新方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102933606 A (43)申请公布日 2013.02.13 CN 102933606 A *CN102933606A* (21)申请号 201180025064.1 (22)申请日 2011.05.18 1008401.0 2010.05.20 GB C08B 37/00(2006.01) C12P 19/04(2006.01) (71)申请人 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 地址 比利时里克森萨特 (72)发明人 P. 查理斯 G. 格尔德霍夫 V. 曼库索 (74)专利代理机构 中国专利代理(香港)有限公 司 72001 代理人 刘健 梁谋 (54) 发明名。

2、称 新方法 (57) 摘要 本发明提供了从革兰氏阴性细菌细胞提取脂 多糖 (LPS) 的方法， 所述方法包括下列步骤 ： 在包 含水、 醇和其它有机溶剂的组合物 (LPS 提取组合 物 ) 中从细胞培养物提取 LPS。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶段日 2012.11.20 (86)PCT申请的申请数据 PCT/EP2011/058016 2011.05.18 (87)PCT申请的公布数据 WO2011/144645 EN 2011.11.24 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 12 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利。

3、申请 权利要求书 2 页 说明书 12 页 附图 2 页 1/2 页 2 1.LPS 提取组合物， 其包含水、 醇和其它有机溶剂。 2. 如权利要求 1 所述的组合物， 其中所述 LPS 提取组合物是单相的。 3. 如权利要求 1 或 2 所述的组合物， 其中所述 LPS 提取组合物中水的量为约 0.1- 约 1.5% (v/v)。 4. 如权利要求 1-3 中任一项所述的组合物， 其中水的量为约 1% (v/v)。 5. 如权利要求 1-3 中任一项所述的组合物， 其中水的量为约 0.5% (v/v)。 6. 如权利要求 1-5 中任一项所述的组合物， 其中所述醇选自下列 ： 甲醇、 乙醇、。

4、 异丙醇 或丁醇。 7. 如权利要求 1-6 中任一项所述的组合物， 其中所述 LPS 提取组合物中醇的百分数为 约 5%- 约 40% (v/v)。 8. 如权利要求 7 所述的组合物， 其中醇的百分数为约 10% (v/v)- 约 30% (v/v)。 9. 如前述权利要求中任一项所述的组合物， 其中所述其它有机溶剂选自下组 ： 氯仿、 链烷、 甲苯和石油醚。 10. 如权利要求 9 所述的组合物， 其中所述链烷选自下组 ： 异辛烷、 乙烷、 庚烷和己烷。 11. 如前述权利要求中任一项所述的组合物， 其中所述 LPS 提取组合物中其它有机溶 剂的百分数为约 60% (v/v)- 约 95。

5、% (v/v)。 12. 如权利要求 11 所述的组合物， 其中其它有机溶剂的百分数为约 75% (v/v)- 约 90% (v/v)。 13. 如权利要求 1-12 中任一项所述的组合物， 其中 LPS 提取溶液包含氯仿、 甲醇和水。 14.如权利要求1-12中任一项所述的组合物， 其中所述LPS提取组合物包含链烷、 乙醇 和水。 15. 用于从革兰氏阴性细菌细胞提取 LPS 的如权利要求 1-14 中任一项所述的组合物。 16.如权利要求1-14中任一项所述的LPS提取组合物在用于从革兰氏阴性细菌细胞提 取 LPS 的方法中的用途。 17. 从革兰氏阴性细菌细胞提取脂多糖 (LPS) 的方。

6、法， 所述方法包括在如权利要求 1-14 中任一项所述的 LPS 提取组合物中从所述细胞提取 LPS 的步骤。 18. 如权利要求 17 所述的方法， 其中在约 35 - 约 65的温度进行 LPS 的提取。 19. 如权利要求 18 所述的方法， 其中所述温度为约 45 - 约 55。 20. 如权利要求 18 或 19 所述的方法， 其中所述温度为约 50。 21. 如权利要求 16-20 中任一项所述的方法， 其中在 7.8-9 的 pH 进行 LPS 的提取。 22. 如权利要求 21 所述的方法， 其中所述 pH 为约 8.6。 23. 如权利要求 16-22 中任一项所述的方法， 。

7、其中在约 1- 约 30 小时内进行 LPS 的提 取。 24. 如权利要求 23 所述的方法， 其中在约 0.5- 约 20 小时内进行 LPS 的提取。 25. 如权利要求 23 或 24 所述的方法， 其中在约 1 小时内进行 LPS 的提取。 26. 如权利要求 16-25 中任一项所述的方法， 其进一步包括下列步骤 ： i. 用乙醇溶液或乙醇洗涤细胞 ； 以及任选地 ii. 用乙醇或甲醇第二次地洗涤细胞。 27. 如权利要求 26 所述的方法， 其中在 i) 和 / 或 ii) 中用约 75- 约 95% 的乙醇或甲醇 权 利 要 求 书 CN 102933606 A 2 2/2 页。

8、 3 溶液 (v/v) 洗涤细胞。 28.如权利要求26或27所述的方法， 其中在约85% (v/v)的乙醇或甲醇溶液中洗涤步 骤 i) 中的细胞。 29. 如权利要求 26 或 27 所述的方法， 其中用约 90% (v/v) 的乙醇或甲醇溶液在步骤 ii) 中洗涤细胞。 30. 如权利要求 16-29 中任一项所述的方法， 其进一步包括下列步骤 ： 用甲醇溶液洗涤 细胞。 31. 如权利要求 16-30 中任一项所述的方法， 其进一步包括下列步骤 ： 从 LPS 溶液蒸发 水、 醇和其它有机溶剂， 由此产生干燥的 LPS 残留物。 32. 如权利要求 16-31 中任一项所述的方法， 其中。

9、所述细菌细胞为沙门氏菌属或埃希 氏菌属的深度粗糙的突变体细菌菌株的细菌细胞。 33. 如权利要求 32 所述的方法， 其中所述细菌细胞为大肠杆菌的细菌细胞。 34. 如权利要求 32 所述的方法， 其中所述细菌细胞为明尼苏达沙门氏菌的细菌细胞。 35.如权利要求34所述的方法， 其中所述细菌细胞为明尼苏达沙门氏菌R595的细菌细 胞。 36. 由权利要求 16-35 中任一项所述的方法制备的 LPS 组合物。 37. 如权利要求 16-35 中任一项所述的方法， 其进一步包括下列步骤 ： 使 LPS 经历连续 的酸水解和碱水解以形成 3D-MPL。 38. 由权利要求 37 所述的方法制备的 。

10、3D-MPL 组合物。 权 利 要 求 书 CN 102933606 A 3 1/12 页 4 新方法 发明领域 0001 本发明涉及脂多糖 (LPS) 的生物合成制备领域。具体地， 本发明涉及用于从细菌 细胞， 诸如通过细菌细胞培养获得的细胞提取 LPS 的改进的方法和组合物。本发明的这 些方法和组合物用于制备 LPS、 LPS 衍生物， 并且特别是用于制备 3-O- 脱酰单磷酰脂质 A (3D-MPL)。 0002 背景 脂多糖 (LPS) 是革兰氏阴性菌外膜的外部小叶 (external leaflet) 的主要的表面分 子， 并且只存在于所述外部小叶中。LPS 阻止了血清补体和吞噬细胞。

11、产生的细菌的破坏， 并 且与用于集落 (colonisation) 的粘附有关。LPS 是大小约为 10,000 道尔顿的一组结构相 关的复杂分子， 并且由三个共价连接区域组成 ( 如图 5 所示 ) ： (i) 在外部区域的O- 特异性多糖链 (O- 抗原 ) (ii) 核心寡糖中心区域 (iii) 脂质 A - 充当疏水性固定物 (anchor) 的最里面的区域， 其包括运载长链脂肪 酸的氨基葡萄糖二糖单元。 0003 发明概述 本发明的一个目的是提供用于提取 LPS 的组合物和方法， 其导致改进的 LPS 的细菌产 率。可以从产生的细菌细胞的量 ( 生物量 ) 计算 LPS 产率。改进的。

12、 LPS 产率能够使在给定 的设备中制备更大量的 LPS， 或者使用较小设备制备等量的 LPS。本发明的另一目的是提供 用于提取LPS的方法， 其显示出从细菌细胞提取的LPS产率的更大可靠性和/或再现性。 本 发明的另一目的是提供用于提取 LPS 的更快的方法。 0004 因此， 提供了从革兰氏阴性菌细胞提取脂多糖 (LPS) 的方法， 所述方法包括下列 步骤 ： 使用包含水、 醇和其它有机溶剂的组合物 (LPS 提取组合物 ) 从细菌的细胞膜提取 LPS。 0005 附图简述 图 1 在 50从细胞肉汤培养基 101B 提取的动力学 图 2 来自肉汤培养基 101B 的再现性数据 图 3A 。

13、： 具有 0% 水的 80 个实验的提取产率的分布 图 3B ： 具有 1% 的水的 55 个实验的提取产率的分布 图 4 pH 的影响 图 5 显示了 LPS 分子的三个共价连接区域 ： (i) 在外部区域的O- 特异性多糖链 (O- 抗 原 ) ； (ii) 核心寡糖中心区域 ； 和 (iii) 脂质 A 图 6 显示了突变体明尼苏达沙门氏菌 (S. Minnesota)R595 产生的截短的 LPS， 并且指 出了相对于全长 LPS 的截断位置。 具体实施方式 0006 LPS 提取的已知技术包括 Galanos 方法， 其涉及用苯酚、 氯仿和石油醚的混合物 说 明 书 CN 10293。

14、3606 A 4 2/12 页 5 (PCP) 提取 LPS， 然后蒸发氯仿和石油醚， 添加丙酮和水以沉淀 LPS， 并且通过离心或过滤回 收 LPS(Galanos et al., Eur. J. Biochem. 9: 245 (1969)。Chen 方法涉及用氯仿和 甲醇的混合物 (CM) 提取 LPS， 然后进行一系列的甲醇沉淀步骤。Galanos 不适合商业制备 LPS， 因为其不适于大规模生产， 并且使用引起健康和安全担忧的溶剂混合物 ( 例如， 苯酚 ： 氯仿 ： 石油醚 )。Chen 方法产生富含 LPS 和磷脂的 CM 相， 其通常需要多个沉淀步骤以获得 具有足够纯度以用于免。

15、疫刺激应用(例如用作疫苗佐剂)的LPS。 WO02/078637公开了使用 革兰氏阴性菌 ( 特别是明尼苏达沙门氏菌 (Salmonella minnesota) 的深度粗糙的 (deep rough) 突变体菌株制备 LPS 和 3D-MPL 的方法。WO02/078637 的方法显示了从 2% 变至 12% 的产率上的显著可变性。需要改进的 LPS 提取方法。 0007 发明人已经揭示除了醇和其它有机溶剂外， 通过在 LPS 提取步骤中使用水， 与其 中在 LPS 提取步骤中不使用水的等效步骤相比， 能够得到较高的 LPS 产率。本发明人已经 证明了可以通过使用包含水的提取组合物从革兰氏阴。

16、性菌提取脂多糖， 其产生更多的 LPS， 具有更大的可靠性并且经历较短的时间 ( 与缺水的等效组合物相比 )， 并且没有与其它提 取方法相关的某些缺点。除了增加的 LPS 产率以外， 本发明人还揭示了通过在 LPS 提取组 合物(水、 醇和有机溶剂)中使用水， 能够以比没有水时更大的可靠性并且在较少时间内实 现这种较大产率。 0008 如本文所用的术语 “LPS 产率” 是指以干燥细菌细胞重量 (DCW) 的百分数的形式获 得的 LPS 的量。 0009 因此， 提供了从细菌细胞培养物提取脂多糖 (LPS) 的方法， 所述方法包括下列步 骤 ： 使用包含水、 醇和其它有机溶剂的 LPS 提取组。

17、合物从所述细胞提取 LPS。 “LPS 提取” 或 “从细菌细胞提取 LPS” 是指 LPS 被直接从细菌外膜除去。 0010 在本发明的另一方面中， 提供了 LPS 提取组合物。 “LPS 提取组合物” 是指其中从 细菌的膜直接提取脂多糖的 LPS 提取步骤中使用的组合物 / 混合物。本发明的 LPS 提取组 合物包含水、 醇和其它有机溶剂， 并且用于本发明的 LPS 提取方法。本发明的 LPS 提取组合 物是单相提取组合物。 “单相” 是指液体形成单一均匀溶液而非其中液体是不能混溶的混合 物。 0011 术语 “水” (H2O) 是本领域技术人员熟知的。该术语包括纯的和基本纯的水 (H2O。

18、) (包括通过蒸馏、 去离子、 离子交换处理或反渗透获得的水)， 以及包含少量杂质的水(本领 域技术人员清楚水通常包含某些杂质 )。水杂质是本领域技术人员熟知的并且包括无机离 子、 有机分子、 微粒、 胶体、 溶解的气体、 微生物及其副产物。 在特定的实施方案中， 水是无菌 的， 因为其基本上没有任何活的微生物。在进一步的实施方案中， 水是过滤过的。 0012 本发明可以进一步使用水溶液， 例如进一步包含碱的水。 在一个实施方案中， 本发 明的组合物不包含其中溶解了酸的水。因此， 在一个实施方案中， 水的 pH 是中性的， 即约 pH 7。在本发明的一个实施方案中， 提供了 LPS 提取组合物。

19、， 其包含水、 醇和有机溶剂， 其中 水的 pH 在 7 以上。在本发明的特定实施方案中， 提供了 LPS 提取组合物， 其中 LPS 提取组 合物的 pH 不低于 7。在特定的实施方案中， 可以通过加入选自的氢氧化钠 (NaOH)、 三乙胺 (TEA) 和碳酸氢钾 (KHCO3) 的一种或多种的碱提高水的 pH。 0013 术语 “水” 还包括去离子水。 去离子水是本领域技术人员熟知的术语， 但是简言之， 去离子水是其中基本除去了所用矿物离子的水。可以通过电导率测量去离子的水平， 并且 说 明 书 CN 102933606 A 5 3/12 页 6 在特定的实施方案中， 去离子水的最大电导率。

20、为 1 西门子 (siemens)/cm。本发明的水不 必须与 LPS 提取组合物的其它组分分别添加。例如， LPS 提取组合物中的水可以源自包含 醇和水二者的醇溶液， 并且因此， 技术人员仅需要混合醇和有机溶剂来提供包含醇、 有机溶 剂和水的 LPS 组合物。 0014 正如已经指出的， 本发明人已经揭示了向包含醇和其它有机溶剂的提取组合物中 添加水导致更大的 LPS 产率和 / 或更大的 LPS 产率的一致性。因此， 提供了包含水、 醇和 其它有机溶剂的 LPS 提取组合物， 其中 LPS 提取组合物中水的量为约 0.1- 约 1.5% (v/v)。 本发明的 LPS 提取组合物可以包含约。

21、 0.4%-1.5% 的水 (v/v)， 例如 0.4、 0.5、 0.6、 0.7、 0.8、 0.9、 1.0、 1.1、 1.2、 1.3、 1.4 或 1.5% (v/v)。特别地， 本发明的 LPS 提取组合物中水的量为 约 1% (v/v)， 即 0.8-1.2% (v/v)。 0015 本发明的 LPS 提取组合物包含除了醇以外的有机溶剂。术语 “有机溶剂” 是本领 域熟知的。有机溶剂为能够将固体、 液体或气体溶质溶于溶液中的含碳化学制品。 0016 本发明的 LPS 提取组合物包含有机溶剂， 其可以选自下组 ： 氯仿、 链烷 (alkane)、 甲苯和石油醚。氯仿是本领域技术人。

22、员熟知的， 并且由化学式 CHCl3表示。链烷也是本领 域熟知的。链烷是没有任何环状结构的饱和烃。本发明的 LPS 提取组合物可以包含选自下 组的链烷 ： 异辛烷、 乙烷、 庚烷和己烷。 0017 本发明的LPS提取组合物中不为醇的有机溶剂的百分数可以为约60%-约95% (v/ v)， 并且在本发明的特定实施方案中， LPS 提取组合物包含约 75% (v/v)- 约 90% (v/v) 的 除了醇以外的溶剂。本发明的 LPS 提取组合物特别包含约 70、 71、 72、 73、 74、 75、 76、 77、 78、 79、 80、 81、 82、 83、 84、 85、 86、 87、 。

23、88、 89 或 90 % (v/v) 的除了醇以外的溶剂。 0018 本发明的 LPS 提取组合物包含醇。如本文所用的术语 “醇” 被定义为任何非环状 的有机化合物， 其中羟基 (-OH) 与烃基 (alkyl) 或取代的烃基基团的碳原子连接。为了阐 明， 本发明不包括芳香族不饱和醇， 例如苯酚 ( 环状醇 )， 并且因此提供了包含水、 醇和其它 有机溶剂的 LPS 提取组合物， 其中所述醇不为芳香族不饱和醇， 例如苯酚。 0019 本发明的 LPS 提取组合物中醇的百分数可以为约 5%- 约 40%， 并且在本发明的特 定实施方案中， LPS 提取组合物包含约 10% (v/v)- 约 3。

24、0% (v/v) 的醇。本发明的 LPS 提取 组合物特别包含 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29 或 30% (v/v) 的醇。 0020 本发明的 LPS 提取组合物中的醇可以选自下列 ： 异丙醇、 甲醇、 乙醇和丁醇。醇的 选择可以取决于许多因素， 所述因素包括特定 LPS 提取组合物中的特定有机溶剂， 因为某 些醇不溶于某些有机溶剂。因此， 在本发明的一个实施方案中， 提供了包含水、 氯仿和甲醇 的 LPS 提取组合物。在本发明的可替换的实施。

25、方案中， 提供了包含水、 链烷和乙醇的 LPS 提 取组合物。 0021 如本文所定义的本发明的 LPS 提取组合物用于本文所述的本发明的 LPS 提取方 法。因此， 提供了从细菌细胞提取脂多糖 (LPS) 的方法， 所述方法包括下列步骤 ： 在本文所 定义的 LPS 提取组合物中从所述细胞提取 LPS， 所述 LPS 提取组合物包含水、 醇和其它有机 溶剂。LPS 提取方法是技术人员熟知的。 0022 可以改变本发明方法的各种参数而同时保持在本发明的范围内， 所述参数包括温 度、 时间和pH。 可以在约35至约65的温度进行包括在包含水、 醇和其它有机溶剂的LPS 说 明 书 CN 1029。

26、33606 A 6 4/12 页 7 提取组合物中从细胞提取 LPS 的步骤 (LPS 提取步骤 ) 的本发明的方法。在本发明的特定 实施方案中， 在约 45至约 55， 特别是 45、 46、 47、 48、 49、 50、 52、 52、 53、 54 或 55的温度 进行 LPS 提取步骤。在本发明的特定方法中， 在约 50进行提取步骤。 0023 可以进行包括在包含水、 醇和其它有机溶剂的 LPS 提取组合物中从细胞提取 LPS 的步骤的本发明的方法， 其中在约 7 至约 9， 例如约 7.1、 7.2、 7.3、 7.4、 7.5、 7.6、 7.7、 7.8、 7.9、 8.0、 。

27、8.1、 8.2、 8.3、 8.4、 8.5、 8.6、 8.7、 8.8或8.9的pH进行提取步骤。 在本发明的特定 实施方案中， 在约 7.8 至约 9 的 pH 进行 LPS 提取步骤， 并且在本发明的甚至更特定的方法 中， 在约 pH 8.6 进行提取步骤。 0024 包括在包含水、 醇和其它有机溶剂的 LPS 提取组合物中从细胞提取 LPS 的步骤的 本发明的方法可以进行约 0.5 至约 30 小时。在本发明的特定实施方案中， LPS 提取步骤进 行 1 至 20 小时， 特别是 0.5 至 1.5、 1 至 2、 1.5 至 2.5 或 2 至 2.5 小时， 例如 0.75、 。

28、1、 1.25、 1.5、 1.75、 2 或 2.25 小时。在本发明的特定方法中， 提取步骤进行约一小时。 0025 本发明的方法可以进一步包括下列步骤 ： (i) 用乙醇溶液洗涤细胞 ； 以及任选地 (ii) 用乙醇第二次地洗涤。 在提取步骤之前用乙醇洗涤可以降低在LPS提取步骤中与LPS 共同提取的磷脂的量， 并因此洗涤能够降低 LPS 提取中杂质的量。因此， 提供了从细菌细胞 提取脂多糖 (LPS) 的方法， 所述方法包括下列步骤 ： (i) 用乙醇溶液洗涤细胞 ； (ii) 用乙醇第二次地洗涤细胞 ； 以及 (iii) 在包含水、 醇和其它有机溶剂的 LPS 提取组合物中从细胞提取。

29、 LPS。 0026 可以使用约 75% 至约 95% (v/v) 的乙醇溶液进行本发明的方法中的洗涤步骤 ( 用 水进行洗液的调节 (balance)。在本发明的某些实施方案中， 用约 85% (v/v) 的乙醇溶液 进行第一次洗涤(i)。 在本发明方法的进一步的实施方案中， 用约90% (v/v)的乙醇溶液进 行第二次洗涤 (ii)。 0027 本发明方法的其它实施方案可以进一步包括用甲醇溶液洗涤细胞的步骤。因此， 提供了从细菌细胞提取脂多糖 (LPS) 的方法， 所述方法包括下列步骤 ： (i) 用乙醇溶液洗涤细胞 ； (ii) 用乙醇第二次地洗涤细胞 ； (iii) 用甲醇洗涤细胞 ；。

30、 以及 (iv) 在包含水、 醇和其它有机溶剂的 LPS 提取组合物中从细胞提取 LPS。 0028 本发明的方法用于从细菌细胞(包括从细菌细胞培养物获得的那些)提取LPS， 以 便可以使用和/或进一步加工LPS。 因此， 本发明方法的其它实施方案进一步包括从LPS溶 液蒸发水、 醇和其它有机溶剂的步骤， 由此在提取步骤后产生干燥的 LPS 残留物。适当地， 提供了从细菌细胞提取脂多糖 (LPS) 的方法， 所述方法包括下列步骤 ： (i) 用乙醇溶液洗涤细胞 ； (ii) 用乙醇第二次地洗涤细胞 ； (iii) 用甲醇洗涤细胞 ； (iv) 在包含水、 醇和其它有机溶剂的 LPS 提取组合物。

31、中从细胞提取 LPS ； 以及 (v) 从 LPS 溶液蒸发水、 醇和其它有机溶剂， 由此产生干燥 LPS 残留物。 0029 在本发明的另一方面中， 提供了由本发明方法制备的LPS组合物。 已经显示了LPS 说 明 书 CN 102933606 A 7 5/12 页 8 的生物活性 ( 诸如致死毒性、 热原质性和佐剂性 ) 与脂质 A 部分有关。相反， 免疫原性与 O- 特异性多糖组分 (O- 抗原 ) 有关。长期已知 LPS 和脂质 A 二者的强佐剂作用， 但是这些 分子的高毒性妨碍了其在疫苗制剂中的应用。因此， 已经对降低 LPS 或脂质 A 毒性同时保 持其佐剂性做出了重要努力。 00。

32、30 在 1966 年从母体 (smooth) 菌株的培养物分离了明尼苏达沙门氏菌 (Salmonella minnesota)突变体R595 (Luderitz et al. 1966 Ann. N. Y. Acad. Sci. 133:349-374)。 通过噬菌体板(panel of phage)筛选所选菌落对溶菌作用(lysis)的易感性， 并且仅选择 表现出小范围敏感性 ( 仅易受一种或两种噬菌体影响 ) 的那些菌落用于下一步研究。该 努力导致分离出在 LPS 生物合成中有缺陷的， 并且称为明尼苏达沙门氏菌 (S. minnesota) R595 的深度粗糙的突变体菌株。 0031 。

33、与其它LPS相比， 由明尼苏达沙门氏菌(S. minnesota)R595制备的那些是截短的 并且具有较简单的结构 ( 参见图 6)， 因为它们 ： (i) 不含有O- 特异性区域 - 对从野生型光滑表型到突变体粗糙表型的转变负责并且 导致毒力损失的特征 (ii) 核心区域极短 - 该特征增加了菌株对多种化学制剂的易感性， 以及 (iii) 脂质 A 部分被多至 7 个的脂肪酸高度酰化。 0032 因此， 本发明的方法中使用的细菌细胞可以为沙门氏菌属 (Salmonella) 或埃希 杆菌属 (Escherichia) 的深度粗糙的突变体细菌菌株的细菌细胞。术语 “深度粗糙的突变 体细菌菌株”。

34、 是指具有深度粗糙表型的革兰氏阴性菌的菌株。 深度粗糙表型是其中与脂质A 相连接的多糖部分仅由2-酮-3-脱氧-D-甘露辛酮糖酸(2-keto-3-deoxy-D-mannooctulo nic acid) (KDO)的约2-3个残基组成的一种表型。 特别地， 深度粗糙突变体细菌菌株选自 沙门氏菌属 (Salmonella)。如果深度粗糙突变体细菌菌株选自沙门氏菌属 (Salmonella)， 则其可以为明尼苏达沙门氏菌 (Salmonella minnesota) 种， 特别是明尼苏达沙门氏菌 (Salmonella minnesota)R595 菌株。可以使用其它深度粗糙突变体细菌菌株， 。

35、诸如空 肠弯曲菌 (Compylobacter jejuni) (Kanipes et al. 2004 Infection and Immunity 72:2452-2455)、 大肠杆菌 (E. coli) K12 菌株 CS2429 (Klena et al. 2005 J. Bact. 187:1710-1715)、 大肠杆菌 (E. coli) D31m4 (Qureshi et al.1988 J. Biol. Chem. 263:11971-11976)、 大肠杆菌 (E. coli) 菌株 F515 (Wiese et al. 1997 Biochemistry 36:1031。

36、1-10319) 和奇异变形杆菌 (Proteus mirabilis) 菌株 R45 (Wiese et al. 1997 Biochemistry 36:10311-10319)。 0033 4 - 单磷酰脂质 A (4 -monophosporyl lipid A) (MPL)( 可以通过对从革兰氏阴 性菌的深度粗糙的突变体菌株提取的 LPS 进行酸水解来获得 ) 保留了 LPS 的佐剂性质， 同 时显示出了超过1000倍的毒性的降低(由鸡胚蛋的致死剂量测量)(Johnson et al. 1987 Rev. Infect. Dis. 9 Suppl:S512-S516)。 通常将LPS。

37、在中等强度无机酸溶液(例如， 0.1 M HCl) 中回流大约 30 分钟的时间。该操作导致在 1 位脱磷酸 (dephosphorylation)， 以及在 6 位脱碳水化合物 (decarbohydration)， 产生 MPL。3-O- 脱酰单磷酰脂质 A (3D-MPL)( 可 以通过MPL的温和碱水解获得)具有进一步降低的毒性， 同时仍保持佐剂性， 参见美国专利 第4912094号 (Ribi Immunochemicals)。 通常在诸如氯仿/甲醇混合物的有机溶剂中通过 用诸如 pH 10.5 的 0.5 M 碳酸钠的弱碱水溶液饱和进行碱水解。制备 3D-MPL 的进一步的 说 明。

38、 书 CN 102933606 A 8 6/12 页 9 信息可以在例如在美国专利第4912094号和PCT公开WO02/078637 (Corixa Corporation) 中得到。 0034 因此， 本发明的方法可以进一步包括使 LPS 经历连续的酸水解和碱水解以形成 3D-MPL 的步骤， 并因此在本发明的进一步的实施方案中， 提供了从革兰氏阴性菌制备 LPS 衍生物的方法， 所述方法包括下列步骤 ： (i) 用乙醇溶液洗涤细胞 ； (ii) 用乙醇第二次地洗涤细胞 ； (iii) 用甲醇洗涤细胞 ； (iv) 在包含水、 醇和其它有机溶剂的 LPS 提取组合物中从细胞提取 LPS ；。

39、 (v) 从 LPS 溶液蒸发水、 醇和其它有机溶剂， 由此产生干燥的 LPS 残留物 ； 以及 (vi) 使 LPS 经历连续的酸水解和碱水解以形成 3D-MPL。 0035 在本发明的另一方面中， 提供了由本文所述的本发明方法制备的3D- MPL组合物。 0036 关于该申请的所有文献， 包括专利和专利申请都以最大可能并入本文中作为参 考。 0037 除非上下文另有需要， 在下面的本说明书和权利要求书通篇中， 词语 “包括 (comprise)” 以及变体， 诸如 “包括 (comprises)” 和 “包括 (comprising)” 将理解为暗示包 括所指明的整数、 步骤、 整数组或步。

40、骤组， 但是不排除任何其它的整数、 步骤、 整数组或步骤 组。 0038 本发明的方法通过参照下列非限制性实例来进行例示。 实施例 0039 实施例 1 ： LPS 提取方法 1.1 标准洗涤方法 ( 下列洗涤方法与实施例 2 类似 ) 该洗涤方法应用于在下列LPS提取实施例1、 2和3中使用的细胞肉汤培养基90A、 101B 和 128A。 0040 将灭活肉汤培养基的一部分 ( 通常为 200L， 含 3-5 kg DCW， 360-600g LPS1) 装入 具有推进器、 测温探头、 氮气覆盖的并且在25mbar N2下的300L双层夹套不锈反应容器中。 0041 将肉汤培养基在 50在。

41、搅拌下通过在反应容器的双层夹套中循环热水加热。 0042 通过在装有孔径为 0.22m (6 mm 内径 ) 且表面积为 0.15 m2的 7 通道圆柱形 KERASEP 陶瓷膜 (Ref 供应商 : KERMBB-XM2 (Groupe Novasep France) 的正切流动过滤 (TFF) 单元上过滤 ( 持续时间 1.5 h) 将混合物浓缩至 75L。在分析干重残留物并检查透 明性之后， 丢弃透过物 (permeate)。 0043 在乙醇 (158L) 和水 (18L) 中稀释渗余物 (retentate)， 产生 250 L 总体积。在 50加热混合物并在该温度快速搅拌 30 分。

42、钟。然后通过正切流动过滤 ( 持续时间 2 h) 将混合物浓缩至 50L， 并收集透过物以进行分析。 0044 通过在 50加入乙醇 (180L) 和水 (20L)( 持续时间 2 h) 以进一步洗涤渗余物。 在快速搅拌 30 分钟后进行过滤至 50L。分析两次洗涤的透过物的干燥残留物并丢弃。然后 在透析模式下在 50在 TFF 单元上用甲醇替换渗余物中含有的乙醇 / 水 (90/10)。 0045 以每份 20 L 将总体积为 360L 的甲醇加入到剩余物混合物中， 同时过滤混合物以 说 明 书 CN 102933606 A 9 7/12 页 10 产生 50L 细胞的甲醇悬浮液 ( 通常，。

43、 残留乙醇含量 1%)， 其基本没有疏水性杂质 ( 磷脂 ) ( 持续时间 3 h)。分析透过物的干燥残留物并丢弃。 0046 典型地， 在乙醇洗涤和用甲醇替换乙醇的步骤期间在透过物中除去了 20% 的总 DCW。此时， 可以对渗余物混合物进行取样以确定在实验室规模 (137ml) 或中试工厂规模 (260L) 下进一步加工的 DCW 和材料。 0047 1.2.2 无水提取方法 ( 中试工厂规模 ) ( 为提取肉汤培养基 90B 所进行的 ) 在上述洗涤步骤后， ( 在 144L 的含有 4kg DCW 的肉汤培养基 90A 上 )， 将 50L 洗涤过 的细胞于甲醇中的悬浮液提取至氯仿 /。

44、 甲醇中。加入 190L 氯仿和 20L 甲醇。将混合物在 50进一步加热 16h。在提取和过滤期间抽取定时收集的样品。然后通过蒸发滤液的溶剂 检测提取的 LPS 的量以使产率计算与在肉汤培养基上测量的 DCW 相比较。 0048 然后在TFF单元上过滤悬浮液并将透过物送入300L双层夹套的、 氮气覆盖的并且 是在 25mbar N2下的不锈钢收集容器中。通过在容器的双层夹套中循环冷水 (8 ) 来冷却 透过物。 0049 当获得残留体积为 50L 的渗余物时， 停止过滤 ( 持续时间 3 h)。 0050 1.3. 标准浓缩步骤 ( 仅中试工厂规模 ) 在 真 空 连 续 进 料 上 升 管。

45、 蒸 发 仪 (vacuum continuous-feeding rising tube evaporator) (30 , 200mbar) 上浓缩收集的透过物 ( 滤液 ) 直到体积为 17L ( 该仪器的 最小运行体积 )。在蒸发期间发生部分沉淀， 这是由于氯仿的优先蒸发， 以及富含甲醇。典 型的蒸发速率为 50-150 L/h， 这取决于真空 / 冷凝温度 ( 持续时间 2-4 h)。 0051 清空蒸发仪， 然后用新鲜氯仿 (17L) 洗涤以溶解蒸发期间沉淀的任何物质。 0052 在具有 50水浴和 350mbar 的起始压力的 20 L Buchi ROTAVAPOR R-220。

46、 (BCHI Labortechnik AG) 上进一步蒸发合并的洗液和浓缩物 ( 总体积 ： 34L)。典型的蒸 发速率为 8-10 L/h ( 持续时间 ： 3-4h)。 0053 当获得约 3L 的体积时， 加入水 (3L) 并将混合物再次浓缩至 3L。重复该操作 2 次 直到获得 40mbar 的最终压力， 这表明仅剩余水 ( 除去了所用溶剂 )。在该甲醇 / 水替换期 间， 典型的蒸发速率为 2.5 L/h ( 典型的持续时间 3h)。 0054 加入另外的3L水以产生6L的LPS于水中的悬浮液， 将其在4储存， 储存时间通 常为 7 天。对悬浮液进行取样以分析干燥残留物， 从而估计。

47、 LPS 的量 ( 也称为 CME， 氯仿 / 甲醇提取物 ) 的量 ： 对肉汤培养基 90A 的提取产生了 189g 的 LPS。 0055 在提取期间用0%水进行的N=80的实验的平均产率(参见图3)为6.5%， 其显示出 极宽的分布， 且 95% 的结果在 1-12% 产率之间。 0056 实施例 2 使用水进行提取 细胞的洗涤 (222L 的来自含有 5kg DCW 的肉汤培养基 131A) 按照 1.1 节所述的方式进 行。 说 明 书 CN 102933606 A 10 8/12 页 11 0057 2.1 方法 ： 2.1.1 提取 ( 含 1% 的水的中试工厂规模 ) ( 为提。

48、取肉汤培养基 131A 所进行的 ) 向洗涤过的R595细胞(50L， 于甲醇中)中加入氯仿(195L)和水(2.5L)以得到溶剂比 为 78/22/1 的 CHCl3/MeOH/H2O。在 50加热混合物并在该温度下快速搅拌过夜 (16h)。 0058 然后在TFF单元上过滤悬浮液并将透过物送入300L双层夹套的、 氮气覆盖的并且 是在 25mbar N2下的不锈钢收集容器中。通过在容器的双层夹套中循环冷水 (8 ) 冷却 透过物。 0059 当获得残留体积为 50L 的渗余物时， 停止过滤 ( 持续时间 3 h)。向渗余物中加 入氯仿 (40L) 和甲醇 (10L) 以进行进一步提取， 并。

49、在 50再次加热混合物并过滤直到体积 为 50L。还将另外的 50L 透过物送入收集容器中。然后丢弃残留的 50L 渗余物。 0060 如 1.3 节所述进行浓缩， 产生 568g 的 LPS。 0061 在这些条件中的平均产率为 9.1%， 并且如图 3 所示， 95% 的结果包括在 6-12% 产率 之间。 0062 实施例 3 用和不用水进行实验室提取 使用 1.1 中描述的方法洗涤 130L 的灭活肉汤培养基 101B (2.99kg DCW)， 产生 50L 的 洗涤过的细胞。对洗涤过的细胞进行取样以进行缩小规模的实验室提取。 0063 为了更好地理解提取方法， 缩小该步骤的规模并且测试了不同的提取条件， 以及 建立了至多 48h 提取的动力学。将来自肉汤培养基 101B 的洗涤过的细胞用于那些试验。 0064 在为了回流而装备的圆底烧瓶中并且在氮气的惰性气氛下向 30ml 的洗涤过的 R595 细胞于甲醇中的悬浮液中加入。