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1、(10)申请公布号 CN 102870673 A (43)申请公布日 2013.01.16 C N 1 0 2 8 7 0 6 7 3 A *CN102870673A* (21)申请号 201210218725.9 (22)申请日 2012.06.29 A01H 4/00(2006.01) (71)申请人西北农林科技大学 地址 712100 陕西省杨凌示范区邰城路3号 (72)发明人宋军阳 张显 刘建军 张宁 王保宁 (54) 发明名称 一种野生蕙兰组织培养方法 (57) 摘要 本发明公开了一种野生蕙兰组织培养方法， 包括外植体的选择、外植体处理、培养基配制3 个方面：选择蕙兰假鳞茎叶腋处的侧。
2、芽作为外植 体；本发明采用1/2MS培养基，一方面有利于前 期外植体的诱导，节约了化学试剂，降低了生产成 本，也减少了环境污染。 (51)Int.Cl. 权利要求书2页 说明书8页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 8 页 1/2页 2 1.一种野生蕙兰组织培养方法，其特征在于，包括外植体的选择、外植体处理、培养基 配制3个方面： (1)外植体选择：选择蕙兰假鳞茎叶腋处的侧芽作为外植体； (2)外植体处理步骤为： 1)、将步骤(1)中选好的外植体，从母体切离假鳞茎，切除所有肉质根系及上部叶片， 只保留下面5厘米叶片； 2)、将切除下来的假鳞。
3、茎置于流水下冲洗10分钟； 3)、用镊子从基部依次从外向内剥离假鳞茎上的叶片，露出叶腋处的侧芽； 4)、将剥离叶片露出侧芽的假鳞茎在流水下冲洗20分钟，然后置于洗衣粉溶液中浸泡 15分钟，洗衣粉溶液浓度为10毫升水/克洗衣粉，期间用干净玻璃棒搅拌3次； 5)、浸泡后取出置于流水下冲洗5分钟，用自来水洗3次； 6)、用无菌滤纸吸干表面的水，在无菌滤纸上用手术刀小心地切取侧芽，用消毒纱布包 裹，注意保证侧芽完整无损； 7)、将包有侧芽的纱布包裹置于75的乙醇中，5秒后，从乙醇溶液中取出，用蒸馏水 冲洗3次； 8)、用镊子仔细把侧芽从纱布包裹中取出，置于小烧杯中，用蒸馏水冲洗5次，沥干； 9)、加入。
4、消毒液蒸馏水为15的“84”消毒液浸泡15分钟，期间用玻璃棒搅拌5次； 10)、15分钟以后沥去消毒水，用蒸馏水冲洗5次，沥干后置于超净工作台准备接种； (3)培养基配制 配制6种母液，用移液管分别取10毫升母液1，5毫升母液2，5毫升母 液3，5毫升母液4，5毫升母液5，5毫升母液6，混合，加蒸馏水至450毫升，搅拌制成基本培 养基；然后分别精确秤取毫克NAA，2.1毫克6-BA，20毫克蔗糖，6.5毫克琼脂，2毫克PVP，分 别用适量蒸馏水溶解混合在容器中，用蒸馏水稀释至450毫升，充分搅拌后与前面配好的 450毫升基本培养基混合，用蒸馏水定容至1升，然后加热，边加热边搅拌，直到琼脂粉完全。
5、 溶解，加热至沸腾即可停止，再用蒸馏水补充到1升，加热过程有蒸发，接下来在精确的pH 计上用0.1mol/L的NaOH和0.1mol/L的HCl调整pH至5.7。 2.根据权利要求1所述的野生蕙兰组织培养方法，其特征在于，步骤(3)中，培养基配 方为： 配制MS基本培养基 母液1：50倍母液，配1升培养基取此母液20毫升 NH 4 NO 3 ： 82.5g KNO 3 ： 95g MgSO 4 .7H 2 O： 18.5g 蒸馏水： 1000ml 母液2：100倍母液，配1升培养基取此母液10毫升 CaCl.2H 2 O： 22g 蒸馏水： 500ml 母液3：100倍母液，配1升培养基取此母。
6、液10毫升 KH 2 PO 4 ： 8.5g 蒸馏水： 500ml 权 利 要 求 书CN 102870673 A 2/2页 3 母液4：100倍母液，配1升培养基取此母液10毫升 FeSO 4 .7H 2 O： 2.75g Na 2 .EDTA： 3.73g 蒸馏水： 1000ml 母液5：100倍母液，配1升培养基取此母液10毫升 MnSO 4 .4H 2 O： 2230mg ZnSO 4 .7H 2 O： 860mg H 3 BO 3 ： 620mg KI： 83mg Na 2 MoO 4 .2H 2 O：12.5mg CoCl.6H 2 O： 1.25mg CuSO 4 .5H 2 O。
7、： 1.25mg 蒸馏水： 1000ml 母液6：100倍母液，配1升培养基取此母液10毫升 肌醇： 5g 烟酸： 25mg V B1 ： 5mg V B6 ： 25mg 甘氨酸： 100mg 蒸馏水： 500ml 培养基配方 基本培养基：用1/2MS培养基，用蒸馏水稀释1倍 NAA： 1.8mg/L 6-BA： 2.1mg/L 蔗糖： 20mg/L 琼脂： 6.5mg/L PVP： 2mg/L pH： 5.7。 3.根据权利要求2所述的野生蕙兰组织培养方法，其特征在于，母液4配制的时候，先 分别秤取2.75克FeSO 4 .7H 2 O和3.73克Na 2 .EDTA，各自溶解于450毫升的。
8、蒸馏水中，搅拌或 加热至完全溶解，然后将两种溶液混合，同时倒入第三个1升容量的烧杯，调整pH值至5.5， 最后定容1升。 权 利 要 求 书CN 102870673 A 1/8页 4 一种野生蕙兰组织培养方法 技术领域 0001 本发明属于农业技术领域，涉及一种植物快速扩繁技术，具体涉及一种野生蕙兰 组织培养方法。 背景技术 0002 兰花作为一种著名花卉，在世界花卉产业中占有十分重要的地位。在全球兰花贸 易中，主要以蝴蝶兰、大花蕙兰、文心兰、石斛兰、卡特兰、兜兰、万代兰、文心兰等热带兰附 生兰为主，也就是所谓的“洋兰”。 0003 与洋兰相比，国兰并不具备硕大的花型、艳丽的色彩和挺长的花序，。
9、但是国兰它风 姿飘逸，神韵高雅，且常有清香甚至异香，这些都是洋兰所没有的。国兰在我国有悠久的栽 培历史和深厚的文化底蕴，是深受中国人喜爱的传统名花，在日本、韩国以及东南亚的许多 国家也很受欢迎，国际上又称国兰为“东方兰”。国兰素淡的花色、雅致的花姿、清幽的花香、 婀娜的叶姿和多变的叶艺近年来也逐渐被欧洲消费者所接收，所以不论是国内花卉市场还 国际兰花市场上，国兰蕴藏着不可估量市场价值。 0004 尽管国兰在我国已有千余年的栽培历史，尽管我们有全世界最丰富的国兰野生资 源，然而，国兰在我国花卉产业中却一直处于微不足道的地位，始终没有能够成为一项主导 产业。目前国兰的市场状况是，繁殖主要采用分株方。
10、式，即使产业化程度较高的企业所采用 的繁殖方式，也基本上还是采用传统分株繁殖方式；生产模式以家庭小作坊为主，栽培设施 简陋，交易市场以民间私人交易为主，精品兰花掌握在民间少数私人手中，其实质是一个投 资市场，兰花只是充当了一个资金流动的载体，至使“天价兰花”一度成为公众关注的焦点 问题。(所谓精品兰花实际是野生兰花的自然变异，因为自然界兰花自然变异的几率非常 小，且具有唯一性，加上中国文化赋予这个植物高雅逸致、超凡脱俗的文化内涵，使得精品 国兰近乎成为类似文物和古董那样的投资收藏品)。由于国兰自然分株繁殖速度慢，繁殖系 数低，种源主要来自野生资源，致使一些人对兰花野生资源的疯狂采挖，使兰花的野。
11、生原始 资源遭到了极大的破坏。 0005 上述情况情况似乎为国兰所特有，因为没有任何一种花卉是依靠销售野生资源来 维持其产业的。目前兰花领域的学者以及兰界业内人士都一致认为，出现这种情况的根本 原因是，国兰目前还没有实现真正意义上的产业化生产，产业化生产是国兰发展的必由之 路。要实现一种作物的产业化生产，必须要有成熟而且有效的繁殖技术。所以繁殖问题是 制约国兰产业化的关键。 0006 目前组织培养技术主要应用于蝴蝶兰、大花蕙兰等洋兰，组织培养核心技术主要 由台湾等大的公司和企业控制，国内洋兰企业大部分从事的是种苗、试管苗或者原球茎一 下的下游产业环节。至于国兰，国内少数研究单位或公司掌握了春兰。
12、的组织培养技术，但组 培对象是人工驯化栽培多年的品种，对野生国兰的组织培养国内尚没有成功报道的例子， 尤其是野生蕙兰。 说 明 书CN 102870673 A 2/8页 5 发明内容 0007 为了解决上述技术问题，本发明提供一种野生蕙兰组织培养方法，本发明在多年 试验的基础上，针对野生蕙兰提出了一套有效的组织培养技术体系。 0008 具体技术方案为： 0009 一种野生蕙兰组织培养方法，包括外植体的选择、外植体处理、培养基配制3个方 面： 0010 (1)外植体选择：选择蕙兰假鳞茎叶腋处的侧芽作为外植体； 0011 (2)外植体处理步骤为： 0012 1)、将步骤(1)中选好的外植体，从母体。
13、切离假鳞茎，切除所有肉质根系及上部叶 片，只保留下面5厘米叶片； 0013 2)、将切除下来的假鳞茎置于流水下冲洗10分钟； 0014 3)、用镊子从基部依次从外向内剥离假鳞茎上的叶片，露出叶腋处的侧芽； 0015 4)、将剥离叶片露出侧芽的假鳞茎在流水下冲洗20分钟，然后置于洗衣粉溶液中 浸泡15分钟，洗衣粉溶液浓度为10毫升水/克洗衣粉，期间用干净玻璃棒搅拌3次； 0016 5)、浸泡后取出置于流水下冲洗5分钟，用自来水洗3次； 0017 6)、用无菌滤纸吸干表面的水，在无菌滤纸上用手术刀小心地切取侧芽，用消毒纱 布包裹，注意保证侧芽完整无损； 0018 7)、将包有侧芽的纱布包裹置于75。
14、的乙醇中，5秒后，从乙醇溶液中取出，用蒸 馏水冲洗3次； 0019 8)、用镊子仔细把侧芽从纱布包裹中取出，置于小烧杯中，用蒸馏水冲洗5次，沥 干； 0020 9)、加入消毒液蒸馏水为15的“84”消毒液浸泡15分钟，期间用玻璃棒搅拌 5次； 0021 10)、15分钟以后沥去消毒水，用蒸馏水冲洗5次，沥干后置于超净工作台准备接 种。 0022 (3)培养基配制，配制好6种母液，以1升培养基为例，用移液管分别取10毫升母 液1，5毫升母液2，5毫升母液3，5毫升母液4，5毫升母液5，5毫升母液6，混合，加蒸馏水 至450毫升，搅拌制成基本培养基；然后分别精确秤取毫克NAA，2.1毫克6-BA，。
15、20毫克蔗 糖，6.5毫克琼脂，2毫克PVP，分别用适量蒸馏水溶解混合在容器中，用蒸馏水稀释至450毫 升，充分搅拌后与前面配好的450毫升基本培养基混合，用蒸馏水定容至1升。然后加热，边 加热边搅拌，直到琼脂粉完全溶解，加热至沸腾即可停止，再用蒸馏水补充到1升，加热过 程有蒸发，接下来在精确的pH计上用0.1mol/L的NaOH和0.1mol/L的HCl调整pH至5.7。 注意在带有温度补偿功能的pH计上调节pH值，必须在琼脂凝固前完成。步骤(3)中，培养 基配方为： 0023 (1)、配制MS基本培养基 0024 母液1：(50倍母液，配1升培养基取此母液20毫升) 0025 NH 4 N。
16、O 3 ： 82.5g 0026 KNO 3 ： 95g 0027 MgSO 4 .7H 2 O： 18.5g 说 明 书CN 102870673 A 3/8页 6 0028 蒸馏水： 1000ml 0029 母液2：(100倍母液，配1升培养基取此母液10毫升) 0030 CaCl.2H 2 O： 22g 0031 蒸馏水： 500m1 0032 母液3：(100倍母液，配1升培养基取此母液10毫升) 0033 KH 2 PO 4 ： 8.5g 0034 蒸馏水： 500ml 0035 母液4：(100倍母液，配1升培养基取此母液10毫升) 0036 FeSO 4 .7H 2 O： 2.75。
17、g 0037 Na 2 .EDTA： 3.73g 0038 蒸馏水： 1000ml 0039 母液5：(100倍母液，配1升培养基取此母液10毫升) 0040 MnSO 4 .4H 2 O： 2230mg 0041 ZnSO 4 .7H 2 O： 860mg 0042 H 3 BO 3 ： 620mg 0043 KI： 83mg 0044 Na 2 MoO 4 .2H 2 O：12.5mg 0045 CoCl.6H 2 O： 1.25mg 0046 CuSO 4 .5H 2 O： 1.25mg 0047 蒸馏水： 1000ml 0048 母液6：(100倍母液，配1升培养基取此母液10毫升) 。
18、0049 肌醇： 5g 0050 烟酸： 25mg 0051 V B1 ： 5mg 0052 V B6 ： 25mg 0053 甘氨酸： 100mg 0054 蒸馏水： 500ml 0055 (2)、培养基配方 0056 基本培养基：用1/2MS培养基，即用蒸馏水稀释1倍。 0057 NAA： 1.8mg/L 0058 6-BA： 2.1mg/L 0059 蔗糖： 20mg/L 0060 琼脂： 6.5mg/L 0061 PVP： 2mg/L 0062 pH： 5.7 0063 进一步，母液4配制的时候，先分别秤取2.75克FeSO 4 .7H 2 0和3.73克Na 2 .EDTA， 各自溶。
19、解于450毫升的蒸馏水中，搅拌或加热至完全溶解，然后将两种溶液混合，同时倒入 第三个1升容量的烧杯，调整pH值至5.5，最后定容1升。 0064 本发明的有益效果：与现有的相关技术相比，本发明组织培养外植体选用侧芽，而 说 明 书CN 102870673 A 4/8页 7 现有技术体系外植体采用顶芽或茎尖，每个蕙兰假鳞茎仅有一个顶芽或茎尖，而侧芽的数 量一般在5-12个，相比现有技术，本发明对外植体的利用率比现有技术提高了数倍或十几 倍。 0065 现有技术外植体消毒多采用升汞或其他对人体或环境有害的试剂，本发明采用 “84”消毒液对外植体进行消毒，其消毒效果与现有技术相同，“84”消毒液的主。
20、要成分是次 氯酸钠(自来水消毒用的就是次氯酸钠)。本发明外植体的消毒方法与现有技术相比，一方 面大大降低了消毒成本，另一方面减少了有害试剂对操作人员的威胁，同时也极大减少了 有毒有害试剂对环境的污染。 0066 现有技术多采用MS基本培养基，本发明采用1/2MS培养基，一方面有利于前期外 植体的诱导，同时也节约了化学试剂，降低了生产成本，也减少了环境污染。另外在培养基 的配方上经过大量的组合试验得出了最佳培养基配方，激素配比和培养基pH值是本发明 的核心内容。 具体实施方式 0067 下面结合具体实施例对本发明的方法作进一步详细地说明。 0068 选择需要繁殖培养的野生蕙兰植株，从母体切离假鳞。
21、茎，切除所有肉质根系及上 部叶片，只保留下面5厘米叶片。将切除下来的假鳞茎置于流水下(自来水)冲洗10分钟。 用镊子从基部依次(从外向内)剥离假鳞茎上的叶片，露出叶腋处的侧芽。将剥离叶片露 出侧芽的假鳞茎在流水下冲洗20分钟，然后置于洗衣粉溶液中浸泡15分钟，洗衣粉溶液浓 度为10毫升水/克洗衣粉，期间用干净玻璃棒搅拌3次。浸泡后取出置于流水下冲洗5分 钟，用自来水洗3次。用无菌滤纸吸干表明的水，在无菌滤纸上用手术刀小心地切取侧芽， 用消毒纱布包裹，注意保证侧芽完整无损。将包有侧芽的纱布包裹置于75的乙醇中，5秒 后(注意把握时间)从乙醇溶液中取出，用蒸馏水冲洗3次。用镊子仔细把侧芽从纱布包 。
22、裹中取出，置于小烧杯中，用蒸馏水冲洗5次，沥干。加入1(消毒液)：5(蒸馏水)的“84” 消毒液浸泡15分钟，期间用玻璃棒搅拌数次。15分钟以后沥去消毒水，用蒸馏水冲洗5次， 沥干后置于超净工作台准备接种。 0069 首先配置好6种母液(注意母液4即铁盐的配制方法)，以1升培养基为例，用移 液管分别取10毫升母液1，5毫升母液2，5毫升母液3，5毫升母液4，5毫升母液5，5毫升 母液6，混合，加蒸馏水至450毫升，搅拌制成基本培养基；然后分别精确秤取毫克NAA，2.1 毫克6-BA，20毫克蔗糖，6.5毫克琼脂，2毫克PVP，分别用适量蒸馏水溶解混合在容器中，用 蒸馏水稀释至450毫升，充分搅。
23、拌后与前面配好的450毫升基本培养基混合，用蒸馏水定容 至1升。然后加热，边加热边搅拌，直到琼脂粉完全溶解(一般加热至沸腾即可停止)，再 用蒸馏水补充到1升(加热过程有蒸发)，接下来在精确的pH计上用0.1mol/L的NaOH和 0.1mol/L的HCl调整pH至5.7。注意在带有温度补偿功能的pH计上调节pH值，必须在琼 脂凝固前完成。 0070 pH值调整好以后，开始在准备好的培养瓶(建议用50毫升三角瓶)内进行分装， 每个三角瓶内倒入2-2.5厘米高的培养液，注意不要滴在瓶壁，尽量分装均匀。分装后用专 用封口膜和线绳绑扎封口，与其他接种器具一起放入高压灭菌锅内121灭菌20分钟。 007。
24、1 灭菌结束自然冷却，等冷却到自然温度后置于超净工作台上，同时把其他接种器 说 明 书CN 102870673 A 5/8页 8 具及已经处理好的材料置于超净工作台上，开始接种。接种操作方法与其他组织培养的操 作方法相同。接种后置于培养架上进行培养，方法与常规组织培养相同。 0072 实施例1不同浓度的生长素(NAA)处理对蕙兰根状茎生长量和诱芽的影响 0073 在初期利用经消毒的继代的外植体中，在NAA为5.0mg/L的MS培养基上，成功的 获得了绿色、质地优良的类原球茎。 0074 表1不同浓度的生长素(NAA)处理对根状茎生长量的影响 0075 0076 实施例2不同浓度的BA处理对类原。
25、球茎生长量和诱芽的影响 0077 表3表明，适宜浓度的细胞分裂素BA既是PLB增殖所必需的，也是维持PLB生长 状态所不可缺少的。PLB增殖最适宜的BA浓度为0.1mg/L，其鲜重增长率最高，增殖效果最 佳。不添加BA(对照)时，PLB分化成单芽；而BA浓度过高(2.0mg/L)时，PLB分化形成细 弱的丛生芽(表4)。 0078 表3不同浓度的BA对类原球茎生长量的影响 0079 0080 表4不同浓度的BA处理对类原球茎诱芽的影响 说 明 书CN 102870673 A 6/8页 9 0081 0082 实施例3 NAA对丛生芽诱导的影响 0083 试验结果(表5)表明，生长素NAA虽非丛。
26、生芽诱导所必需，但浓度低于0.5mg/L 的NAA对丛生芽的鲜重的增长表现出明显的促进作用，丛生芽表现健壮；而NAA的添加对丛 生芽的增殖影响不大，除了0.2mg/L的处理表现出轻微的增长(12.2)外，其他处理反而 对丛生苗芽的增殖表现出抑制作用。 0084 表5 NAA浓度对丛生芽生长的影响 0085 0086 实施例4嫩梢高度及IAA对生根的影响 0087 有研究表明，NAA能够促进试管苗的分生但对生根效果不明显，本实验表明，IAA 仅在一定程度上能够促进嫩梢(高度为1.2和2.5cm)生根(表6)，高度才是嫩梢生根的 关键因素。嫩梢在0.5cm时生根率为零，而在1.2cm时，在不同IA。
27、A水平上的平均生根率为 30.61；2.5cm的嫩梢在不同IAA水平上的平均生根率为41.69。在同一IAA浓度水平 上，生根率随着芽的高度的提高呈现上升的趋势；在同一高度下，生根率随着IAA浓度的提 高呈现先升高后下降的趋势，其最佳IAA生根浓度为0.05mg/L。 0088 表6芽的高度及IAA浓度对生根的影响 0089 说 明 书CN 102870673 A 7/8页 10 0090 实施例5培养基种类和状态对春兰类原球茎(PLB)生长的影响 0091 试验表明，在培养20天时，B5培养基上类原球茎增长率最高，MS培养基上生长较 好；培养40天后重新测量，在MS培养基上增长速度最快，达到。
28、139，B5培养基生长速度次 之，达到104。由此可见，一般情况下MS培养基是最适合类原球茎(PLB)生长的。MS培 养基中，离子(硝酸盐、钾盐和铵盐)含量高，保证了组织生长的需要(表7)。与固体培养 基相比，在液体培养基中培养的原球茎生长率要高得多，即生长速度快，鲜重增加迅速，而 且在每个切块上所形成的原球茎个数也显著增加(表8)。 0092 表7不同培养基对春兰类原球茎(PLB)生长的影响 0093 0094 表8培养基状态对春兰类原球茎(PLB)形成的影响 0095 0096 实施例6天然产物对春兰类原球茎(PLB)生长的影响 0097 实验发现添加香蕉浆和苹果汁可以促进类原球茎的生长，。
29、对生根、出芽也有很大 的促进作用，单独使用香蕉浆或苹果汁的效果要差一些。香蕉浆和苹果汁中含有丰富的营 养和生理活性物质。 0098 实施例7温度对春兰类原球茎(PLB)生长的影响 0099 温度对呼吸作用的强烈有显著的影响，主要是对呼吸酶活性的影响，在一定范围 内，随着温度的升高，呼吸作用越强，消耗也越大，类原球茎的生存率也是跟随着下降的，生 说 明 书CN 102870673 A 10 8/8页 11 长状况也就会差一些。实验结果表明20的培养温度是最有利于类原球茎生长的(表9)。 0100 表9温度对春兰类原球茎(PLB)生长的影响 0101 0102 实施例8蔗糖浓度对春兰类原球茎(PL。
30、B)生长的影响 0103 由实验得知，培养基中加有1的蔗糖，春兰类原球茎生长最快，1.5次之，0.5 和2.0最差，蔗糖浓度过低，PLB生长所需能源物质跟不上，长势会差一些，蔗糖浓度过 高，引起细胞内外渗透势变化，植物细胞失水，同样影响生长 0104 实施例9 pH值对春兰类原球茎(PLB)生长的影响 0105 有研究表明高压灭菌会改变培养基中的pH和蔗糖浓度。高压灭菌后，pH低于5 时会增加pH；而高于5时pH会下降。由实验得知，pH5.0培养基处理的原球茎鲜重增加最 多，pH5.5次之，pH4.0和pH7.0时明显抑制生长(表10)。 0106 表10pH值对春兰类原球茎(PLB)生长的影响 0107 0108 以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟 悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简 单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。 说 明 书CN 102870673 A 11 。