水穿心莲内酯及其氨基酸酯衍生物的制备方法技术领域0001本发明涉及医药技术领域，涉及一种脱水穿心莲内酯及脱水穿心莲内酯的氨基酸酯衍生物的制备方法。背景技术0002穿心莲为爵床科植物穿心莲ANDROGRAPHISPANICULATABURMFNEES的干燥地上部分，又名一见喜泉州百草、春莲秋柳岭南采药录等，原产于印度，我国主要分布于广东、福建、广西、云。

8、南、四川、江西、江苏等地，为常用中药，收载于中国药典2010年版第一部第251页。0003穿心莲具有清热解毒、凉血、消肿等功能。其主要有效成分是二萜内酯类化合物，如穿心莲内酯如式所示及其衍生物脱水穿心莲内酯等。现代药理研究表明，穿心莲内酯及其衍生物如脱水穿心莲内酯如式所示、14脱羟11,12二脱氢穿心莲内酯3,19二琥珀酸半酯单钾盐穿琥宁、14脱羟11,12二脱氢穿心莲内酯3,19二琥珀酸半酯钾钠盐炎琥宁、穿心莲内酯磺酸盐喜炎平、穿心莲内酯亚硫酸氢钠加成物莲必治等具有消炎、抗菌、抗病毒感染、抗肿瘤、抗心血管疾病、免疫刺激、保肝利胆及抗生育等功能。临床上广泛用于治疗小儿肺炎，上呼吸道感染等疾病。。

9、0004关于脱水穿心莲内酯的氨基酸酯衍生物，具体见CN2007101475741公开号CN101376651A，式为该专利中式B所示的化合物盐酸盐，具有消炎解热镇痛的功效。000500060007虽然上述产品在临床上广为使用，但在国家药品不良反应监测中心病例报告数据库中，严重不良反应事件问题较为突出，主要以全身性损害为主。全身性损害主要表现为过敏性休克、过敏样反应、发热、寒战、乏力等；穿心莲内酯衍生物在提取制备过程中可能存留蛋白质等大分子杂质，进入体内后，可能成为抗原刺激机体产生相应抗体，引起过敏反应。此外抗原与抗体形成复合物附着于血小板膜上，使血小板寿命缩短，数量减少，引起血小板减少的不良反。

10、应。穿心莲内酯衍生物的有效成分结构存在桥型共轭双键、不饱和双键和2个酯键，因而其化学活性高，稳定性差。在制备和储存过程中容易发生聚合反应，形成的聚合物具有抗原性，极易引起过敏反应。说明书CN104045612A2/11页50008因此，若能开发出一种高纯度的原料，避免了穿心莲内酯衍生物在提取过程中引入的较多杂质而引起过敏及血小板减少的不良反应。对穿心莲内酯衍生物的结构进行改造，将其设计成一种前药，使药物在制备过程中的稳定性加强，进入人体后可代谢为有活性的穿心莲内酯，避免了药物的降解的不稳定性和形成聚合物发生不良反应事件。势必会有巨大的应用前景和市场价值。0009有关脱水穿心莲内酯的氨基酸酯衍生。

11、物报道如下0010穿心莲内酯CN2007101475741公开号CN101376651A涉及一种脱水穿心莲内酯氨基酸酯衍物及其盐，式为该专利中式B所示的化合物盐酸盐，其中R1、R2各自独立为H、甘氨酰、L丙氨酰、L亮氨酰、L缬氨酰等氨基酸的残物，并限定了但取代基R1，R2不能同时为H。同时，在该专利中公开了该衍生物盐的制备方法，具体为脱水穿心莲内酯与N苄氧羰基氨基酸在二环己基碳二亚胺作用下缩合，得到ON苄氧羰基氨基酰脱水穿心莲内酯，催化氢化脱保护，得到目标化合物。此工艺过程中中间体的反应难以控制，易于引起副反应发生，产物杂质较多，纯度不高。0011有关以穿心莲内酯半合成脱水穿心莲内酯的研究文献。

12、则有如下报道0012CN102617527A公开了一种穿琥宁或炎琥宁的制备方法，其中说明书第2页内容0006段写明现有技术制备脱水穿心莲内酯二琥珀酸半酯的技术主要是以吡啶作为溶剂，由穿心莲内酯与琥珀酸酐、无水亚硫酸钠及无水吡啶在真空度520620MMHG条件下沸水浴中回流反应进行制备脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯单钾盐及其注射液的研究，中药草通讯，197881，在该专利的0007段内容中写明，以吡啶为溶剂，在氮气保护下在常压下由穿心莲内酯一琥珀酸酐、无水硫酸钠先在7080的温度下反应，再在吡啶的沸点温度下回流数小时脱水穿心莲内酯二琥珀酸半酯的合成工艺改进，安徽医药杂质，2006，103；炎琥宁的直播。

13、方法、炎琥宁制剂及制备方法，CN1927854A。0013中国专利申请公开说明书公开号CN1810794A，其方法是以无机物催化进行半合成的，但实施例中无收率等试验数据。0014CN2007100484705公开号CN101245056A，公开日2008年8月20日公开了一种以穿心莲内酯为原料，通过丁二酸酐或乙酸酐与穿心莲内酯的不饱和仲醇作用，在吡啶中直接脱水一步合成脱水穿心莲内酯的方法。但最终产物应该是穿琥宁并不是脱水穿心莲内酯，而且产品收率只是90以上，无纯度介绍。现有穿心莲内酯半合成脱水穿心莲内酯的方法并不多，且收率低，纯度不高，杂质多；用传统中药提取分离的方法很难获得高纯度的脱水穿心莲。

14、内酯，分离工艺复杂，耗时时间长，污染严重，过程工艺控制不当容易得酯化产物等，上述原因造成了脱水穿心莲内酯在现有市场需求量大，价格昂贵，不易获得的局面。0015因而，发明人认为需要发明一种制备纯度高、杂质少的合成方法，既能提高药品的质量，又能为生产提供原料，节约成本，解决其来源途径。发明内容0016本发明的目的是提供一种精制优化的脱水穿心莲内酯的氨基酸酯衍生物、脱水穿心莲内酯两个化合物的制备方法。脱水穿心莲内酯的氨基酸酯衍生物制备的关键是采用两步合成，极大改进了不宜控制操作和副反应较多的加氢脱保护的步骤，反应条件温和，产物说明书CN104045612A3/11页6收率高、纯化好。0017本发明提。

15、供了一种脱水穿心莲内酯的氨基酸酯衍生物盐酸盐如式结构所示化合物的制备方法00180019该方法的合成路线如下00200021具体方法包括以下步骤00221酯化反应脱水穿心莲内酯与叔丁氧羰基BOC氨基酸溶于有机溶剂，温度控制在035之间，随后依次加入缩合剂和碱，搅拌下进行酯化反应，得到羟基酯化的脱水穿心莲内酯衍生物粗品，在室温下反应210小时，薄层色谱法检测至反应完成，过滤，滤说明书CN104045612A4/11页7液用有机溶剂萃取，有机相先后用饱和盐水，稀盐酸和碳酸氢钠溶液萃洗，干燥后浓缩脱除溶剂，再用醇稀释，然后倒入10倍体积水中，搅拌，再次过滤，干燥，得到羟基酯化的脱水穿心莲内酯衍生物；。

16、00232脱保护成盐酸盐羟基酯化的脱水穿心莲内酯衍生物与盐酸溶液在有机溶剂中反应，温度控制在025之间，在室温下继续反应25小时，抽滤，滤饼用乙醇淋洗，干燥，即得。0024上述反应中0025反应式中R1、R2各自独立为H、甘氨酰、L丙氨酰、L亮氨酰、L缬氨酰等氨基酸的残基；但取代基R1，R2不能同时为H。0026所述步骤1中0027脱水穿心莲内酯、叔丁氧羰基BOC氨基酸、缩合剂和碱的重量比为12525003008；0028所述叔丁氧羰基BOC氨基酸为N叔丁氧羰基甘氨酸；0029所述缩合剂为二环己基碳二亚胺DCC、二异丙基碳二亚胺DIC或1乙基3二甲基氨基丙基碳二亚胺盐酸盐EDC的一种或几种，优。

17、选为DIC二异丙基碳二亚胺；0030所述碱为二甲氨基吡啶；0031所述脱水穿心莲内酯与叔丁氧羰基BOC氨基酸溶于有机溶剂中的有机溶剂为四氢呋喃，乙酸乙酯，二氯甲烷，N,N二甲基甲酰胺，N,N二乙基甲酰胺的一种或几种，优选有机溶剂为DMFN,N二甲基甲酰胺；0032萃取所用的有机溶剂为乙酸乙酯；0033所述稀盐酸的浓度为1MOL/L；0034所述用醇稀释时所用的醇为异丙醇；0035所述薄层色谱法为GF254薄层色谱法。0036所述步骤2中0037所述盐酸溶液与羟基酯化的脱水穿心莲内酯衍生物、有机溶剂的比520ML1G120ML；0038所述盐酸溶液为盐酸的醇溶液，其中醇溶液为异丙醇，盐酸的浓度为。

18、015MOL/L，是将015MOL的盐酸溶于1L异丙醇中；0039所述有机溶剂为四氢呋喃、N,N二甲基甲酰胺、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇、乙醇或异丙醇的一种或几种，优选有机溶剂为乙醇。0040反应的条件温度025，反应时间054小时。0041所述步骤1中提到的脱水穿心莲内酯可以市售购买，也可以通过以下方法制备，其反应式如下0042说明书CN104045612A5/11页80043具体包括如下步骤0044取穿心莲内酯，加入有机溶剂中溶解，穿心莲内酯与有机溶剂的重量/体积比G/ML为1152，在穿心莲内酯重量0510的催化剂存在下搅拌加热至80130，回流112小时，反应完成后过滤，然后加入到310。

19、倍量的水中，加入和搅拌同步进行，待完全加入后，静置18小时，过滤，用水淋洗除尽吡啶，干燥，得脱水穿心莲内酯粗品，经用粗品重量210倍量体积的4080乙醇重结晶，即得脱水穿心莲内酯精制品。0045上述反应中0046穿心莲内酯与有机溶剂的重量体积比G/ML为11518；0047催化剂的用量为穿心莲内酯重量的0823；0048所述水的用量为穿心莲内酯的57倍；0049所述有机溶剂为氯仿、吡啶、环己烷、二氯甲烷或1,2二氯乙烷的一种或几种，优选溶剂为吡啶；0050所述催化剂可为亚硫酸钠、甲苯磺酸钠、硫酸铝、氧化铝、三氧化钨的一种或几种，优选亚硫酸钠或氧化铝或二者混合；0051本发明所述的脱水穿心莲内酯。

20、及其氨基酸酯衍生物的制备方法具有如下有益效果00521、在脱水穿心莲内酯反应得到式化合物式，其合成工艺参数对收率的影响0053脱水穿心莲内酯与BOC保护的氨基酸的摩尔比进行制备，发现在125当量以下时反应时间会相应延长，且反应出现不很完全的结果，但大于13时反应时间和收率并没有出现更好的结果，且随着摩尔比的减少，会出现少许脲的残留，给纯化和收率带来一定的影响，最终确定当量比为123是最优化的。0054反应温度对该工艺有着较大的影响，在酯化反应投料中，应保持体系维持在5以下，投料完成后逐渐升至2030反应，如果不控制好温度体系反应会颜色加深，杂质增多，纯化困难；盐酸溶液加入到体系中时，应控制体系。

21、温度维持在0左右，逐渐升至2030后反应基本完成，如果温度控制不好，会增加体系杂质生成的风险。00552、本发明所述的脱水穿心莲内酯的氨基酸酯衍生物的制备方法工艺稳定可控、操作简便，易于工业化；制备的脱水穿心莲内酯的氨基酸酯衍生物纯度高、收率高、成分稳定，能够大大避免了不良反应事件的发生。00563、本发明所述的脱水穿心莲内酯制备工艺特点条件温和，工艺稳定，较高纯度，较高收率，适合工业化大生产。说明书CN104045612A6/11页9具体实施方式0057以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。0058实施例1脱水穿心莲内酯的制备方法0059取穿心莲内酯350G01MOL，加入60。

22、ML吡啶相当于穿心莲内酯重量的171倍体积和05G氧化铝相当于穿心莲内酯重量的143，搅拌缓慢加热升温至120，回流反应4小时，反应完成后过滤，然后将滤液加入到200ML水中相当于穿心莲内酯重量的571倍，加入搅拌同步进行，完全加入后，静置5小时，过滤，用水多次淋洗除尽吡啶，通过HPLC检测吡啶小于01时，干燥，得脱水穿心莲内酯323G，产品为类白色。经60乙醇100ML重结晶得脱水穿心莲内酯白色针晶309G，收率931，纯度995。0060实施例2脱水穿心莲内酯的制备方法0061取穿心莲内酯350G01MOL，加入60ML吡啶相当于穿心莲内酯重量的171倍体积和03G亚硫酸钠相当于穿心莲内酯。

23、重量的086，搅拌缓慢加热升温至115，回流反应5小时。反应完成后过滤，将滤液缓慢加入到200ML水中相当于穿心莲内酯重量的571倍，加入和搅拌同步进行，完全加入后，静置5小时，过滤，用水多次淋洗除尽吡啶，干燥，得脱水穿心莲内酯325G，产品为类白色。经70乙醇100ML重结晶得脱水穿心莲内酯白色针晶306G，收率922，纯度996。0062实施例3脱水穿心莲内酯的制备方法0063取穿心莲内酯350G01MOL，加入60ML吡啶相当于穿心莲内酯重量的171倍体积和05G氧化铝相当于穿心莲内酯重量的143及03G亚硫酸钠相当于穿心莲内酯重量的086，搅拌缓慢加热升温至125，回流反应4小时。反应。

24、完成后过滤，滤液加入到200ML水相当于穿心莲内酯重量的571倍中，加入和搅拌同步进行，完全加入后，静置5小时，过滤，用水多次淋洗除尽吡啶，干燥，得脱水穿心莲内酯326G，产品为类白色。经60乙醇100ML重结晶得脱水穿心莲内酯白色针晶306G，收率922，纯度996。0064实施例4脱水穿心莲内酯的制备方法0065取穿心莲内酯350G1MOL，加入550ML吡啶相当于穿心莲内酯重量的157倍体积和5G氧化铝相当于穿心莲内酯重量的143及3G亚硫酸钠相当于穿心莲内酯重量的086，搅拌加热至120，回流反应6小时。反应完成后过滤，将滤液加入到2000ML水相当于穿心莲内酯重量的571倍中，加入和。

25、搅拌同步进行，完全加入后，静置8小时，过滤，用水多次淋洗除尽吡啶，干燥，得脱水穿心莲内酯328G，产品为类白色。经60乙醇1000ML重结晶得脱水穿心莲内酯白色针晶315G，收率949，纯度996。0066对比例10067参照申请公开说明书公开号CN1810794A中实施例的方法制得脱水穿心莲内酯。0068实验例1有效成分含量检测00691、分别对实施例14与对比例1制得的脱水穿心莲内酯进行如下指标的检测性状、活性成分含量、水分、有关物质，检测结果如表1所示。其中0070活性成分含量纯度、有关物质，照高效液相色谱法中国药典2010年版说明书CN104045612A7/11页10二部附录D试验。。

26、0071水分照水分测定法中国药典2010年版二部附录M第一法试验。00722、含量检测结果见表10073表1实施例14检测数据0074实施例1实施例2实施例3实施例4对比例1性状类白色粉末类白色粉末类白色粉末类白色粉末类白色粉末纯度996997997996931水分015017016015023有关物质010009008008019收率9319229339448920075表1结果显示实施例14提供的方法中，实施例14得到的脱水穿心莲内酯的纯度高于995，而对比例1的纯度为931。0076结果表明，本发明制得的脱水穿心莲内酯的有效成分纯度高，收率高，特别是杂质含量非常小，产品质量好。而且，溶剂。

27、吡啶可以浓缩回收再利用，催化剂可以回收再利用，有效节约成本、减少污染，有利于生产。0077实施例53,19O二甘氨酰脱水穿心莲内酯盐酸盐的制备00781、酯化反应将脱水穿心莲内酯664G，002MOL、N叔丁氧羰基甘氨酸1051G，006MOL搅拌溶解于50MLN,N二甲基甲酰胺DMF，05加入二异丙基碳二亚胺757G，006MOL和二甲氨基吡啶012G，0001MOL，然后升至室温并搅拌反应过夜，GF254薄层色谱分析检测至反应完成，过滤反应体系，滤液用乙酸乙酯萃取100ML3，有机相分别用饱和NACL溶液100ML，1MOL/L稀盐酸溶液100ML，饱和碳酸氢钠溶液100ML萃洗一次，有机。

28、相合并后用无水硫酸钠干燥8小时，减压浓缩脱除溶剂后用50ML异丙醇稀释，然后倒入500ML纯化水中，搅拌4小时，过滤，收集滤饼，鼓风干燥8小时得产物3,19O二叔丁氧羰甘氨酰脱水穿心莲内酯1201G，类白色晶体，收率93。00792、脱保护成盐酸盐将3,19O二叔丁氧羰甘氨酰脱水穿心莲内酯646G，001MOL溶解于15ML异丙醇，05搅拌下加入2MOL/L氯化氢异丙醇溶液15ML，室温反应2小时，抽滤，滤饼用少量乙醇淋洗，鼓风干燥3小时得3,19O二甘氨酰脱水穿心莲内酯盐酸盐498G，白色晶体，收率96。0080实施例63,19O二甘氨酰脱水穿心莲内酯盐酸盐00811、酯化反应将脱水穿心莲内。

29、酯2783G，008MOL、N叔丁氧羰基甘氨酸442G，025MOL搅拌溶解于200ML二氯甲烷，1015加入二异丙基碳二亚胺3175G，025MOL和二甲氨基吡啶051G，0004MOL，然后室温下搅拌反应过夜，GF254薄层色谱分析检测至反应完成，过滤反应体系，滤液用乙酸乙酯萃取400ML3，有机相分别用饱和NACL水溶液400ML，1MOL/L稀盐酸溶液400ML，饱和碳酸氢钠溶液400ML萃洗一次，有机说明书CN104045612A108/11页11相合并后用无水硫酸钠干燥8小时，减压浓缩脱除溶剂后用200ML异丙醇稀释，然后倒入2000ML纯化水中，搅拌4小时，过滤，收集滤饼，鼓风干。

30、燥8小时得产物3,19O二叔丁氧羰甘氨酰脱水穿心莲内酯4833G，类白色晶体，收率89。00822、脱保护成盐酸盐将3,19O二叔丁氧羰甘氨酰脱水穿心莲内酯272G，004MOL溶解于60ML异丙醇，1015搅拌下加入2MOL/L氯化氢异丙醇溶液60ML，室温反应2小时，抽滤，滤饼用少量乙醇淋洗，鼓风干燥3小时得3,19O二甘氨酰脱水穿心莲内酯盐酸盐2085G，白色晶体，收率96。0083实施例73,19O二甘氨酰脱水穿心莲内酯盐酸盐00841、酯化反应将脱水穿心莲内酯5614G，017MOL、N叔丁氧羰基甘氨酸8841G，051MOL搅拌溶解于400MLN,N二甲基甲酰胺DMF，58加入二环。

31、己基碳二亚胺9672G，047MOL和二甲氨基吡啶101G，0008MOL，然后升至室温并搅拌反应过夜，GF254薄层色谱分析检测至反应完成，过滤反应体系，滤液用乙酸乙酯萃取800ML3，有机相分别用饱和NACL水溶液800ML，1MOL/L稀盐酸溶液800ML，饱和碳酸氢钠溶液800ML萃洗一次，有机相合并后用无水硫酸钠干燥8小时，减压浓缩脱除溶剂后用400ML异丙醇稀释，然后倒入4000ML纯化水中，搅拌4小时，过滤，收集滤饼，鼓风干燥8小时得产物3,19O二叔丁氧羰甘氨酰脱水穿心莲内酯9015G，类白色晶体，收率84。00852、脱保护成盐酸盐将3,19O二叔丁氧羰甘氨酰脱水穿心莲内酯5。

32、362G，008MOL溶解于120ML异丙醇，58搅拌下加入2MOL/L氯化氢异丙醇溶液120ML，室温反应2小时，抽滤，滤饼用少量乙醇淋洗，鼓风干燥3小时得3,19O二甘氨酰脱水穿心莲内酯盐酸盐4093G，白色晶体，收率95。0086对比例20087参照发明专利2007101475741说明书中实施例5的方法制得3,19O二甘氨酰脱水穿心莲内酯。0088实验例2有效成分含量检测00891、分别对实施例57制得的脱水穿心莲内酯的氨基酸酯衍生物及对比例2的脱水穿心莲内酯的氨基酸酯衍生物进行如下指标的检测性状、活性成分含量、水分、有关物质，检测结果如表2所示。其中0090活性成分含量纯度、有关物质。

33、，照高效液相色谱法中国药典2010年版二部附录D试验。0091水分照水分测定法中国药典2010年版二部附录M第一法试验。00922、含量检测结果见表20093表2实施例57与对比例2检测数据0094实施例5实施例6实施例7对比例2性状白色粉末白色粉末白色粉末白色粉末纯度10031000100993说明书CN104045612A119/11页12水分021023022024有关物质007009008038收率969595840095表2结果显示实施例5、6、7提供的方法中，纯度均不低于999，而对比例中其纯度为993，前者达到了注射级，后者只能满足口服药物的需要。0096结果表明，本发明制得的脱。

34、水穿心莲内酯的氨基酸酯衍生物的有效成分和现有技术的相比，纯度更高，特别是杂质含量非常小，产品质量更高。实验例3稳定性试验00971、加速试验0098将实施例57及对比例1的脱水穿心莲内酯的氨基酸酯衍生物样品置于402、相对湿度755条件下进行加速6个月试验。分别于第0、1、2、3、6个月的月末取样，按稳定性重点考察项目进行检测。检测考察指标性状、活性成分含量、水分、有关物质。0099加速实验结果见表3。0100表3实施例57与对比例2加速试验考察数据01010102说明书CN104045612A1210/11页130103表3中加速6个月试验的结果表明本发明实施例57制得的脱水穿心莲内酯的氨基。

35、酸酯衍生物其性状、活性成分含量、水分、有关物质的和现有技术的相比，变化更小，表明本发明制得的脱水穿心莲内酯的氨基酸酯衍生物的稳定性更好，安全性更高。01042、长期试验0105将实施例57及对比例2的样品置于温度252，相对湿度6010的条件下放置24个月。分别于第0、3、6、9、12、18、24个月的月末取样，按稳定性重点考察项目进行检测。检测考察指标性状、活性成分含量、水分、有关物质。0106长期实验结果见表4。0107表4实施例57与对比例2长期试验考察数据01080109说明书CN104045612A1311/11页140110表4的长期试验结果表明本发明实施例57制得的脱水穿心莲内酯。

36、的氨基酸酯衍生物，性状、活性成分含量、水分、有关物质与现有技术相比，变化更小。0111结果表明本发明制得的脱水穿心莲内酯的氨基酸酯衍生物的稳定性更好，安全性更高。0112综上表明，本发明制得的脱水穿心莲内酯的氨基酸酯衍生物，经过稳定性考察可知，样品质量稳定可控，特别是杂质的控制与现有技术相比得到很大提高，避免了药物杂质在临床应用中导致的不良反应，提高药效的同时，增加了药品的安全性。0113虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。说明书CN104045612A14。