《玉米淹水胁迫响应ZMERF12基因启动子.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《玉米淹水胁迫响应ZMERF12基因启动子.pdf（5页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 102876673 A (43)申请公布日 2013.01.16 C N 1 0 2 8 7 6 6 7 3 A *CN102876673A* (21)申请号 201110199204.9 (22)申请日 2011.07.15 C12N 15/113(2010.01) C12N 15/82(2006.01) A01H 5/00(2006.01) (71)申请人长江大学 地址 434023 湖北省荆州市南环路1号 (72)发明人黄敏 杜何为 张祖新 陈威 黄育刚 范金香 吴闯 (74)专利代理机构北京市中实友知识产权代理 有限责任公司 11013 代理人熊成香 (54)。
2、 发明名称 玉米淹水胁迫响应zmERF12基因启动子 (57) 摘要 本发明涉及玉米淹水胁迫响应zmERF12基因 启动子，其特征在于公开了zmERF12基因启动子 的DNA序列，该启动子的特征是：含有2个G-box、 5个ABRE、1个CCAAT-box、4个CGTCA-motif、1个 GARE-motif、1个GC-motif、1个TCA-element、1 个TGA-element和1个as1顺式元件，这些顺式元 件与植物激素、厌氧胁迫响应相关，是一个组织特 异型的启动子，只在根系中表达；是一个诱导型 的启动子，受淹水诱导高效表达。该启动子在淹 水、涝渍条件下，可提高转基因植株根部的抗。
3、虫、 抗病、抗逆境能力；同时只在根部表达，不涉及食 用转基因植物地上部分的食品安全问题；在旱生 植物的耐渍遗传改良中，具有很好的应用前景。 (51)Int.Cl. 权利要求书1页 说明书3页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 3 页 1/1页 2 1.玉米淹水胁迫响应zmERF12基因启动子，其特征在于zmERF12基因启动子的DNA序 列为： TGGAGTGGACAGTGGAGTGGGAGGTTGCTGTGTCTCGGAGCTGTGTGGCGGGCGCGCTGCCTTATA TAGACAATAGAGGCGCGTCTGGCTGGCGACGA。
4、GTGCGTGTGCCGGGGCTGCGGTGGAGAGTGCTGA CGCGGCAAAGGCAACGAACGGCGGCAGCTTCCTGACGAGAAGCCGTGGGCCGCTCCCAAATCCGGA GCCGTCGTTCAGTTCAGGCAGCGTGTGTTCCGAGCCTCGCTTCCGGAGCTGCGGTGGCGGTTTTTC AACGGCACAGGACCACCATTACGCTGCTGCTGGACGATGTGCGGACCACGGTTTGGGATCCGCCGG CGCCGATCCGGTCCGGCGGCCTCTGTTTTCGTTTTCTCCGTCGCCACGGCTGTTACTGCTAGCT。
5、TT GATGCACGCCTGCAGGTAGCCTGCCACGTGTGCCTAGCACTGTGGCACGTGCTAACCACACGCCCG CCGTTTGTTTTGCTTACCACGCAAACACGTAGTGCTTCATCTGTCAACAAAGAATACAACCCCTAA ATTACCTATGGGTTAAAATAGTTTTATGTTTAGCCAACCTTCTAAGTAGTAAATAGTATATTCACA GCTATAGCTTTAAACTAATTTATTATCAAAAATGCAATTCATACTTTAATCTAATAGTATTATATT GTTTTAATACCGTACATACTAATATCTGT。
6、TCATATATTATTTACCAAACTTATGATATTCTTATAC TATGGTACTACGCTTAAAATTGTATTCTTCCATGGAGTACCTGCTTATTTCACGTGACTGAAGAAC CAACTTTTTCGTAGGTACTAGGTTTCTTTTTCACCTGAATACGACGCAGACGATTTAAGATACCAG AGATAACGATGACGTCACGTCGCCTTTTTTCCCCCTATTTGCTTTTGACTACATATATAATATAGT CAAGTTGGAGTATACTTATATATTATATATAGCCTACTTTGTCGTCGGCCGCCGGAAGAGA。
7、CGGCG ACTCTGAAATCTGAAAGAAATAAAACAGCGACGAAAGGAGGTAGCTCCCTCCCTACCTCTCCACTT GAAACG。 2.根据权利要求1所述的玉米淹水胁迫响应zmERF12基因启动子，其特征在于所述的 启动子是从玉米自交系Mo17中克隆获得的。 3.根据权利要求2所述的玉米淹水胁迫响应zmERF12基因启动子，其特征在于在涝渍、 淹水条件下，zmERF12启动子可以启动目的基因在植株根部大量表达。 权 利 要 求 书CN 102876673 A 1/3页 3 玉米淹水胁迫响应 zmERF12 基因启动子 技术领域 ： 0001 本发明涉及玉米淹水胁迫。
8、响应zmERF12基因启动子，属植物基因工程技术领域。 背景技术 ： 0002 南方玉米在正常的生长环境中，由于季节性降雨，在苗期经常遭受绵绵春雨，在花 期和灌浆期则往往遭遇梅雨。在长期阴雨下，排灌系统不良及地下水位升高等原因造成土 壤渍水，使玉米根系长期处于低氧状态，导致产量下降15-25，有时甚至高达50。渍 害已成为南方玉米稳产和高产的重要制约因素。因此，了解玉米对渍害的耐/敏反应、鉴定 重要的耐渍基因，对于阐明玉米耐渍性的分子生物学机理和玉米的耐渍性的遗传改良十分 重要。 0003 ERF基因是参与植物非生物胁迫响应的关键基因之一，是水稻、深水稻和拟南芥淹 水胁迫响应的关键基因。因此，。
9、克隆玉米ERF基因的启动子，有助于阐明玉米耐渍性形成的 分子机制，同时为玉米及其他旱生作物的耐渍遗传改良提供理论指导。然而，玉米ERF启动 子的克隆，目前，尚未见有报道。 发明内容 ： 0004 本发明的目的在于提供玉米淹水胁迫响应zmERF12基因启动子，并提供zmERF12 基因启动子在植物耐渍遗传改良中的应用。 0005 本发明的技术方案是： 0006 1、zmERF12基因的获得 0007 根据已知的玉米基因组信息，使用烟草ERF2蛋白的AP2/ERF结构域高度保守的 蛋白质序列，进行同源比对分析，电子克隆出121个ERF基因。通过与拟南芥、水稻、烟草 等其他植物ERF基因的比较分析，。
10、剔除48个假阳性，获得了73个ERF基因，分别命名为 zmERF1-zmERF73。玉米自交系Hz32的耐渍性较强，而Mo17耐渍性较弱，在玉米3叶1心 期，分别对Hz32和Mo17进行0、4、12h的淹水处理，并利用real-time PCR对73个ERF基 因在各处理根系的表达进行了分析，结果发现zmERF12基因在Mo17根系受淹水诱导高效表 达，而在Hz32根部表达量较低，结果也暗示zmERF12基因的启动子是淹水胁迫响应的诱导 型启动子。 0008 2、玉米自交系Mo17叶片总DNA的提取 0009 取玉米叶片5.0g于液氮中研磨，转入50ml离心管中。加预热至95的CTAB缓冲 液。
11、(1.17MNaCL、0.0016M EDTA-8.0，0.835M Ttis-7.5，1.6CTAB，1-疏基乙醇)10ml， 混匀。在65水浴锅内反应90分钟，不时轻摇离心管。取出离心管，待冷至室温后，加入 等体积氯仿异醇(241)，小心摇动试管10分钟。8000rpm离心10分钟，将上清转至另 一50ml离心管中。加2/3体积异丙醇，小心混匀，将棉絮状DNA转入盛10ml 70乙醇的 50ml离心管中，浸泡12小时。倒掉70乙醇，将DNA晾干，加入1ml TE溶解。待DNA完全 溶解后，转入2.0ml离心管中，加入10l 10mg/ml RNaseA，混匀；在37下，温育2小时。 说 明。
12、 书CN 102876673 A 2/3页 4 再用1ml苯酚氯仿异戊醇(25241)抽提一次，8000rpm离心10分钟。将上清液 转入2.0ml离心管中，加入1/10体积的3M NaAC(PH5.2)，2/3体积异丙醇沉淀DNA。将棉絮 状DNA转入2.0ml离心管中，用70乙醇洗涤一次，短暂离心，使DNA贴壁，倒去70乙醇， 晾干DNA。待DNA晾干后，加入0.5ml T.E溶液，完全溶解DNA，于-20长期保存。 0010 3、zmERF12基因启动子的克隆 0011 根据玉米自交系B73 zmERF12基因的启动子序列，设计一对特异引物，左引物： 5TGGAGTGGACAGTGGAG。
13、TGGGAG3，右引物：5CTCCCACTCCACTGTCCACTCCA3。以Mo17的 DNA作为模板，进行PCR扩增。PCR扩增反应体系为：2.5l 10PCR缓冲液，2l 10mM dNTPs，1l 10mM特异引物，1l 10mM特异右引物，1单位Taq酶，40ng模板DNA，总体积 25l。PCR扩增程序为：953分钟；951分钟，611分钟，722分钟30秒，循环35 次；727分钟；430分钟。PCR扩增产物于1琼脂糖凝胶中120伏直流电压电泳45分 钟，使用北京全式金生物技术有限公司的凝胶回收试剂盒，回收特异DNA片段，并将该DNA 片段连接到pGEM-T easy载体上，进行。
14、DNA测序。 0012 4、转化载体的构建 0013 使用带酶切位点的引物(左引物加HindIII酶切位点，右引物加BamHI酶切位 点)，以玉米自交系Mo17基因组DNA为模板进行PCR扩增。使用凝胶回收试剂盒回收PCR 扩增特异DNA片段，并与pGEM-T easy载体连接，转化Escherichia coli Top10，生长在含 氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体平板上的白色菌株被分离出来。经PCR检测，选择阳 性克隆进行DNA测序。抽提含zmERF12启动子序列正确的质粒DNA，使用HindIII和BamHI 限制性内切酶同时酶切质粒，1琼脂糖凝胶电泳，回收zmERF12启动。
15、子片段。使用HindIII 和BamHI限制性内切酶同时酶切pBI121质粒载体，回收载体片段。将zmERF12启动子片段 与pBI121载体片段在体外进行链接，构建成pBI121-zmERF12-GUS载体，并使用冻融法转化 到农杆菌GV3101菌株中。 0014 对所克隆的zmERF12基因启动子进行DNA测序，其DNA序列如下： 0015 zmERF12基因启动子DNA序列 0016 TGGAGTGGACAGTGGAGTGGGAGGTTGCTGTGTCTCGGAGCTGTGTGGCGGGCGCGCTGCCTTATA 0017 TAGACAATAGAGGCGCGTCTGGCTGGCGACG。
16、AGTGCGTGTGCCGGGGCTGCGGTGGAGAGTGCTGA 0018 CGCGGCAAAGGCAACGAACGGCGGCAGCTTCCTGACGAGAAGCCGTGGGCCGCTCCCAAATCCGGA 0019 GCCGTCGTTCAGTTCAGGCAGCGTGTGTTCCGAGCCTCGCTTCCGGAGCTGCGGTGGCGGTTTTTC 0020 AACGGCACAGGACCACCATTACGCTGCTGCTGGACGATGTGCGGACCACGGTTTGGGATCCGCCGG 0021 CGCCGATCCGGTCCGGCGGCCTCTGTTTTCGTTTTCTCCGTCG。
17、CCACGGCTGTTACTGCTAGCTTT 0022 GATGCACGCCTGCAGGTAGCCTGCCACGTGTGCCTAGCACTGTGGCACGTGCTAACCACACGCCCG 0023 CCGTTTGTTTTGCTTACCACGCAAACACGTAGTGCTTCATCTGTCAACAAAGAATACAACCCCTAA 0024 ATTACCTATGGGTTAAAATAGTTTTATGTTTAGCCAACCTTCTAAGTAGTAAATAGTATATTCACA 0025 GCTATAGCTTTAAACTAATTTATTATCAAAAATGCAATTCATACTTTAATCTAAT。
18、AGTATTATATT 0026 GTTTTAATACCGTACATACTAATATCTGTTCATATATTATTTACCAAACTTATGATATTCTTATAC 0027 TATGGTACTACGCTTAAAATTGTATTCTTCCATGGAGTACCTGCTTATTTCACGTGACTGAAGAAC 0028 CAACTTTTTCGTAGGTACTAGGTTTCTTTTTCACCTGAATACGACGCAGACGATTTAAGATACCAG 0029 AGATAACGATGACGTCACGTCGCCTTTTTTCCCCCTATTTGCTTTTGACTACATATATAATATAGT 。
19、说 明 书CN 102876673 A 3/3页 5 0030 CAAGTTGGAGTATACTTATATATTATATATAGCCTACTTTGTCGTCGGCCGCCGGAAGAGACGGCG 0031 ACTCTGAAATCTGAAAGAAATAAAACAGCGACGAAAGGAGGTAGCTCCCTCCCTACCTCTCCACTT 0032 GAAACG 0033 5、zmERF12启动子拟南芥植株的获得 0034 将含pBI121-zmERF12-GUS载体的GV3101农杆菌接种于LB液体培养基，加入利福 平和卡那霉素至终浓度为100mg/L，28振荡培养。离心收集菌体，用ddH 。
20、2 O稀释至OD 0.8，每100ml菌液加入5.0g蔗糖和50l Silweet L-77。使用floral dip方法对拟南芥 进行转化，成熟后收获种子，将种子播在含100mg/L卡那霉素的MS固体筛选培养基上。从 筛选培养基中长出的抗性植株，经PCR检测后确定为转zmERF12启动子阳性植株。 0035 6、zmERF12启动子活性的检测 0036 将转zmERF12拟南芥于苗期进行淹水处理24h，分别对正常生长和淹水处理的转 基因拟南芥幼苗进行GUS组织化学染色。结果发现，在正常生长条件下，转zmERF12启动子 拟南芥植株的根和叶片，未出现GUS染色的蓝色；而淹水条件下，转zmERF。
21、12启动子拟南芥 的根呈现较强的GUS蓝色，叶片未见GUS蓝色。研究表明zmERF12启动子既是一个在根中 表达的组织特异型启动子，同时也是一个淹水诱导表达的诱导型启动子。 0037 本发明与现有的技术相比具有如下有益效果： 0038 1、zmERF12启动子直接驱动外源基因的转基因植物，淹水条件下快速高效启动外 源基因在植株根部的大量表达，可以提高植株的耐渍性，或抗虫、抗病等能力。 0039 2.zmERF12启动子直接驱动外源基因的转基因植物，由于外源基因只在淹水条件 下诱导表达，且表达部位仅局限于根部，所以对于食用非根部的转基因植物，不存在转基因 食品安全问题。 0040 3、zmERF12启动子为淹水条件下诱导表达的诱导型启动子和只在根部特异表达的 组织特异性启动子、是启动能力较强的强启动子。 具体实施方式 ： 0041 把zmERF12启动子克隆到转化载体上，其后连接一个Tnos终止子，构建成一个转 化载体。将所转化的目的基因以正确的方向，克隆到zmERF12启动子与Tnos终止子之间，构 建好转化载体。然后通过基因枪轰击法或农杆菌法介导法将目的基因转化到受体细胞中， 通过组织培养等技术手段获得转基因植株。在涝渍、淹水条件下，zmERF12启动子可以启动 目的基因在植株根部大量表达。 说 明 书CN 102876673 A 。