一种达肝素钠精品的生产方法.pdf

本发明公开了一种达肝素钠的生产方法，本发明使用肝素钠粗品为原料，通过降解、还原、乙醇沉淀得到低分子肝素钠粗品，相对于需要使用肝素钠精品为原料，方法适用范围更广，更可以从源头控制达肝素钠精品的质量。创新性的通过HPLC对层析前的低分子肝素钠粗品的p测试其分子量及分布-根据公式计算出层析过程中滤液的收集，准确定量到符合要求的低分子肝素钠精品液，避免了昂贵的分子量截流过滤膜的使用。再通过氧化、除菌过滤、沉淀脱水实现了“一锅煮”的工艺，在操作上实现了简化，节省了时间和人力成本，该工艺在现有的技术基础上开发出了一条新的制备达肝素钠原料的方法，且在本公司实现了达肝素钠的工业化生产。

1.  一种达肝素钠精品的生产方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)肝素钠粗品用纯化水溶解，调节溶液pH至2.6-2.8，加入亚硝酸钠搅拌20min后调节溶液pH至9.5-10.0，得到降解液，向降解液中加入硼氢化钠搅拌≥15h，调节溶液pH至3.4-3.6搅拌20min，紫外灯照射降解液，调节溶液pH至7.0-7.5后用乙醇沉淀脱水，真空干燥得到低分子肝素钠粗品；所述肝素钠粗品和纯化水投料比(W/V)为1.0：8.5-10；所述肝素钠粗品和亚硝酸钠的投料比(W/W)为100：1.5-2.5；所述亚硝酸钠和硼氢化钠的投料比(W/W)为1.0：0.3-0.5；
(2)将上述低分子肝素钠粗品用2％氯化钠溶液溶解后加入层析柱内，以2％氯化钠溶液匀速洗拓，HPLC检测分子量及分布，通过公式计算除去的大、小分子百分比数及相对应体积，收集符合要求的洗拓液并调节pH至7.0-7.5，乙醇沉淀脱水，真空干燥得到低分子肝素钠精品；
(3)将分次层析出的低分子肝素钠精品合并，测试其分子量及分布，如果小分子部分有偏差，可调节溶液pH至7.0-7.5，加入乙醇沉淀对小分子片段进行调节，使其达到符合要求，把合格的低分子肝素钠精品加到13#氧化罐内中，加入纯化水和氯化钠，搅拌溶解；
(4)调节低分子肝素钠精品溶液pH至10.5-11.0，加入30％过氧化氢氧化≥4-5h，后调节pH至7.9-8.1，加入无水亚硫酸钠，搅拌30min过滤得到达肝素钠粗品溶液；
(5)调节达肝素钠粗品溶液pH5.6-5.8，使其通过0.45μm和0.2μm滤膜除菌，除菌过滤后的达肝素钠溶液收集在洁净沉淀罐中；
(6)除菌后的达肝素钠溶液用乙醇沉淀﹑脱水、真空干燥得到精品达肝素钠。

2.  根据权利要求1所述的达肝素钠精品的生产方法，其特征在于，步骤(1)中肝素钠粗品和纯化水投料比(W/V)为1.0：9.2-9.5；肝素钠粗品和亚硝酸钠的投料比(W/W)为100：1.5-2.0；亚硝酸钠和硼氢化钠的投料比(W/W)为1.0：0.35-0.42；亚硝酸钠反应时体系温度维持在15-30℃，pH2.6-2.8。

3.  根据权利要求1所述的达肝素钠精品的生产方法，其特征在于，步骤 (1)中通过用淀粉-碘化钾试纸测试溶液来确定反应是否结束，调节体系pH的溶液为：4mol/L盐酸，5mol/L氢氧化钠；紫外灯照射波长为254nm，加入溶液体积和乙醇体积之比(V/V)为1.0:0.65-0.75，沉淀出的低分子肝素粗品在生产上需要再用乙醇脱水三次，第一次用的乙醇和投料的肝素钠粗品的比(V/W)为3.0-5.0：1.0，第二次和第三次用的乙醇为前一次用量的50％，每次脱水间隔2h以上。

4.  根据权利要求1所述的达肝素钠精品的生产方法，其特征在于，步骤(2)用2％的氯化钠溶液溶解步骤(1)得到的低分子肝素钠粗品，使最终溶液体积和低分子肝素钠粗品重量(V/W)为7.0-8.5：1.0，再用2％氯化钠溶液洗拓洗拓层析柱，流速约为一个柱床体积/2小时，对层析后的洗拓液通过HPLC测试其分子量及分布，再根据公式计算出相对应的需除去的大、小分子面积及相对应的体积，收集的中间洗拓液用其2倍体积的乙醇来沉淀，沉淀物再用乙醇来脱水三次，第一次用的乙醇和投料的低分子肝素钠粗品的比(V/W)为3.0-5.0：1.0，第二次和第三次用的乙醇为前一次用量的50％，每次脱水间隔2h以上。

5.  根据权利要求1所述的达肝素钠精品的生产方法，其特征在于步骤(3)中如果合并后的低分子肝素钠精品HPLC检测分子量及分布显示小分子部分(<3000)不满足≤13.0％的要求，可将合并的低分子肝素钠精品再纯化一遍，将其溶解在纯化水中，低分子肝素钠精品和纯化水投料比(W/V)为1.0：8.5-10，调节pH7.0-7.5，再用2倍体积的乙醇来沉淀，沉淀物再用乙醇来脱水三次，第一次用的乙醇和投料的低分子肝素钠精品的比(V/W)为3.0-5.0：1.0，第二次和第三次用的乙醇为前一次用量的50％，每次脱水间隔2h以上，把合格的低分子肝素钠精品加到13#氧化罐内中，低分子肝素钠精品和纯化水之比(W/V)为1.0：8.5-10，氯化钠和纯化水之比(W/V)为0.8-1.5：100。

6.  根据权利要求1所述的达肝素钠精品的生产方法，其特征在于步骤(4)中将上述步骤(3)中的溶液用氢氧化钠调节pH至10.5-11.0，30％过氧化氢和溶液之比(V/V)为0.25-0.45：100，无水亚硫酸钠和过氧化氢(W/V)为0.20-0.30：1.0。

7.  根据权利要求1所述的达肝素钠精品的生产方法，其特征在于步骤(5) 中需要做0.2μm和0.45μm滤膜完整性试验，以确保生产中使用的滤膜能够满足除菌过滤要求。

8.  根据权利要求1所述的达肝素钠精品的生产方法，其特征在于步骤(6)中过滤后的达肝素钠溶液用2.0倍体积的乙醇沉淀，沉淀出的达肝素精品用乙醇脱水三次，第一次用的乙醇和投料的低分子肝素钠精品的比(V/W)为3.0-5.0：1.0，第二次和第三次用的乙醇为前一次用量的50％，每次脱水间隔2h以上。

一种达肝素钠精品的生产方法
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别是一种精品达肝素钠的制备和纯化工艺。
背景技术
肝素钠(Heparin Sodium)是粘多糖硫酸酯类抗凝血药。肝素钠是由猪或牛的肠粘膜中提取的硫酸氨基葡聚糖的钠盐，属粘多糖类物质。在体内外均具有抗凝血作用，是目前主流的抗凝血药品。但是普通肝素钠的生物利用度低，副作用大，后来人们发现肝素钠裂解获取的硫酸氨基葡聚糖片段的钠盐，平均分子量为4000～6000道尔顿，称为低分子肝素钠。低分子肝素钠注射液和肝素钠注射液一样属于抗凝血酶Ⅲ(ATⅢ)依赖性凝血酶抑制剂。但与肝素钠注射液相比，具有半衰期较长、抗血栓效果好、出血倾向较弱、给药方便，但价格比较贵。而达肝素为其中一种。达肝素钠注射液主要用于急性深静脉血栓的治疗，急性肾功能衰竭或慢性肾功能不全者进行血液透析和血液过滤期间防止体外循环系统中发生凝血，不稳定型冠心病，如不稳定型心绞痛和非Q-波型心肌梗塞，预防与手术有关的血栓形成。是目前主流的抗血栓类药物。
目前已有3篇专利报道了达肝素钠制备工艺，其中有2篇已授权。专利CN101942038A通过将肝素钠原料溶解在纯化水和含有甲基的有机溶剂中，在一定温度和pH值条件下，加入亚硝酸钠进行降解，后再在一定pH值条件下用氢氧化钠进行还原，再用乙醇沉淀，滤膜过滤，紫外线灭菌，过氧化氢氧化滤膜过滤，再用乙醇沉淀，将沉淀物冷冻干燥或脱水真空干燥即得达肝素钠成品。其中专利CN102558393A采用最传统的达肝素钠的制备工艺，即先将肝素钠溶于纯化水中得到肝素钠水溶液，盐酸调节水溶液的pH值，后用亚硝酸钠降解肝素钠，再用氢氧化钠调节体系pH值，硼氢化钠还原，后用乙醇沉淀得到还原沉淀物，再对其用双氧水氧化得到粗品达肝素钠，再用超滤膜进行超滤后冻干得到精品达肝素钠成品。
上述已授权的2篇专利基本思路是一致的，但均具有一定的缺点，专利CN101942038A在制备过程中以精品肝素钠为原料，难以从源头控制肝素钠的 质量，并且增加了制备达肝素钠的成本。在制备过程中，加入了含有甲基的有机溶剂，致使在最终达肝素钠原料标准中需要控制有机溶剂残留，增加检测工作量和降低了产品的质量，和缺乏对降解条件系统的、精密的控制，从而导致制备出来的低分子肝素纯度不够，分子量分布不集中，杂质残留过多的缺点，这些都是目前工艺所不能解决的。供给注射剂药物的制备存在一定缺点。专利CN102558393A在上述那专利CN101942038A的基础上进行了一定的简化，首先取消了含有甲基的有机溶剂的使用，减少了纯化水的用量，减少了过滤和紫外除菌的操作步骤和过氧化氢氧化后得过滤，直接用分子量截流滤膜过滤，得到达肝素钠精品。此专利同样以精品肝素钠为原料，这样在生产上原料的获取受到一定的限制，且增加了成本，同时难以从源头控制整个达肝素钠的生产工艺和产品质量。同时使用了昂贵的分子量截流过滤膜，分子量截流过滤膜使用频繁，增加了工艺化生产的成本。
发明内容
针对上述现有技术中存在的不足，本发明提供了一种达肝素钠精品的生产方法，该方法使用肝素钠粗品为原料即可得到质量较好的达肝素钠精品并取得较高的收率，实现了达肝素钠低成本、高效率的工业化生产。
本发明提供的一种制备达肝素钠原料的工艺，其包括如下步骤：
(1)低分子肝素钠粗品的制备
取肝素钠粗品加入纯化水溶解。调节溶液pH至2.6-2.8，加入亚硝酸钠，保持温度在15-25℃搅拌20min，再调节溶液pH至9.5-10.0，加入硼氢化钠搅拌≥15h，盐酸调节溶液pH至3.4-3.6搅拌20min。氢氧化钠调节溶液pH7.0-7.5，254nm紫外灯光照射降解液20-25min，加入乙醇沉淀，静置8h以上，沉淀后的固体再脱水后放入真空干燥箱中，60-65℃干燥40-48h，得到低分子肝素钠粗品。
(2)低分子肝素钠精品制备(凝胶柱层析)
将上述低分子肝素钠粗品用2％氯化钠溶液溶解后加入层析柱内，以2％氯化钠溶液匀速洗拓，接收溶液，测定每一杯的紫外OD200光吸收值，根据数值绘出图谱。借助HPLC测试的分子量及分布数据，确定需通过凝胶层析 除去的大、小分子百分比数，通过公式计算出相对应的需除去的大、小分子面积及相对应体积。收集需要的溶液部分并调节pH至7.0-7.5，乙醇沉淀静置≥8h，脱水后的湿固体60-65℃真空干燥18-24h。
(3)混合溶解
将分批层析出的低分子肝素钠精品合并，测试其分子量及分布，如果小分子部分有偏差，可调节溶液pH7.0-7.5，加入乙醇沉淀对小分子片段进行调节，使其达到符合要求。将分子量及分布合格的低分子肝素钠精品加入13#氧化罐内，加入纯化水和氯化钠，搅拌溶解。
(4)双氧水氧化
调节上述13#氧化罐内溶液pH10.5-11.0，加入30％过氧化氢氧化≥4-5h。结束后调节pH7.9-8.1，加入无水亚硫酸钠搅拌30min后过滤，得到达肝素钠粗品溶液。
(5)除菌过滤
调节达肝素钠粗品溶液pH5.6-5.8，将0.45μm和0.2μm滤膜串连，0.45μm端口和13#氧化罐出口相连，打开反应罐出口阀门，使罐内液体依次通过0.45μm和0.2μm过滤膜，除菌过滤后的达肝素钠溶液收集在洁净沉淀罐中。
(6)达肝素钠精品的制备
过滤后的达肝素钠溶液加入乙醇沉淀静置≥8h以上。后过滤并用乙醇脱水、离心机脱水真空干燥得到精品达肝素钠。
在步骤(1)中肝素钠粗品和纯化水投料比(W/V)为1.0：8.5-10，优选为1.0：9.2-9.5。肝素钠粗品和亚硝酸钠的投料比(W/W)为100：1.5-2.5，优选为100：1.5-2.0。亚硝酸钠和硼氢化钠的投料比(W/W)为1.0：0.3-0.5，优选为1.0：0.35-0.42。亚硝酸钠反应时体系温度维持在15-30℃，4mol/L盐酸调节pH2.6-2.8，通过用淀粉-碘化钾试纸测试溶液确定反应结束，5mol/L氢氧化钠调节溶液pH至9.0-10.5。254nm紫外灯置于降解后的溶液中进行灭菌，加入溶液体积和乙醇体积(V/V)为1.0：0.65-0.75，优选0.65-0.70来沉淀。沉淀出的低分子肝素钠粗品在生产上需要再用乙醇脱水三次，第一次用的乙醇和投料的肝素钠粗品的比(V/W)为3.0-5.0：1.0，优选为3.5-4.0：1.0，第二次 和第三次用的乙醇为前一次用量的50％，每次脱水间隔2h以上，并对得到的低分子肝素钠样品进行分子量及分布测试。
在步骤(2)中需要用2％氯化钠溶液平衡层析柱1-2h，流速约为一个柱床体积/2小时。用2％的氯化钠溶液溶解步骤(1)得到的低分子肝素钠粗品，使最终溶液体积和低分子肝素钠粗品重量(V/W)为7.0-8.5：1.0，优选为7.5-8.0：1.0。上述溶液通过恒流泵加入层析柱内，在加样过程中保证凝胶界面的平整。加完样品后，用2％氯化钠溶液匀速洗拓凝胶柱，通过前面粗品的HPLC分子量及分布测试结果并通过下面公式计算出相对应的需除去的大、小分子面积及相对应体积。
A.设除去的大分子部分面积的百分比为X％
低分子原料的大分子含量％-X％＝(15～25)％
100％-X％
X％＝低分子原料的大分子含量％-(15～25)％
100％-(15～25)％
＝____________＝____________＝__________％
公式一
B.设除去的小分子部分面积的百分比为Y％
低分子原料的小分子含量％-Y％＝-≤13％
100％-Y％
Y％＝低分子原料的小分子含量％+≤13％
100％+≤13％
＝__________＝____________＝__________％
公式二
收集的中间洗拓液用其2倍体积的乙醇来沉淀，沉淀物再用乙醇来脱水三次，第一次用的乙醇和投料的低分子肝素钠粗品的比(V/W)为3.0-5.0：1.0，优选为3.5-4.0：1.0，第二次和第三次用的乙醇为前一次用量的50％，每次脱水间隔2h以上。
在步骤(3)中主要是对层析出的低分子肝素钠进行分子量和分子量分布的测试，如果测试出的结果显示小分子部分(<3000)不满足≤13.0％的要求，可对层析出来的低分子肝素钠精品用纯化水溶解，并调节pH7.0-7.5，乙醇沉淀，使其达到符合要求。将分子量及分布合格的低分子肝素钠精品和纯化水(W/V)为1.0：8.5-10，优选为1.0：9.2-9.5，氯化钠和纯化水(W/V)为0.8-1.5：100，优选为0.9-1.2：100，装在13#氧化罐内。
在步骤(4)中将上述步骤(3)中的溶液用氢氧化钠调节溶液pH10.5-11.0，加入的30％过氧化氢和溶液(V/V)为0.25-0.45：100，优选为0.25-0.3：100，氧化时间为4-5h。无水亚硫酸钠和过氧化氢(W/V)为0.20-0.30：1.0，优选为0.20-0.25：1.0。
在步骤(5)中需要做0.2μm和0.45μm滤膜完整性试验。确保生产中使用的滤膜能够满足除菌过滤要求。
在步骤(6)中过滤后的达肝素钠溶液用2.0倍体积的乙醇沉淀。沉淀出的达肝素钠精品用乙醇脱水三次，第一次用的乙醇和投料的低分子肝素钠精品的比(V/W)为3.0-5.0：1.0，优选为3.5-4.0：1.0，第二次和第三次用的乙醇为前一次用量的50％，每次脱水间隔2h以上。
本发明是针对现有的达肝素钠生产工艺进行优化和改进，使用肝素钠粗品为原料，现通过降解、还原、乙醇沉淀得到低分子肝素钠粗品，相对于需要使用肝素钠精品为原料，方法适用范围更广，更可以从源头控制达肝素钠 精品的质量。创新性的通过对层析前的低分子肝素钠粗品的HPLC测试其分子量及分布和公式计算出层析过程中滤液的收集，确定洗拓液中哪些需要保留，哪些需要舍弃，且非常有效并准确的定量到符合要求的低分子肝素钠精品液，避免了昂贵的分子量截流过滤膜的使用，这是现有的技术中所没有的。低分子肝素钠精品通过氧化反应得到达肝素钠粗品，反应液通过过滤、沉淀、干燥得到达肝素钠精品。从氧化、除菌过滤、沉淀脱水实现了“一锅煮”的工艺，在操作上实现了简化，节省了时间和人力成本，该工艺在现有的技术基础上开发出了一条新的制备达肝素钠精品的方法，且在本公司实现了达肝素钠的工业化生产。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。
实施例1
加入90L水和肝素钠粗品10kg至反应罐内，搅拌使其完全溶解，用4mol/L盐酸调节罐内溶液为pH值为2.7，称取0.18kg亚硝酸钠加入烧杯中，向烧杯中加入1620mL纯化水，搅拌溶解后，加入反应罐内，维持罐内溶液pH值为2.6-2.8，搅拌反应20min后用淀粉-碘化钾试纸测试溶液，观察试纸颜色，直至试纸不显蓝色为止。用5mol/L氢氧化钠溶液调节体系pH值为9.6，加入0.072kg硼氢化钠至反应罐内，搅拌反应16h，再用4mol/L盐酸调节溶液pH值为3.5，搅拌20min。再用5mol/L氢氧化钠溶液调节体系pH值至7.5，将波长254nm的紫外灯接通电源，放入反应罐内照射20min，溶液体积为132L，所以将88.4L乙醇缓慢倒入反应罐内，边加边搅拌，充分搅拌均匀，沉淀静置10h,倒去上清液，沉淀物中再加入40L乙醇脱水，搅拌2h倒去上清液，沉淀物再加入20L乙醇脱水，2h后倒去上清液，沉淀物再加入20L乙醇脱水，2h后倒去上清液，将脱水后的湿固体装入不锈钢盘中，放入真空干躁箱60～65℃干燥48h，对降解物称重得到7.15kg低分子肝素钠粗品，收率71.50％。HPLC分子量及分布：分子量为6550，>8000部分为26.51％(应10.0-30.0％)，<3000部分15.5％(应≦30.0％)，N-NO残留<0.25ppm(应 ≦0.25ppm)。
称量3kg氯化钠溶入纯化水中，搅拌溶解使最终体积为150L，得到2％的氯化钠溶液，称量降解后的低分子肝素钠粗品0.4kg，加入2％的氯化钠溶液，搅拌溶解使最终体积为3200mL，调节溶液pH为7.0，打开恒流泵，用2％的氯化钠溶液平衡层析柱1-2h，平衡流速为145mL/min，平衡完毕，当氯化钠溶液流淌至凝胶界面上1-2cm处，关闭恒流泵及出水阀。将溶解后的溶液用恒流泵缓缓加入层析柱内，初加时流速不可过快，防止破坏凝胶界面的平整。当溶液加至凝胶界面之上5cm左右时，打开出水阀，同时加快加样的流速，直至样品加完。当低分子肝素钠粗品溶液流淌至凝胶界面上1-2cm处时，开始接样。同时，用恒流泵小心缓慢泵入2％氯化钠溶液。共接收60杯溶液，总体积30L，根据HPLC分子量及分布，总面积65.29，大分子部分约为6.79，小分子部分面积约13.71。通过公式一计算除去的大分子部分面积为10.4％，体积为6.5L，公式二计算除去的小分子部分面积为21％，体积为10.75L，这样中间收集部分面积约44.79，占总面积68.6％，体积12.75L，因此需去掉前13杯和后21.5杯，向收集的中间12.75L洗拓液中加入25.5L乙醇，边加边搅拌，充分搅拌均匀，沉淀静置14h,倒去上清液，沉淀物中再加入28.6L乙醇脱水，搅拌2h倒去上清液，沉淀物再加入14.3L乙醇脱水，2h后倒去上清液，沉淀物再加入7.2L乙醇脱水，2h后倒去上清液，将脱水后的湿固体装入不锈钢盘中，放入真空干躁箱60-65℃干燥48h，称重得到低分子肝素钠精品0.31kg，收率77.50％。
用上述层析法将另外6.75kg的低分子肝素钠粗品纯化出来，共得到低分子肝素钠精品5.41kg，收率75.66％。对合并后的低分子肝素钠精品测试分子量及分布，符合要求。将低分子肝素钠精品5.41kg，0.49kg氯化钠和48.69L纯化水加入13#氧化罐内，搅拌溶解。
溶液体积为51.64L，用5mol/L氢氧化钠调节溶液pH10.8。加入155mL30％过氧化氢，氧化时间4-5h，每小时测试一次pH值，维持体系pH值在10.5-11.0范围内。用4mol/L盐酸调节溶液pH8.0，加入38.75g无水亚硫酸钠还原，搅拌30min。
用4mol/L盐酸调节上述反应完的溶液pH值至5.8，用纯化水冲洗0.45um滤膜至中性，然后将其和13#氧化罐出口正确安装。对0.2μm滤膜进行完整性试验，检测合格后安装在0.45um滤膜和洁净区沉淀罐之间固定位置，然后开始过滤，滤液放在洁净沉淀罐中，过滤完成后用10.4L1％的氯化钠冲洗氧化罐也放入沉淀罐中，得到达肝素钠粗品溶液总体积为63L。
开启沉淀罐中搅拌装置，将126L乙醇缓慢加入沉淀罐中，乙醇加完后继续搅拌3-5min，然后静置沉淀14h，倾去上清液，加入21.64L乙醇搅拌脱水至细颗粒状，静置2h，真空抽去上清液，加入10.82L乙醇搅拌脱水至细颗粒状，静置2h真空抽去上清液，加入5.41L乙醇搅拌脱水至细颗粒状，静置2h真空抽去上清液，将达肝素钠沉淀物用离心机脱水15min后分装到不锈钢盘中，真空干燥45-75℃40-44h得到4.12kg达肝素钠精品，收率76.16％。
实施例2
加入85L水和肝素钠粗品10kg至反应罐内，搅拌使其完全溶解，用4mol/L盐酸调节罐内溶液为pH值为2.7，称取0.15kg亚硝酸钠加入烧杯中，向烧杯中加入1650mL纯化水，搅拌溶解后，加入反应罐内，维持罐内溶液pH值为2.6-2.8，搅拌反应25min后用淀粉-碘化钾试纸测试溶液，观察试纸颜色，直至试纸不显蓝色为止。用5mol/L氢氧化钠溶液调节体系pH值为9.8，加入0.045kg硼氢化钠至反应罐内，搅拌反应18h，再用4mol/L盐酸调节溶液pH值为3.5，搅拌23min。再用5mol/L氢氧化钠溶液调节体系pH值至7.3，将波长254nm的紫外灯接通电源，放入反应罐内照射20min，溶液体积为126L，将82.55L乙醇缓慢倒入反应罐内，边加边搅拌，充分搅拌均匀，沉淀10h,倒去上清液，沉淀物中再加入30L乙醇脱水，搅拌2h倒去上清液，沉淀物再加入15L乙醇脱水，2h后倒去上清液，沉淀物再加入7.5L乙醇脱水，2h后倒去上清液，将脱水后的湿固体装入不锈钢盘中，放入真空干躁箱60-65℃干燥44h，对降解物称重得到7.18kg低分子肝素钠粗品，收率71.80％。HPLC分子量及分布：分子量为6450，>8000部分为26.50％(应10.0-30.0％)，<3000部分15.5％(应≦30.0％)，N-NO残留<0.25ppm(应≦0.25ppm)。
称量3kg氯化钠溶入纯化水中，搅拌溶解使最终体积为150L，得到2％ 的氯化钠溶液，称量降解后的低分子肝素钠粗品0.4kg，加入2％的氯化钠溶液，搅拌溶解使最终体积为3200mL，调节溶液pH为7.0，打开恒流泵，用2％的氯化钠溶液平衡层析柱1-2h，平衡流速为140mL/min，平衡完毕，当氯化钠溶液流淌至凝胶界面上1-2cm处，关闭恒流泵及出水阀。将溶解后的溶液用恒流泵缓缓加入层析柱内，初加时流速不可过快，防止破坏凝胶界面的平整。当溶液加至凝胶界面之上5cm左右时，打开出水阀，同时加快加样的流速，直至样品加完。当低分子肝素钠粗品溶液流淌至凝胶界面上1-2cm处时，开始接样。同时用恒流泵小心缓慢泵入2％氯化钠溶液。共接收60杯溶液，总体积30L，根据HPLC分子量及分布，总面积67.74，大分子部分约为7.04，小分子部分面积约14.23。通过公式一计算除去的大分子部分面积为10.4％，体积为7.75L，公式二计算除去的小分子部分面积为21％，体积为9.5L，这样中间收集部分面积约46.47，占总面积68.6％，体积12.75L，因此需去掉前15.5杯和后19杯。向收集的中间12.75L洗拓液中加入25.5L乙醇，边加边搅拌，充分搅拌均匀沉淀静置14h倒去上清液，沉淀物中再加入28.6L乙醇脱水，搅拌2h倒去上清液，沉淀物再加入14.3L乙醇脱水，2h后倒去上清液，沉淀物再加入7.2L乙醇脱水，2h后倒去上清液，将脱水后的湿固体装入不锈钢盘中，放入真空干躁箱60-65℃干燥48h，称重得到低分子肝素钠精品0.29kg，收率72.50％。
用上述层析法将另外6.78kg的低分子肝素钠粗品纯化出来，共得到低分子肝素钠精品5.45kg，收率75.91％。对合并后的低分子肝素钠精品测试分子量及分布，符合要求。将低分子肝素钠精品5.45kg，0.37kg氯化钠和46.33L纯化水加入13#氧化罐内，搅拌溶解。
溶液体积为49.24L，用5mol/L氢氧化钠调节溶液pH10.5。加入123mL30％过氧化氢，氧化时间4.4h，每小时测试一次pH值，维持体系pH值10.5-11.0。用4mol/L盐酸调节溶液pH7.9，加入24.60g无水亚硫酸钠还原，搅拌30min。
用4mol/L盐酸调节上述反应完的溶液pH值至5.6，用纯化水冲洗0.45um滤膜至中性，然后将其和13#氧化罐出口正确安装。对0.2μm滤膜进行完整 性试验，检测合格后安装在0.45um滤膜和洁净区沉淀罐之间固定位置，然后开始过滤，滤液放在洁净沉淀罐中，过滤完成后用9.85L1％的氯化钠溶液冲洗氧化罐，冲洗液也放入沉淀罐中，得到达肝素钠粗品溶液总体积为60.2L。
开启沉淀罐中搅拌装置，将120.4L乙醇缓慢加入沉淀罐内，乙醇加完后继续搅拌3-5min，然后静置沉淀10h，倾去上清液，加入16.35L乙醇搅拌脱水至细颗粒状，静置2h，真空抽去上清液，加入8.18L乙醇搅拌脱水至细颗粒状，静置2h，真空抽去上清液，加入4.09L乙醇搅拌脱水至细颗粒状，静置2h真空抽去上清液，将达肝素钠沉淀物用离心机脱水15min后分装到不锈钢盘中，真空干燥45-75℃40-44h得到4.14kg达肝素钠精品，收率75.96％。
实施例3
加入100L水和肝素钠粗品10kg至反应罐内，搅拌使其完全溶解，用4mol/L盐酸调节罐内溶液pH值为2.7，称取0.25kg亚硝酸钠加入烧杯中，向烧杯中加入1550mL纯化水，搅拌溶解后，加入反应罐内，维持罐内溶液pH值为2.6-2.8，搅拌反应25min后用淀粉-碘化钾试纸测试溶液，观察试纸颜色，直至试纸不显蓝色为止。用5mol/L氢氧化钠溶液调节体系pH值为10.0，加入0.125kg硼氢化钠至反应罐内，搅拌反应16h，再用4mol/L盐酸调节溶液pH值为3.6，搅拌25min。再用5mol/L氢氧化钠溶液调节体系pH值至7.5，将波长254nm的紫外灯接通电源，放入反应罐内照射20min，溶液体积为148L，将111L乙醇缓慢倒入反应罐内，边加边搅拌，充分搅拌均匀，沉淀13h,倒去上清液，沉淀物中再加入50L乙醇脱水，搅拌2h倒去上清液，沉淀物再加入25L乙醇脱水，2h后倒去上清液，沉淀物再加入12.5L乙醇脱水，2h后倒去上清液，将脱水后的湿固体装入不锈钢盘中，放入真空干躁箱60-65℃干燥45h，对降解物称重得到7.22kg低分子肝素钠粗品，收率72.20％。HPLC分子量及分布：分子量为5950，>8000部分为20.00％(应10.0-30.0％)，<3000部分9.5％(应≦30.0％)，N-NO残留<0.25ppm(应≦0.25ppm)。
称量3kg氯化钠溶入纯化水中，搅拌溶解使最终体积为150L，得到2％的氯化钠溶液，称量降解后的低分子肝素钠粗品0.4kg，加入2％的氯化钠溶液，搅拌溶解使最终体积为3200mL，调节溶液pH为7.0，打开恒流泵，用 2％的氯化钠溶液平衡层析柱1-2h，平衡流速为140mL/min，平衡完毕，当氯化钠溶液流淌至凝胶界面上1-2cm处，关闭恒流泵及出水阀。将溶解后的溶液用恒流泵缓缓加入层析柱内，初加时流速不可过快，防止破坏凝胶界面的平整。当溶液加至凝胶界面之上5cm左右时，打开出水阀，同时加快加样的流速，直至样品加完。当低分子肝素钠粗品溶液流淌至凝胶界面上1-2cm处时，开始接样。同时用恒流泵小心缓慢泵入2％氯化钠溶液。共接收60杯溶液，总体积30L，根据HPLC分子量及分布，总面积64.70，大分子部分约为1.579，小分子部分面积约9.977。通过公式一计算除去的大分子部分面积为2.44％，体积为4.5L，公式二计算除去的小分子部分面积为15.42％，体积为8.5L，这样中间收集部分面积约53.147，占总面积82.14％，体积17.00L，因此需去掉前9杯和后17杯。向收集的中间17.00L洗拓液中加入34L乙醇，边加边搅拌，充分搅拌均匀，沉淀静置15h,倒去上清液，沉淀物中再加入36.1L乙醇脱水，搅拌2h倒去上清液，沉淀物再加入18.05L乙醇脱水，2h后倒去上清液，沉淀物再加入9.03L乙醇脱水，2h后倒去上清液，将脱水后的湿固体装入不锈钢盘中，放入真空干躁箱60～65℃干燥48h，称重得到低分子肝素钠精品0.298kg，收率74.50％。
用上述层析法将另外6.82kg的低分子肝素钠粗品纯化出来，共得到低分子肝素钠精品5.53kg，收率76.59％。对合并后的低分子肝素钠精品测试分子量及分布，符合要求。将低分子肝素钠精品5.53kg，0.83kg氯化钠和55.3L纯化水加入13#氧化罐内，搅拌溶解。
溶液体积为58.48L，用5mol/L氢氧化钠调节溶液pH11.0。加入263mL30％过氧化氢，氧化时间4.6h，每小时测试一次pH值，维持体系pH值10.5-11.0。用4mol/L盐酸调节溶液pH8.1，加入78.90g无水亚硫酸钠还原搅拌30min。
用4mol/L盐酸调上述反应完的溶液pH值至5.8，用纯化水冲洗0.45um滤膜至中性，然后将其和13#氧化罐出口正确安装。对0.2μm滤膜进行完整性试验，检测合格后安装在0.45um滤膜和洁净区沉淀罐之间固定位置，然后开始过滤，滤液放在洁净沉淀罐中，过滤完成后用11.70L1％的氯化钠溶 液冲洗氧化罐，冲洗液也放入沉淀罐中，得到达肝素钠粗品溶液总体积为66.4L。
开启沉淀罐中搅拌装置，将132.8L乙醇缓慢加入沉淀罐内，乙醇加完后继续搅拌3-5min，然后静置沉淀10h，倾去上清液，加入27.65L乙醇搅拌脱水至细颗粒状，静置2h真空抽去上清液，加入13.83L乙醇搅拌脱水至细颗粒状，静置2h真空抽去上清液，加入6.91L乙醇搅拌脱水至细颗粒状，静置2h真空抽去上清液，将达肝素钠沉淀物用离心机脱水15min后分装到不锈钢盘中，真空干燥45-75℃40-44h得到4.28kg达肝素钠精品，收率77.40％。
试验例1
按欧洲药典对实施例1-3得到达肝素钠精品的各项药学指标进行检验，将检验结果记录在下表1中：
表1


现有技术中达肝素钠精品抗Xa效价及抗Xa效价/抗Ⅱa效价的比值均不高，抗栓活性还不是十分理想(抗Xa效价一般在150以下，抗Xa效价/抗Ⅱa效价的比值一般不超过3.0)。从表1结果可以看出，通过本发明提供的达肝素钠精品的生产方法得到的达肝素钠在抗Xa效价及抗Xa效价/抗Ⅱa效价的比值等性能指标上明显优于现有技术。
以上对本发明所提供的一种达肝素钠精品的生产方法进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰。这些改进和修饰也应当落入本发明权利要求的保护范围内。