对钙受体具活性的芳烷基胺化合物 发明领域
本发明涉及能调节无机离子受体活性的新型分子的设计、开发、组合物及应用。
发明背景
体内某些细胞不仅对化学信号有应答，而且也对胞外钙离子(Ca2+)之类的离子有应答。胞外Ca2+(本文中称之为“[Ca2+]”)浓度改变，这些细胞的功能应答也随之变化。一种此类特殊细胞是分泌甲状旁腺激素(PTH)的甲状旁腺细胞。PTH是调节血液和胞外体液中Ca2+体内平衡的主要内分泌因子。
通过对骨和肾细胞的作用，PTH可增加血液中的Ca2+水平。此种[Ca2+]增加，就可作为一种负反馈信号抑制PTH分泌。[Ca2+]和PTH之间的相互关系，构成维持身体的Ca2+体内平衡的基本机理。
胞外Ca2+直接作用于甲状旁腺细胞，调节PTH分泌。已证实存在一种能检测出[Ca2+]变化的甲状旁腺细胞表面蛋白(Brown等人，366 Nature 574，1993)。甲状旁腺细胞中，此种蛋白起胞外Ca2+的受体的作用(称为“钙受体”)，并能检测出[Ca2+]的变化，和引发功能性细胞应答，即PTH之分泌作用。
胞外Ca2+可对不同细胞功能施加影响(Nemeth等人，在11 CellCalcium 319，1990中有所综述)。胞外Ca2+在旁滤泡(C-细胞)和甲状旁腺细胞中的作用在Nemeth的11 Cell Calcium 323，1990中讨论过。表明这些细胞表达相似的Ca2+受体(Brown等人，366Nature 574，1993；Mithal等人，9 Suppl.1 J.Bone andMineral Res.s282，1994；Rogers等人，9 Suppl.1 J.Boneand Mineral Res.s409，1994；Garrett等人，9 Suppl.1 J.Bone and Mineral Res.s409，1994)。胞外Ca2+对骨破骨细胞的作用，由Zaidi在10 Bioscience Reports 493，1990中讨论过。此外，角化细胞、近肾小球细胞、滋养细胞、胰腺β细胞和脂肪(fat/adipose)细胞等均对胞外钙增加有应答，这种应答很可能反映这些细胞的钙受体的活性。
各种化合物体外模拟胞外钙地能力，由Nemeth等人在(精胺和亚精胺)“Calcium-Binding Protein in Health and Disease”1987，Academic Press，Inc.，pp 33-35文中；Brown等人，在(例如新霉素)128 Endocrinology 3047，1991文中；Chen等人，在(地尔硫及其类似物TA-3090)5 J.Bone and MineralRes.581，1990文中；和Zaidi等人，在(维拉帕米)167 Biochem.Biophys.Res.Commun.807，1990文中均讨论过。Nemeth等人的PCT/US 93/01642，国际公开号WO 94/18959，和Nemeth等人的PCT/US 92/07175，国际公开号WO 93/04373中，描述过可以调节无机离子对具有无机离子受体的细胞的影响、优选调节钙离子对钙受体的影响的各种化合物。
发明背景中所提供的参考文献，并不承认其为先有技术。
发明的概述
本发明以可调节无机离子受体的一种或多种活性的分子为特征，优选该分子可模拟或阻滞胞外Ca2+对钙受体的作用。优选采用此种分子旨在通过改变无机离子受体活性，优选钙受体活性，治疗疾病或失调。
胞外Ca2+处于体内平衡紧密控制之下，并且控制着各种过程，例如血结块、神经和肌肉的兴奋性以及适当的骨形成(钙受体蛋白能使某些特定细胞对胞外Ca2+浓度的变化作出应答。例如，胞外Ca2+抑制甲状旁腺激素从甲状旁腺细胞中分泌出来、抑制破骨细胞的骨吸收，并刺激降钙素从C-细胞中分泌。
调节无机离子受体活性的化合物，可通过对无机离子受体的一种或多种活性施加影响，而用于治疗疾病或失调，从而对病人起到有益效果。例如，骨质疏松症是与年龄相关的失调症，其特征是骨质损失、并增加骨折危险。直接阻隔破骨细胞骨吸收作用的化合物(例如破骨细胞离子模拟化合物)或间接通过提高内源降钙素水平(例如C-细胞离子模拟化合物)，和/或通过降低甲状旁腺激素水平(例如甲状旁腺细胞离子模拟化合物)，均可阻止骨质损失，因此给骨质疏松症患者带来有益效果。
此外，已知以间歇低剂量PTH，可引起骨质合成代谢作用和适当骨再造。这样，化合物及给药方法，可激发甲状旁腺激素暂时提高(例如以甲状旁腺细胞离子溶解物间歇给药)，从而可增加骨质疏松患者的骨质。
另外，以缺损一种或多种无机离子受体活性为特征的疾病或失调，也可以用本发明来治疗。例如某些类型的原发性甲状旁腺机能亢进，以甲状旁腺激素不正常高水平，及甲状旁腺对循环体系钙应答降低为特征。钙受体调节剂可用于调节甲状旁腺细胞对钙的应答。
优选所述化合物调节钙受体活性，并用于能通过调节一种或多种钙受体活性施加影响的疾病和失调的治疗。优选所述疾病或失调以骨和矿物质体内平衡不正常、更优选钙体内平衡不正常为特征。
钙体内平衡不正常以下述效能的一种或多种为特征：(1)血清钙不正常升高或降低；(2)尿中钙排泄不正常升高或降低；(3)骨钙水平不正常升高或降低，如由骨矿物密度测定所评估的值；(4)饮食钙的不正常吸收；(5)循环信使或甲状旁腺激素和降钙素之类激素(它们影响钙体内平衡)产生和/或释放的不正常升高和降低。钙体内平衡的这些不同方面的不正常升高或降低是相对于普通人群的情况而言，这些不正常一般伴有疾病或失调症。
总的来说，调节无机离子受体活性的分子可用于治疗以无机离子体内平衡不正常为特征的疾病。优选该分子调节无机离子受体的一种或多种作用。无机离子受体调节剂包括离子模拟剂(ionmimetics)解离子剂(ionlytics)、钙模拟剂(calcimimetics)和解钙剂(Calcilytics)。
离子模拟剂是模拟在无机离子受体中增加离子浓度效果的分子。优选该分子影响一种或多种钙受体活性。钙模拟剂是影响一种或多种钙受体活性，并优选结合于钙受体的离子模拟剂。
解离子剂是降低或阻滞无机离子对无机离子受体引起的一种或多种活性的分子。优选该分子抑制一种或多种钙受体活性。解钙剂是抑制一种或多种由胞外钙激发的钙受体活性的解离子剂优选结合于钙受体上。
无机离子受体调节剂可以配制成药理学制剂或组合物，便于给病人施用。药理学制剂或组合物是适宜于给哺乳动物，优选人，给药形式的制剂或组合物。有关适于给药形式的考虑因素包括毒性影响、溶解性、给药途径以及保持活性在本领域中是众所周知的。
因此，本发明特征的第一方面是，一种无机离子受体调节剂，该调节剂包含能激发一种或多种无机离子受体活性，或能阻滞由胞外无机离子引起的一种或多种无机离子受体活性的分子，该分子有下述结构式：
式中X各自独立地选自异丙基、CH3O、CH3S、CF3O、脂环以及相连的或稠合的芳环；和
m各自独立地为0-5(包括0和5在内)。
优选芳环和脂环为5-7元环。更优选该芳环和脂环只含碳原子(即不是杂环)。
优选该分子或者能激发一种或多种钙受体活性，或阻滞由胞外钙引起的一种或多种钙受体活性。
本发明特征的另一方面是有下述结构式的无机离子受体调节剂：
式中X各自独立选自H、CH3、CH3O、CH3CH2O、亚甲二氧基、Br、Cl、F、CF3、CHF2、CH2F、CF3O、CH3S、OH、CH2OH、CONH2、CN、NO2、CH3CH2、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、乙酰氧基、脂环和连接的或稠合的芳环；
R各自独立选自氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、烯丙基、异丁基、叔丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、茚基、2，3-二氢化茚基、二氢吲哚基、硫代二氢吲哚基和2-，3-，或4-哌啶基；和
m各自独立为0-5(包括0和5在内)。
该分子可激发一种或多种无机离子受体活性，或阻滞由胞外无机离子引起的一种或多种无机离子受体活性。优选该分子激发一种或多种钙受体活性或阻滞由胞外钙离子引起的一种或多种钙受体活性。
优选实施方案中，R是H、CH3、乙基或异丙基；而X各自独立选自异丙基、CH3O、CH3S、CF3O、脂环、和连接的或稠合的芳环。优选该脂环和连接的或稠合的芳环为5-7元环。更优选该芳环和脂环只含碳原子。
本发明特征的另一方面是，含有选自化合物4L、化合物8J、化合物8U、化合物9R、化合物11X、化合物12U、化合物12V、化合物12Z、化合物14U、化合物16M和化合物16P的分子的无机离子受体调节剂。
本发明特征的其它方面是，使用本文所述制剂，通过调节无机离子受体活性治疗疾病或失调的方法。需要此种治疗的患者可以用标准医疗技术，例如血常规分析加以鉴别。例如，通过检测由无机离子浓度变化影响其产生或分泌的蛋白质的缺损，或检测无机离子或影响无机离子体内平衡的激素水平的不正常即可。
治疗方法包括给病人施用治疗学上有效量的无机离子受体调节剂。优选实施方案中，该方法用于治疗以无机离子体内平衡不正常为特征的疾病或失调，更优选治疗以钙体内平衡不正常为特征的疾病或失调。以钙体内平衡不正常为特征的疾病和失调包括甲状旁腺机能亢进、骨质疏松症和其它骨和矿物质相关失调症等(例如“Harrison′sPrinciples of Internal Medicine”标准医学教科书所述的病症)。使用能模拟或阻滞Ca2+的一种或多种效果的钙受体调节剂来治疗此类疾病和失调，由此直接或间接影响患者体内的蛋白或其它分子的水平。
所谓“治疗学上有效量”，指的是能缓解病人疾病或失调的一种或多种症状到某一程度的药剂用量；使与疾病或失调相关的或起因的一种或多种生理学或生物化学指标，部分或全部恢复正常的药剂用量。
优选实施方案中，病人患有由一种或多种钙受体调节成份水平不正常为特征的疾病或失调，并且所述分子对选自下述一类细胞的钙受体具有活性：甲状旁腺细胞、骨破骨细胞、近肾小球肾细胞、近肾小管肾细胞、远侧肾小管肾细胞、中枢神经系统细胞、末稍神经系统细胞、亨利氏袢(Henle′s loop)和/或汇总管的厚上肢细胞、表皮角化细胞、甲状腺旁滤泡细胞(C-细胞)、肠细胞、胎盘中滋养层细胞、血小板细胞、血管平滑肌细胞、心房细胞、分泌促胃酸激素细胞、分泌高血糖素细胞、肾小球膜细胞、乳房细胞、β细胞、脂肪(fat/adipose)细胞、免疫细胞和GI束细胞。
更优选所述细胞是甲状旁腺细胞，并且所述分子能降低病人血清中甲状旁腺激素水平，甚至更优选所述水平降低到足以引起血浆Ca2+减少的程度，最优选甲状旁腺激素水平降低到正常个体的情况。
因此，本发明特征是通过调节无机离子受体活性，用于治疗疾病和失调的药剂和方法。例如，本发明的分子，可以用来针对不同的细胞类型的对外部钙变化可检测并可应答的钙受体。例如，模拟外部钙的分子可用来选择性地抑制甲状旁腺激素从甲状旁腺细胞中分泌，或抑制破骨细胞再吸收骨，或刺激C-细胞分泌降钙素，此种分子可用于治疗以钙体内平衡不正常为特征的疾病或失调，例如甲状旁腺机能亢进及骨质疏松症。
从下面的优选实施方案及权利要求书的描述，本发明的其它特征和优点是很明显的。
附图简述
图1A-D、 2A-D、 3A-E、 4A-E、 5A-D、 6A-E、 7A-E、 8A-E、 9A-F、 10A-E、11A-E、12A-D、 13A-D、14A-D、15A-D、16A-D、17A-D、18A-E、 19A-D和20A-D表示从二苯丙基-c-苯乙胺衍生的分子化学结构，详述制备和筛选分子家族，以便找出本发明的有用分子。
优选实施方案的说明
本发明介绍能模拟或阻滞无机离子受体中无机离子作用的无机离子受体调节剂。优选使用的无机离子受体调节剂，通过调节无机离子受体活性而治疗疾病和失调。优选该分子用于治疗以离子体内平衡不正常，更优选以钙体内平衡不正常为特征的疾病和失调。无机离子受体调节剂的其它应用，例如诊断上的应用是本领域已知的(Nemeth等人，PCT/US 93/01642，国际公开号WO 94/18959)。I.钙受体
钙受体和编码钙受体的核酸由Nemeth等人(PCT/US 93/01642，国际公开号WO 94/18959)介绍过。钙受体存在于不同细胞类型，例如甲状旁腺细胞、骨破骨细胞、近肾小球肾细胞、近肾小管肾细胞、远侧肾小管肾细胞、中枢神经系统细胞、末梢神经系统细胞、亨利氏袢(Henle′s loop)和/或汇总管厚上肢细胞、表皮角化细胞、甲状腺旁滤泡细胞(C-细胞)、肠细胞、胎盘滋养层细胞、血小板、血管平滑肌细胞、心旁细胞、分泌促胃酸激素细胞、分泌高血糖素细胞、肾小球膜细胞、乳房细胞、β细胞、脂肪细胞、免疫细胞和GI束细胞。这些细胞类型中的钙受体可以不同。也有可能一个细胞具有一种以上的钙受体。
不同细胞的钙受体活性和氨基酸顺序比较表明，存在明显不同的钙受体类型。例如，钙受体可以应答不同二价或三价阳离子。甲状旁腺钙受体应答钙和Gd3+，而破骨细胞应答例如钙的二价阳离子，却并不应答Gd3+。因此，甲状旁腺钙受体在药理学上明显不同于破骨细胞钙受体。
另一方面，存在于甲状旁腺细胞和C-细胞的编码钙受体的核酸顺序表明，这些受体有极相似的氨基酸结构。尽管如此，钙模拟化合物仍然表现出不同的药理学原理，并调节甲状旁腺细胞和C-细胞中不同活性。因此，随着细胞类型或器官的不同，钙受体的药理学性质变化很大，即使这些细胞类型或器官的钙受体有相似的结构亦如此。
一般来说，钙受体对胞外Ca2+亲和性较低(表观Kd值一般大于约0.5mM)。正如由Cooper Bloom和Roth(“The Biochemical Basisof Neuropharmacology”，Ch.4)所定义的，钙离子受体可以包括游离的或键合的效应基因机制，因而，它明显不同于调钙蛋白和肌钙蛋白之类的胞外钙受体。
钙受体应答胞外钙水平的变化。精确的变化取决于具体的受体和含该受体的细胞系。例如，钙对甲状旁腺细胞中钙受体的体外作用包括下述特征：
1.内部钙增加：该增加由于外部钙流入和/或内部钙活动作用。而内部钙增加的特征包括：
(a).[Ca2+]i快速(达到峰值时间＜5秒)和暂时增加，该增加对1μM La3+或1μM Gd3+的抑制作用不感受，并由于用离子霉菌素(ionomycin)予处理(不存在胞外Ca2+)而消失；
(b).该增加不受二氢化吡啶的抑制；
(c).该暂时增加用10mM氟化钠予处理10分钟则消失；
(d).用蛋白激酶C(PKC)活化剂，例如佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯(PMA)、欧瑞香脂(mezerein)，或(-)-indolactam V予处理，可使暂时性增加降低。蛋白激酶C活化剂的总效果，是将对钙的浓度-应答曲线向右移动，而不影响其最大应答，和
(e).用百日咳毒素(100ng/ml持续4小时以上)处理不影响该增加。
2.肌醇-1，4，5-三磷酸酯或二酰基甘油的形成很快(＜30秒)增加。用百日咳毒素(100ng/ml持续4小时以上)处理不影响该增加；
3.多巴胺和异丙基肾上腺素刺激环AMP形成的抑制作用：该效应由百日咳毒素(100ng/ml持续4小时以上)予处理而受到阻滞；
4.PTH分泌抑制作用：用百日咳毒素(100ng/ml持续4小时以上)处理不影响PTH分泌抑制作用。
使用本领域已知技术，可以很容易测定钙对不同细胞中的其它钙受体的作用。此种作用，在有关甲状旁腺细胞中观察到的内部钙增加方面，可以是相似的。但是预料该作用在其它方面是不同的，例如引起或抑制除甲状旁腺激素以外的其它激素释放有所不同。
II.无机离子受体调节剂
无机离子受体调节剂，激发一种或多种无机离子受体活性或者阻滞由胞外无机离子引起的一种或多种无机离子受体活性。钙受体调节剂可以模拟或者阻滞胞外Ca2+对钙受体的作用。优选钙受体调节剂是钙模拟剂和解钙剂。一般的和特别的无机离子受体调节剂结构在前面的叙述以及图1中已提供。
可通过筛选出某些依据表现出特别活性的分子(即前导分子)制作的分子，便可以鉴别无机离子受体调节剂，见Nemeth等人，PCT/US93/01642，国际公开号WO 94/18959。
本发明所述优选无机离子受体调节剂是化合物8J、8U、9R、11X、12U、12V、12Z、14U、16M和16P。这些化合物所有的EC50值均小于5μM。
该EC50值是激发半最大效应之分子浓度。而IC50是引起半最大阻滞效应之分子浓度。通过检测无机离子受体中无机离子的一种或多种活性，可以测定EC50或IC50。优选此种检测法对具体钙受体是特异性的。例如，测定由具体无机离子受体调节产生或分泌的激素的检测法为优选法。
使用标准技术，例如用荧光显示仪，或者测定注射编码钙受体的核酸后非洲蟾蜍体内Cl-流的提高可以检测出[Ca2+]i增加，见Nemeth等人的PCT/US 93/01642，国际公开号WO 94/18959。例如，多(A)+mRNA可以从表达钙受体的细胞获得，如甲状旁腺细胞、骨破骨细胞、近肾小球肾细胞、近肾小管肾细胞、远侧肾小管肾细胞、亨利氏袢(Henle′s loop)和/或汇总管厚上肢细胞、表皮角化细胞、甲状腺旁滤泡细胞(C-细胞)、肠细胞、中枢神经细胞、末稍神经体系细胞、胎盘滋养层细胞、血小板、血管平滑肌细胞、心房细胞、分泌促胃酸激素细胞、分泌高血糖素细胞、肾小球膜细胞、乳房细胞、β细胞、脂肪细胞、免疫细胞及GI束细胞。优选来自甲状旁腺细胞、C-细胞或破骨细胞的核酸。更优选该核酸编码钙受体并载于质粒或载体上。
优选该分子是钙受体中其EC50或IC50小于或等于5μM的钙模拟剂或解钙剂，更优选小于或等于1μM，100nmolar，10nmolar，或1nmolar。较低的EC50或IC50有利，因为于体内或体外治疗或诊断可使用较低分子浓度。有如此之低EC50和IC50值分子的发现，能设计和合成出有相似能力和效力的其它分子。
优选实施方案中，钙受体调节剂是能抑制体外甲状旁腺激素从甲状旁腺细胞中分泌，并降低体内PTH分泌；刺激体外降钙素从C-细胞分泌，并升高体内降钙素水平；或阻滞体外破骨细胞吸收骨，并抑制体内骨吸收的钙模拟剂。
另一优选实施方案中，钙受体调节剂是能激发体外甲状旁腺细胞分泌甲状旁腺激素，并升高体内甲状旁腺激素水平的解钙剂。
优选在具体细胞中，该药剂可选择性地针对无机离子受体活性，更优选钙受体活性。所谓“选择性地”意指，一定药剂浓度下，该分子对一种细胞类型中比对另一种类型中的无机离子受体活性施加更大影响。优选该效应之差为10倍或更大。优选浓度指血浆浓度，测量效果是血浆降钙素、甲状旁腺激素、或血浆钙等胞外信使产生的。例如，一个优选实施方案中，该药剂选择性地针对PTH分泌，超过针对降钙素分泌。
另一优选实施方案中，该分子在选自下述一种或多种细胞(但不是所有细胞)中的EC50或IC50小于或等于5μM：甲状旁腺细胞、骨破骨细胞、近肾小球肾细胞、近肾小管肾细胞、远侧肾小管肾细胞、亨利氏袢(Henle′s loop)和/或汇总管厚上肢细胞、中枢神经系统细胞、末稍神经系统细胞、表皮角化细胞、甲状腺旁滤泡细胞(C-细胞)、肠细胞、胎盘滋养层细胞、血小板、血管平滑肌细胞、心房细胞、分泌促胃酸激素细胞、分泌高血糖素细胞、肾小球膜细胞、乳房细胞、β细胞、脂肪细胞、免疫细胞和GI束细胞。
优选无机离子受体调节剂在有无机离子受体的细胞中模拟或阻滞胞外离子的所有作用。例如，钙受体调节剂优选在有钙受体的细胞中，模拟或阻滞胞外离子的所有作用。钙模拟剂并不一定具备胞外Ca2+的所有生物活性，但至少可模拟一种该活性。同样，解钙剂并不一定降低或避免由胞外钙引起的所有活性。此外，不同的钙模拟剂和不同的解钙剂不一定结合于钙受体上的同样位点，正如胞外Ca2+施加其影响一样。A.钙模拟剂
使用本领域已知方法和Nemeth等人在PCT/US 93/01642，国际公开号WO 94/18959中所述方法，可以测定钙受体中，分子模拟或阻滞Ca2+活性的能力。例如，当作体外甲状旁腺细胞试验时，钙模拟剂具有一种或多种，且优选所有下述活性：
1.该分子引起很快(达到峰值时间＜5秒)和暂时的[Ca2+]i增加，该增加不感受由1μM La3+或1μM Gd3+的抑制作用。该[Ca2+]i增加在胞外Ca2+不存在时持续，但用ionomycin予处理时(无胞外Ca2+存在)则消失；
2.该分子加强由胞外Ca2+的次最大浓度产生的[Ca2+]i增加；
3.由胞外Ca2+产生的[Ca2+]i增加不受二氢化吡啶抑制；
4.由该分子引起的暂时[Ca2+]i增加，在以10mM氟化钠予处理10分钟后消失；
5.由该分子引起的暂时[Ca2+]i增加，在以蛋白激酶C(PKC)活化剂(例如佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯(PMA)、欧瑞香脂，或(-)-indolactam V)予处理后降低。蛋白激酶C活化剂的总效应是将该分子的浓度-应答曲线向右移动而不影响最大应答。
6.该分子引起肌醇-1，4，5-三磷酸酯和/或二酰基甘油形成快速(＜30秒)增加；
7.该分子抑制多巴胺或异丙基肾上腺素刺激环AMP形成；
8.该分子抑制PTH分泌；
9.用百日咳毒素予处理(100ng/ml持续4小时以上)可阻滞该分子对环AMP形成的抑制效应，但不影响[Ca2+]i、肌醇-1，4，5-三磷酸酯或二酰基甘油的增加，也不降低PTH分泌。
10.该分子引起注射过源自牛或人甲状旁腺细胞的多(A)+富集mRNA的非洲蟾蜍卵母细胞中Cl-流增加，但并不影响注射水或大鼠脑或肝mRNA的非洲蟾蜍卵母细胞的Cl-流；和
11.同样，使用从甲状旁腺细胞克隆的钙受体，该分子将在注射编码受体的特异cDNA或mRNA的非洲蟾蜍卵母细胞中产生应答。
使用现有技术可以测定不同钙活性，见Nemeth等人的PCT/US 93/01642，国际公开号WO 94/18959。很明显从本文实施例和上述Nemeth等人的PCT专利，得出在其它钙应答细胞上(优选于钙受体上)模拟Ca2+活性之分子的相似定义。
优选采用本文所述生物检测法，或Nemeth等人在PCT/US 93/01642，国际公开号WO 94/18959所述方法测定的该调节剂，有下述一种或多种(优选所有)活性：激发暂时性内部钙增加，持续小于30秒(优选通过活动内部钙达到)；激发[Ca2+]i快速增长，于30秒内出现；激发[Ca2+]i持续增加(大于30秒，优选由外部钙流入引起)；激发肌醇-1，4，5-三磷酸酯或二酰基甘油水平升高，优选在小于60秒之内达到；及抑制多巴胺或异丙基肾上腺素刺激的环AMP形成。
该暂时性[Ca2+]i增加，优选用10mM氟化钠予处理细胞10分钟而消失，或用蛋白激酶C活化剂，优选佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯(PMA)、欧瑞香素或(-)-indolactam V短暂予处理(不超过10分钟)细胞而降低。
B.解钙剂
使用标准技术可测定分子阻滞外部钙活性的能力，见Nemeth等人的PCT/US 93/01642，国际公开号WO 94/18959。例如，当以甲状旁腺细胞作体外试验时，以甲状旁腺细胞作为标准，阻滞外部钙作用的分子具有下述一种或多种，优选具所有特征：
1.该分子可部分或完全阻滞胞外钙浓度提高所引起的下述状况的能力：
(a)提高[Ca2+]i，
(b)使胞内Ca2+活动，
(c)增加肌醇-1，4，5-三磷酸酯形成，
(d)降低多巴胺或异丙基肾上腺素刺激的环AMP形成，
(e)抑制PTH分泌；
2.该分子阻滞用多(A)+mRNA(源自牛或人甲状旁腺细胞)注射的非洲蟾蜍卵母细胞中，由胞外Ca2+或钙模拟剂化合物所引起的Cl-流增加，但并不阻滞用水或肝mRNA注射的非洲蟾蜍卵母细胞的Cl-流；
3.同样，若使用来自甲状旁腺细胞的克隆钙受体，该分子也将阻滞注射特异性cDNA、mRNA或cRNA(编码钙受体的)的非洲蟾蜍卵母细胞中，由胞外Ca2+或钙模拟化合物引起的应答。
很明显，从本文实施例和Nemeth等人的PCT/US 93/01642，国际公开号WO 94/18959，得出在钙应答细胞(优选钙受体)上阻滞Ca2+活性之分子的相同定义。III.疾病和失调的治疗
本发明所述化合物的优选使用，是通过调节无机离子受体活性，而治疗或预防各种疾病或失调。本发明的无机离子受体调节剂，可以对无机离子受体施加影响，引起一种或多种细胞效应，最终产生治疗效果。
通过针对具有无机离子受体(例如钙受体)的细胞，本发明可治疗各种疾病和失调。例如以高钙血和循环PTH水平升高为特点的原发性甲状旁腺机能亢进(HPT)。而伴随着HPT主要类型缺损，则出现甲状旁腺细胞对胞外Ca2+负反馈调节作用敏感性降低。这样，患原发性HPT病人的组织中，所谓胞外Ca2+的“设定点”向右移，以致于需要高于正常胞外Ca2+浓度才能抑制PTH分泌。而且，原发性HPT中、即使高浓度胞外Ca2+，通常也只能部分抑制PTH分泌。继发性(尿毒症型)HPT中，虽然Ca2+抑制PTH分泌程度是正常的，仍能观察到胞外Ca2+设定点有相似提高。PTH分泌之变化与[Ca2+]i变化平行：由胞外Ca2+诱导[Ca2+]i提高的设定点也向右移，而此种提高的幅度则降低。
模拟胞外Ca2+作用的分子，对于长期控制原发性和继发性HPT很有用。此种分子提供需要抑制PTH分泌的附加动能，此种抑制单独由高血钙条件是不能达到的，因此，该分子也就帮助缓解了高血钙状况。效力比胞外钙更大的分子，可以克服PTH分泌作用的表观不可抑制成份，该成份是腺癌组织中特别难以对付的。此外，当持续的高血钙表现出抑制牛和人甲状旁腺腺瘤组织中早期前PTH mRNA时，该分子可以抑制PTH合成。持续高血钙也于体外抑制甲状旁腺细胞增殖，这样钙模拟剂在限制继发性HPT的甲状旁腺细胞增生特征上也是有效的。
除甲状旁腺细胞以外的细胞可以直接应答胞外Ca2+浓度的生理变化。例如，甲状腺旁滤泡细胞(C-细胞)分泌降钙素可由胞外Ca2+浓度变化来调节。
孤立的破骨细胞对胞外Ca2+浓度根据[Ca2+]i提高而相应提高产生应答，所述[Ca2+]i提高，部分由胞内Ca2+活动而引起。破骨细胞中[Ca2+]i升高伴随骨吸收抑制作用。从成骨破骨细胞中释放碱性磷酸酶直接由钙刺激。
像PTH分泌一样，肾脏中近肾小球细胞的血管紧张肽原酶分泌作用，也由胞外Ca2+浓度升高而受到抑制。这些细胞中，胞外钙引起胞内Ca2+活动。其它肾细胞对钙的应答如下：Ca2+升高抑制近肾小管细胞形成1，25(OH)2-维生素D，刺激远侧肾小管细胞中钙结合蛋白形成，抑制小管再吸收Ca2+和Mg2+，并抑制抗利尿激素对亨利氏袢(Henle′s loop)厚髓质升肢(MTAL)的作用，减小抗利尿激素在皮质汇总管细胞中的作用，以及影响肾小球中血管的血管平滑肌细钙也促进肠高脚杯状(goblet)细胞，乳房细胞及皮肤细胞的分化；抑制从心房分泌房尿钠排泄肽；减少血小板中cAMP积集；改变促胃酸激素和高血糖素分泌；作用于血管平滑肌细胞而修改因血管作用因素的细胞分泌；并影响中枢神经系统细胞和末稍神经系统细胞。
因此，有充分迹象表明，Ca2+，除了作为胞内信号而无所不起作用外，也有胞外信号功能，调节某些特殊细胞的应答。本发明的分子可用于治疗这些细胞中，Ca2+应答受到破坏而随之出现的疾病和失调。
根据所作用的细胞，可以治疗和预防的特殊疾病和失调，也包括中枢神经系统疾病，例如癫痫发作、中风、头外伤、脊髓损伤、心动停止或新生儿呼吸窘迫之类因缺氧诱导的神经细胞损坏、癫痫病、阿耳茨海默氏(Alzheimer)病、Huntington氏病和帕金森氏(Parkinson)症之类的神经变性症、痴呆、肌肉紧张、抑郁症、焦虑症、惊恐失调症、强迫性失调症、创伤后应急反应失调症、精神分裂症、抑制精神恶性综合症和Tourette氏综合症；也包括肾过剩水再吸收引起的病症，例如不适当ADH分泌综合症(SIAH)、肝硬变、心力衰竭和肾变病；高血压；预防和/或降低来自阳离子抗生素(例如氨基配糖物抗生素)的肾毒；腹泻、结肠强直之类的肠功能性失调症；GI溃疡症；类肉癌症之类的GI吸收病；以及自体免疫病和器官移植排斥。
虽然本发明的无机离子受体调节剂一般用于治疗人类患者，但它们也可以治疗其它温血动物种，例如其它灵长目动物；猪、牛和家禽等农养动物；马、狗和猫等运动动物及宠物等的相似或相同疾病或失调。IV给药
本发明分子可以配成各种给药方式，通过调节无机离子受体活性而治疗患者。化合物药用的工艺和配制一般可从“Remington氏药物科学”(Mack Publishing Co.，Easton，PA.)一书中找到。离子模拟剂和解离子剂的给药，由Nemeth等人在PCT/US 93/01642，国际公开号WO 94/18959中讨论过。
适宜的形式部分取决于使用或进入途径，例如口服、透皮给药、或注射。所述形式应当使得该药剂能到达目标细胞，无论该目标细胞存在于多细胞宿主或存在于培养物中。例如，注射入血液的药理学制剂或组合物应当于所用浓度中能溶解。其它因素是本领域已知的，包括对毒性，和妨碍药剂或组合物发挥其作用之形式的考虑。
药剂也可以配制成药物学上可接受的盐(例如酸加成盐)和其复合物。此种盐类制剂，通过改变该药剂物理特征，而不妨碍发挥其生理学效应，而便于药理学应用。物理性质有用之变化的例子包括降低其熔点，有利于穿透粘膜给药，而提高其溶解性则便于以较高浓度药品给药。
对于全身性给药而言，优选口服给药。此外可以使用注射法，例如肌内注射、静脉注射、腹膜注射、及皮下注射。为注射用，本发明分子应配成液体溶液，优选Hank氏溶液和Ringer氏溶液之类的生理学相容性缓冲液。此外该分子也可制成固体形式，临使用前再溶解或配成悬浮液。也可以生产冻干形式产品。
也可通过透粘膜或透皮手段全身性给药，或该分子可经口服给药。为透粘膜或透皮给药，制剂中可用针对准备透过之障碍的渗透剂。此类渗透剂一般为本领域已知的，例如对透粘膜来说包括胆盐和梭链孢酸衍生物。此外，去垢剂也可用来加强渗透作用。透粘膜给药可以通过鼻喷雾，或用栓剂等。至于口服，该分子可以配制成常规口服给药剂量形式，例如胶囊、片剂和口服液等。
为局部给药用，本发明可以配成软膏、敷药膏、凝胶、或乳霜等，如本领域众所周知的。
一般来说，治疗有效量约为1nmole-3μmole该分子，优选0.1nmole和1μmole，取决于化合物EC50或IC50，患者年龄和体重，以及患者所患具体疾病和失调等因素。一般是对准备治疗动物来说，该量为约0.1-50mg/kg，优选0.01-20mg/kg。V.实施例
本文所述化合物可以使用标准技术，例如Nemeth等人在PCT/US93/01642，国际公开号WO 94/18959中所述方法合成。下面将提供化合物4L、8J、8U、9R、11X、12U、12V、12Z、14U、16M和16P合成的详述实施例。化合物4L、8J、8U、11X和16M，由伯胺与醛或酮在异丙氧基钛(IV)存在下缩合而成。生成中间体亚胺化合物，然后通过氰基氢硼化钠，氢硼化钠、或三乙酰氧基氢硼化钠作用，而原位还原。合成化合物8U的中间体烯胺使用氢氧化钯进行催化还原反应。
将市售醛或酮与伯胺，在氰基氢硼化钠，或三乙酰氧基氢硼化钠存在下进行还原胺化反应而制备化合物9R、14U和16P。合成该三种化合物(9R、14U、16P)发现，使用三乙酰氧基氢硼化钠给出所希望的非对映异构体，比起使用氰基氢硼化钠，具有较大非对映选择性。使用标准相HPLC或从有机溶剂中重结晶，可将富集的混合物进一步提纯成单个非对映体。
用氢化二异丁基铝(DIBAL-H)介导胺与腈缩合制备化合物12U、12V和12Z。经氰基氢硼化钠或氢硼化钠作用，将所得中间体亚胺原位还原。使用碳载钯，于乙醇中。将中间体烯烃(化合物12U和12V)催化加氢还原。用HCl醚液处理游离碱化合物，使其转化为相应的盐酸盐，为白色固体物。
这些合成中所用胺来源是(1)购自Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，WI，(2)购自Celgene Corp.，Warren，NJ，或(3)采用标准技术合成制备。其它化学试剂购自Aldrich Chemical Co.。实施例1：合成化合物4LN-3-苯基-1-丙基-1-(1-萘基)乙胺
将3-苯基-1-丙胺(135mg，1mmol)、1′-萘乙酮(170mg，1mmol)和异丙氧基钛(355mg，1.3mmol)混合物于室温下搅拌1小时。将该反应物用1M氰基氢硼化钠乙醇液(1ml)处理，并于室温下搅拌16小时。用乙醚稀释该反应物并用水(0.1ml)处理。将反应物离心处理，除去醚层，并将其浓缩成乳状油。将该物少部分(10mg)用HPLC(Phenomenex，1.0×25cm，5μM二氧化硅)提纯，使用二氯甲烷→10％甲醇/二氯甲烷(含0.1％异丙胺)梯度液洗脱。经GC/EI-MS分析得到之产物(游离碱)为单一成份：(Rt＝10.48min)，m/z(rel.int.)289(M+，11)、274(63)、184(5)、162(5)、155(100)、141(18)、115(8)、91(45)、77(5)。实施例2：合成化合物8JN-(3-苯丙基)-1-(3-硫代甲苯基)乙胺盐酸盐
将3′-氨基苯乙酮(2.7g，20mmol)溶解于4ml浓盐酸，4g冰和8ml水中。该溶液冷却至0℃，将溶于3.5ml水中的亚硝酸钠(1.45g，21mmol)，持续5分钟时间慢慢加入其中，同时保持温度6℃以下。将硫代甲醇钠(1.75g，25mmol)溶于5ml水并冷却至0℃，持续10分钟将上面形成的重氮盐慢慢加入其中，同时保持温度10℃以下。将反应物再搅拌1小时，同时使其升至室温。该反应混合物于醚和水之间分层。分出醚层，用碳酸氢钠和氯化钠洗涤，并用硫酸钠干燥。蒸出醚，得到74％产率3′-硫代甲基苯乙酮，采用减压蒸馏将粗产物提纯。
将3-苯基丙胺(0.13g，1mmol)，3′-硫代甲基苯乙酮(0.17g，1mmol)和异丙氧基钛(IV)(0.36g，1.25mmol)混合在一起并放置4小时。将乙醇(1ml)和氰基氢硼化钠(0.063g，1mmol)加入其中并搅拌反应过夜。加入4ml乙醚和200μl水处理反应物，将该混合物涡旋处理然后旋转，离心分离出固体物，将醚层从沉淀中分出，真空除去溶剂，所得油状物再溶解于二氯甲烷中，用制备型TLC(硅胶上，以3％甲醇/二氯甲烷洗脱)提纯化合物，得到标题化合物，为纯净油状物：GC/EI-MS(Rt＝7.64min)，m/z(rel.int.)285(M+，18)、270(90)、180(17)、151(100)、136(32)、104(17)、91(54)、77(13)。实施例3：合成化合物8UN-3-(2-甲氧苯基)-1-丙基-(R)-3-甲氧基-α-甲基苄胺盐酸盐
将(R)-(+)-3-甲氧基-α-甲基苄胺(3.02g，20mmol)，2-甲氧基肉桂醛(3.24g，20mmol)和异丙氧基钛(IV)(8.53g，30mmol，1.5Eq.)混合物，于室温下搅拌2小时，并用1M氰基氢硼化钠乙醇液(20ml)处理。该反应物搅拌过夜(16小时)，用乙醚稀释，并用水(1.44ml，80mmol，4Eq.)处理。混合1小时后，离心处理该反应混合物，移出醚层，并浓缩至油状物。将该物溶于冰醋酸中，加入氢氧化钯，振荡下，以60p.s.i氢气，室温下加氢2小时。过滤除去催化剂，所得溶液浓缩至稠油状物。将该物溶于二氯甲烷并用1N NaOH中和。从水相中分离二氯甲烷溶液，用无水碳酸钾干燥，并浓缩至油状物。该物溶于醚中并用1N HCl乙醚液处理。收集所得沉淀(白色固体)，用乙醚洗涤，空气干燥。经GC/EI-MS(Rt＝9.69min)分析，该物(游离碱)为单一成份：m/z(rel.int.)299(M+，21)、284(100)、164(17)、150(8)、135(81)、121(40)、102(17)、91(43)、77(18)。实施例4：合成化合物9R(R)-N-(1-(2-萘基)乙基)-(R)-1-(1-萘基)乙胺盐酸盐
将(R)-(+)-1-(1-萘基)乙胺(10.0g，58mmol)，α′-萘乙酮(9.4g，56mmol)，异丙氧基钛(IV)(20.7g，73.0mmol)和EtOH(无水，100ml)的混合物加热到60℃持续3小时。然后加入氰基氢硼化钠(NaCNBH3，3.67g，58.4mmol)。该反应混合物于室温下搅拌18小时，然后加入乙醚(11)和水(10ml)，离心除去所得沉淀。减压下蒸发该上清液，用热己烷将该粗产物重结晶四次。得到1.5g纯(98＋％)非对映异构体。将该游离碱溶于己烷中，过滤，并将HCl乙醚液加入使沉淀得到白色固体产物(1.1g，6％产率)，m.p.：软化200-240℃(分解)。实施例5：合成化合物11XN-(4-异丙基苄基)-(R)-1-(1-萘基)乙胺盐酸盐
将(R)-(+)-1-(1-萘基)乙胺(1.06g，6.2mmol)，4-异丙基苯甲醛(0.92g，6.2mmol)，和异丙氧基钛(IV)(2.2g，7.7mmol)混合物加热到100℃持续5分钟，然后搅拌使其降至室温维持4小时。加入氰基氢硼化钠(NaCNBH3，0.39g，6.2mmol)，接着加入Et0H(1ml)。该反应混合物于室温下搅拌18小时，加入乙醚(100ml)和H2O(1ml)，然后离心除去所得沉淀。将上清液真空蒸发，粗产物经硅胶(5.0mm×30cm柱)色谱提纯(用1％MeOH/CHCl3洗脱)。然后将经色谱处理之物溶于己烷，加入HCl乙醚液，沉淀出白色固体产物(0.67g，35％产率)，m.p.：257-259℃。实施例6：合成化合物12UN-3-(2-甲苯基)-1-丙基-(R)-3-甲氧基-α-甲基苄胺盐酸盐
将2-甲基肉桂腈(1.43g，10mmol)的二氯甲烷(10ml)溶液冷却至0℃，并滴加(15分钟)1M氢化二异丁基铝(10ml，二氯甲烷液)反应。0℃搅拌反应15分钟，并滴加(15分钟)1M(R)-(+)-3-甲氧基-α-甲基苄胺(1.51g，10mmol)的二氯甲烷(10ml)溶液使之反应。0℃搅拌反应1小时，然后将其倾入含氰基氢硼化钠(1g，16mmol)的乙醇(100ml)溶液中，室温下将该反应混合物搅拌48小时。用乙醚稀释该反应物并用1NNaOH中和。移出醚层，用无水碳酸钾干燥，并浓缩成油状物。将该物以二氧化硅，并用二氯甲烷→5％甲醇/二氯甲烷梯度液洗脱而进行色谱提纯，得到不饱和中间体，经GC/EI-MS(Rt＝10.06分)分析为单一成份：m/z(rel.int.)281(M+，17)、266(59)、176(19)、146(65)、135(73)、131(100)、91(21)、77(13)。
将该不饱和中间体的乙醇液，用碳载钯，于室温下催化加氢(1atm Hz)16小时。经用1M HCl乙醚液处理，该反应产物转化为其盐酸盐。用GC/EI-MS(Rt＝9.31分)分析，该物(游离碱)为单一成份：m/z(rel.int.)283(M+，21)、268(100)、164(12)、148(8)、135(85)、121(12)、105(49)、91(23)、77(21)。实施例7：合成化合物12V N-3-(3-甲苯基)-1-丙基-(R)-3-甲氧基-α-甲基苄胺盐酸盐
所述化合物按实施例6所述程序制备，只是使用3-甲基肉桂腈。经GC/EI-MS(Rt＝10.21分)分析，所述不饱和中间体是单一成份：n/z(rel.int.)281(M+，57)、266(86)、146(98)、135(88)、131(100)、115(43)、102(26)、91(43)、77(18)。再使用例6所述方法使之还原并形成盐酸盐，便得到标题产物。GC/EI-MS(Rt＝9.18分)分析，该物(游离碱)为单一成份：m/z(rel.int.)283(M+，19)、268(100)、164(11)、148(8)、135(76)、121(16)、105(45)、91(23)、77(21)。实施例8：合成化合物12ZN-3-(2-氯苯基)-1-丙基-(R)-1-(1-萘基)乙胺盐酸盐
该标题化合物按实施例6所述方法制备，只是使用2-氯代氢肉桂腈和(R)-(+)-1-(1-萘基)乙胺(按10mmol标准配料)。经二氧化硅，使用二氯甲烷→5％甲醇/二氯甲烷梯度液洗脱，进行色谱提纯，得到经TLC分析(5％甲醇的二氯甲烷液)为单一成份的产物。用1M HCl乙醚液处理，制得其盐酸盐。实施例9：合成化合物14U(R)-N-(1-(4-甲氧基苯基)乙基)-(R)-1-(1-萘基)乙胺盐酸盐
将(R)-(+)-1-(1-萘基)乙胺(1.1g，6.2mmol)，4′-甲氧基苯乙酮(0.93g，6.2mmol)，异丙氧基钛(IV)(2.2g，7.7mmol)，和EtOH(无水，1ml)的混合物加热至60℃持续3小时，然后加入氰基氢硼化钠(NaCNBH3，0.39g，6.2mmol)。室温下，将该反应混合物搅拌18小时，加入乙醚(200ml)和H2O(2ml)，然后离心除去所得沉淀。将上清液真空蒸发，将粗产物用硅胶(25mm×25cm柱)进行色谱提纯(以1％MeOH/CHCl3洗脱)。将该物一部分再进行HPLC处理[Selectosil 5μM硅胶；25cm×10.0mm(Phenomenex，Torrance，CA)，4ml/分钟；UV检测275nM；12％乙酸乙酯-88％己烷洗脱，洗脱时间12.0分钟]。将HPLC提纯的非对映体溶于己烷中，加入HCl乙醚液，沉淀出白色固体产物(20mg)，m.p.：209-210℃(分解)。实施例10：合成化合物16MN-(3-氯-4-甲氧基苄基)-(R)-1-(1-萘基)乙胺盐酸盐
将(R)-(+)-1-(1-萘基)乙胺(6.6g，39mmol)3′-氯-4′-甲氧基苯甲醛(6.6g，39mmol)，和异丙氧基钛(IV)(13.8g，48.8mmol)，和EtOH(无水，30ml)混合物加热至80℃维持30分钟，然后搅拌降至室温维持3小时，加入氰基氢硼化钠(NaCNBH3，2.45g，39mmol)。室温下搅拌反应混合物18小时，加入乙醚(100ml)和H2O(2ml)，离心除去生成的沉淀。真空蒸发上清液，用硅胶(50mm×30cm柱)将粗产物进行色谱提纯(用CH2Cl2洗脱)。然后将经色谱处理之物溶于己烷(500ml)，用Norit过滤(0.2μM)脱色。加入HCl乙醚液，沉淀出白色固体产物(10.2g，56％产率)，m.p.：241-242℃(分解)。实施例11：合成化合物16P4-甲氧基-3-甲基苯乙酮[16P前体]
将4′-羟基-3′-甲基苯乙酮(5.0g，33.3mmol)，碘甲烷(5.7g，40.0mmol)，K2CO3(粒状，无水，23.0g，167mmol)，和丙酮(250ml)混合物回流3小时。将该反应混合物冷却至室温，过滤除去无机盐，真空蒸发。粗产物溶于乙醚(100ml)，用水洗涤(2×20ml)。将有机层干燥(Na2SO4)，并蒸发得到4.5g产物，产率82.4％。该酮无需提纯直接用于下面反应。(R)-N-(1-(4-甲氧基-3-甲苯基)乙基)-(R)-1-(1-萘基)乙胺盐酸盐(化合物16P)
(R)-(+)-1-(1-萘基)乙胺(4.24g，24.8mmol)、4′-甲氧基-3′-甲基苯乙酮(4.06g，24.8mmol)、异丙氧基钛(IV)(8.8g，30.9mmol)和EtOH(无水，1ml)的混合物加热至100℃，维持2小时。加入异丙醇(45ml)并将反应物用冰浴冷却至10℃。然后15分钟内分数次加入三乙酰氧基氢硼化钠(NaHBCO2CCH3)3，10.5g，49.5mmol)，将反应混合物加热至70℃持续18小时。将混合物冷至室温，并倾入乙醚(400ml)中，将该悬浮液离心处理，收集上清液，用乙醚(400ml)洗涤沉淀。将有机洗涤液汇集真空蒸发。将残留物溶于乙醚(400ml)，并用1NNaOH(4×50ml)和H2O(2×50ml)洗涤。干燥有机层(用Na2SO4)、过滤，并真空蒸发，湿残留物中加入EtOH(无水)，然后在旋转蒸发器中彻底蒸干，得到油状物，将该混合物用硅胶(50mm×30cm)柱色谱提纯(用1％MeOH：1％IPA：CHCl3洗脱)，得到4.8g油状物。
用HPLC进一步提纯[SUPELCOSILTMPLC-Si，18μM硅胶；25cm×21.2mm(Supelco，Inc.，Bellefonte，PA)，7ml/分；UV检测275nM；20％EtOAc-80％己烷洗脱，洗脱时间9.5-11.0分]所需非对映异构体。注射入(800μl等分样)混合物(洗脱液中100mg/ml)得到65mg所需异构体。多次HPLC注射得到1.0g提纯物质。将经HPLC提纯之物溶于己烷(50ml)中，用乙醚HCl沉淀出盐酸盐，用熔结玻璃收集该盐，并用己烷洗涤，得到1.0g白色固体物，m.p.：204-205℃。
其它方案包括在下述权利要求中。