一种以叶原基为外植体的金钱松愈伤组织培养方法.pdf

摘要
申请专利号：	CN201210104866.8	申请日：	2012.04.11
公开号：	CN102599064A	公开日：	2012.07.25
当前法律状态：	终止	有效性：	无权
法律详情：	未缴年费专利权终止IPC(主分类):A01H 4/00申请日:20120411授权公告日:20131204终止日期:20160411\|\|\|授权\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):A01H 4/00申请日:20120411\|\|\|公开
IPC分类号：	A01H4/00	主分类号：	A01H4/00
申请人：	成都大学
发明人：	王跃华; 杨小萍; 袁畅; 孙雁霞; 黄兴; 王丹; 王强; 蔡锐; 刘洪明; 李红梅; 王杰; 唐旭
地址：	610106 四川省成都市外东十陵镇
优先权：
专利代理机构：	成都科奥专利事务所(普通合伙) 51101	代理人：	王蔚
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内容摘要

本发明公开了一种以叶原基为外植体的金钱松愈伤组织培养方法，该方法是先将金钱松的芽进行消毒处理，再切取消毒后的芽上的叶原基作为外植体接入愈伤组织诱导培养基MS+6-BA？1.0～2.0mg·L-1+NAA？0.1～1.0mg·L-1+IAA？0.1～0.5mg·L-1+蔗糖20～50g·L-1+琼脂5.0～7.0g·L-1和增殖培养基MS+6-BA？0.5～1.0mg·L-1+NAA？0.1～1.0mg·L-1+蔗糖20～50g·L-1+琼脂5.0～7.0g·L-1或MS+6-BA？0.5～1.0mg·L-1+IAA？0.1～1.0mg·L-1+蔗糖20～50g·L-1+琼脂5.0～7.0g·L-1中进行培养，最终实现了对金钱松植物愈伤组织的有效诱导和快速增殖。本发明有效地解决了当前金钱松药材资源短缺的问题。

权利要求书

1.一种以叶原基为外植体的金钱松愈伤组织培养方法，其特征在于包括如下步骤：(1)材料的选取和消毒：选取落叶后生长健康、无病虫害的金钱松植株上的芽，剥去芽上的芽鳞片后将芽放在超净工作台上，先用浓度为70％的酒精消毒10～50s，再用浓度为0.1％～0.15％的升汞消毒3～25min，最后用无菌水冲洗2～5次后用已灭菌的滤纸吸干水分；(2)愈伤组织的诱导培养：取已消毒的芽，切取芽上的叶原基作为外植体接入愈伤组织诱导培养基MS+6-BA 1.0～2.0mg·L-1+NAA 0.1～1.0mg·L-1+IAA 0.1～0.5mg·L-1+蔗糖20～50g·L-1+琼脂5.0～7.0g·L-1中进行培养，pH值为5.6～6.5，培养温度5～30℃、每天光照0～24小时、光照强度为1000～2000lx；(3)愈伤组织的增殖培养：选取无褐变、颜色为翠绿色、质地较紧密的愈伤组织，将其切成大小为3～8mm3的团块后转接入愈伤组织增殖培养基MS+6-BA 0.5～1.0mg·L-1+NAA 0.1～1.0mg·L-1+蔗糖20～50g·L-1+琼脂5.0～7.0g·L-1或MS+6-BA 0.5～1.0mg·L-1+IAA 0.1～1.0mg·L-1+蔗糖20～50g·L-1+琼脂5.0～7.0g·L-1中进行培养，pH值为5.6～6.5，培养温度5～30℃、每天光照0～24小时、光照强度为1000～2000lx。

说明书

一种以叶原基为外植体的金钱松愈伤组织培养方法

技术领域

本发明涉及一种金钱松植物的组织培养方法，特别是涉及一种以叶原
基为外植体的金钱松愈伤组织培养方法。

背景技术

金钱松是我国特有的古老孑遗松科树种。根据世界保护联盟(IUCN)
新制定的物种受威胁的分类系统标准和中国植物红皮书的标准，金钱松
被定为渐危种，并被列为国家二级保护植物。

金钱松既是重要的园林植物，同时更是一种重要的、应用前景广阔
的药用植物。研究发现，金钱松最主要的药用成分是从其树皮和根皮中
提取出来的二萜类化合物土槿酸，它具有抗肿瘤、抗真菌、抗早孕和使
胆囊自截等功效，尤其是抗肿瘤的功效使得金钱松的药用价值更加凸
显。

现代药理研究发现，土槿酸及其衍生物能作用于多种癌细胞，如胃
癌细胞、宫颈癌细胞、肺癌细胞、乳腺癌细胞、卵巢癌细胞等，并具有
明显的量效关系。土槿酸及其衍生物的抗癌机制是通过破坏肿瘤细胞凋
亡来实现的，在细胞凋亡过程中土槿酸及其衍生物能够诱导肿瘤细胞产
生凋亡小体和细胞凋亡峰，上调凋亡基因的表达，促凋亡蛋白与线粒体
电压依赖性阴离子通道相互作用促进线粒体通透性转变孔开放，线粒体
通透性转变孔高水平开放的直接效应是导致线粒体膜电位下降，最终导
致肿瘤细胞凋亡。

大量开展人工栽种金钱松是解决当前金钱松药材短缺的重要途径。目前
金钱松人工种植主要采用有性繁殖和无性繁殖两种方式。有性繁殖即种
子繁殖，由于金钱松存在结实率低、结实间隔期较长(一般3～5年结实)、
采种条件苛刻(采种母树年龄以100年左右为最好)、种子成活率低(仅
为60％-70％)、以及种子需低温保存等因素的限制，因此目前还不可能通
过有性繁殖大量种植金钱松。无性繁殖即扦插繁殖，金钱松为菌根性树
种，宜在海拔500m左右的山地建立永久性育苗基地或在土内有菌的林间
育苗，植物生长周期长，并易受金钱松小卷蛾的严重危害，这些因素限
制了金钱松的大量无性繁殖。

利用组织培养技术生产药用植物具有生长周期短，繁殖率高、能有效
避免灾害性气候对植物生长的不利影响等优点，可进行周年培养生产。目
前还未见有关利用组织培养技术大规模地生产金钱松有效成分的研究报
道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种以叶原基为外植体的金钱松愈伤组织培养
方法，该方法能实现对愈伤组织的有效诱导和快速增殖，以解决当前金钱松
药材资源短缺的问题。

为达到上述目的，本发明采用的解决方法包括下列步骤：

(1)材料的选取和消毒：选取落叶后生长健康、无病虫害的金钱松植
株上的芽，剥去芽上的芽鳞片后将芽放在超净工作台上，先用浓度为70％
的酒精消毒10～50s，再用浓度为0.1％～0.15％的升汞消毒3～25min，最后用
无菌水冲洗2～5次后用已灭菌的滤纸吸干水分；

(2)愈伤组织的诱导培养：取已消毒的芽，切取芽上的叶原基作为外
植体接入愈伤组织诱导培养基MS+6-BA1.0～2.0mg·L-1+NAA0.1～1.0
mg·L-1+IAA 0.1～0.5mg·L-1+蔗糖20～50g·L-1+琼脂5.0～7.0g·L-1中进行培
养，pH值为5.6～6.5，培养温度5～30℃、每天光照0～24小时、光照强
度为1000～2000lx；

(3)愈伤组织的增殖培养：选取无褐变、颜色为翠绿色、质地较紧密
的愈伤组织，将其切成大小为3～8mm3的团块后转接入愈伤组织增殖培养
基MS+6-BA 0.5～1.0mg·L-1+NAA 0.1～1.0mg·L-1+蔗糖20～50g·L-1+琼脂
5.0～7.0g·L-1或MS+6-BA 0.5～1.0mg·L-1+IAA 0.1～1.0mg·L-1+蔗糖20～50
g·L-1+琼脂5.0～7.0g·L-1中进行培养，pH值为5.6～6.5，培养温度5～30℃、
每天光照0～24小时、光照强度为1000～2000lx。

本发明通过对金钱松愈伤组织的有效诱导和快速增殖，缩短了金钱松
药材的生长周期、降低了生产成本，且能实现大批量生产，从而可有效解
决当前金钱松植物资源和药材资源短缺的问题；并且所生产的金钱松药材
不变性，有效成分含量高。

具体实施方式

实施例1

(1)材料的选取和消毒：选取落叶后生长健康、无病虫害的金钱松植
株上的芽，剥去芽上的芽鳞片后将芽放在超净工作台上，先用浓度为70％
的酒精消毒30s，再用浓度为0.1％的升汞消毒15min，最后用无菌水冲洗4
次后用已灭菌的滤纸吸干水分；

(2)愈伤组织的诱导培养：取已消毒的芽，切取芽上的叶原基作为外
植体接入愈伤组织诱导培养基MS+6-BA 1.0mg·L-1+NAA 0.3
mg·L-1+IAA 0.1mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂6.5g·L-1中进行培养，pH值为6.0，
培养温度25℃、每天光照12小时、光照强度为1500lx，培养40d后愈伤组织
诱导率为98％；

(3)愈伤组织的增殖培养：选取无褐变、颜色为翠绿色、质地较紧密
的愈伤组织，将其切成大小为5mm3的团块后转接入愈伤组织增殖培养基
MS+6-BA 1.0mg·L-1+NAA 0.5mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂6.5g·L-1中进行培
养，pH值为6.0，培养温度25℃、每天光照12小时、光照强度为15001x，
培养40天后愈伤组织增殖4倍。

实施例2

将实施例1步骤(2)中的愈伤组织诱导培养基改为MS+6-BA 2.0
mg·L-1+NAA 0.5mg·L-1+IAA0.3mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂6.5g·L-1，其它步
骤同实施例1，外植体培养40d后愈伤组织诱导率为85％。

实施例3

将实施例1步骤(3)中的愈伤组织增殖培养基改为MS+6-BA 1.0mg·L-1
+IAA 0.5mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂6.5g·L-1，其它步骤同实施例1，培养
40天后愈伤组织增殖1.8倍。

实施例4

将实施例1步骤(3)中愈伤组织的增殖培养温度改为5℃，其它步骤
同实施例1，培养40天后愈伤组织的增殖倍数不足1倍。

实施例5

将实施例1步骤(3)中愈伤组织的增殖培养条件改为每天光照24小
时，其它步骤同实施例1，培养40天后愈伤组织增殖3倍。

实施例6

将实施例1步骤(3)中愈伤组织的增殖培养条件改为每天无光照，其
它步骤同实施例1，培养40天后愈伤组织增殖1.5倍。

比较实施例

将实施例1步骤(2)中诱导愈伤组织的外植体改为芽，其它步骤同实
施例1，芽外植体在培养40d后的愈伤组织诱导率仅为65％，说明外植体的
选择对愈伤组织的诱导率影响较大。

资源描述

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1、(10)申请公布号 CN 102599064 A (43)申请公布日 2012.07.25 C N 1 0 2 5 9 9 0 6 4 A *CN102599064A* (21)申请号 201210104866.8 (22)申请日 2012.04.11 A01H 4/00(2006.01) (71)申请人成都大学地址 610106 四川省成都市外东十陵镇 (72)发明人王跃华杨小萍袁畅孙雁霞黄兴王丹王强蔡锐刘洪明李红梅王杰唐旭 (74)专利代理机构成都科奥专利事务所(普通合伙) 51101 代理人王蔚 (54) 发明名称一种以叶原基为外植体的金钱松愈伤组织培养方法。

2、 (57) 摘要本发明公开了一种以叶原基为外植体的金钱松愈伤组织培养方法，该方法是先将金钱松的芽进行消毒处理，再切取消毒后的芽上的叶原基作为外植体接入愈伤组织诱导培养基MS+6-BA 1.02.0mgL -1 +NAA 0.11.0mgL -1 +IAA 0.10.5mgL -1 +蔗糖2050gL -1 +琼脂 5.07.0gL -1 和增殖培养基MS+6-BA 0.5 1.0mgL -1 +NAA 0.11.0mgL -1 +蔗糖20 50gL -1 +琼脂5.07.0gL -1 或MS+6-BA 0.5 1.0mgL -1 +IAA 0.11.0mgL -1 +蔗糖20 50gL。

3、 -1 +琼脂5.07.0gL -1 中进行培养，最终实现了对金钱松植物愈伤组织的有效诱导和快速增殖。本发明有效地解决了当前金钱松药材资源短缺的问题。 (51)Int.Cl. 权利要求书1页说明书3页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书 1 页说明书 3 页 1/1页 2 1.一种以叶原基为外植体的金钱松愈伤组织培养方法，其特征在于包括如下步骤： (1)材料的选取和消毒：选取落叶后生长健康、无病虫害的金钱松植株上的芽，剥去芽上的芽鳞片后将芽放在超净工作台上，先用浓度为70的酒精消毒1050s，再用浓度为 0.10.15的升汞消毒325min，最后。

4、用无菌水冲洗25次后用已灭菌的滤纸吸干水分； (2)愈伤组织的诱导培养：取已消毒的芽，切取芽上的叶原基作为外植体接入愈伤组织诱导培养基MS+6-BA 1.02.0mgL -1 +NAA 0.11.0mgL -1 +IAA 0.10.5mgL -1 + 蔗糖2050gL -1 +琼脂5.07.0gL -1 中进行培养，pH值为5.66.5，培养温度5 30、每天光照024小时、光照强度为10002000lx； (3)愈伤组织的增殖培养：选取无褐变、颜色为翠绿色、质地较紧密的愈伤组织，将其切成大小为38mm 3 的团块后转接入愈伤组织增殖培养基MS+6-BA 0.51.0mgL -1 +NA。

5、A 0.11.0mgL -1 +蔗糖2050gL -1 +琼脂5.07.0gL -1 或MS+6-BA 0.5 1.0mgL -1 +IAA 0.11.0mgL -1 +蔗糖2050gL -1 +琼脂5.07.0gL -1 中进行培养， pH值为5.66.5，培养温度530、每天光照024小时、光照强度为10002000lx。权利要求书CN 102599064 A 1/3页 3 一种以叶原基为外植体的金钱松愈伤组织培养方法技术领域 0001 本发明涉及一种金钱松植物的组织培养方法，特别是涉及一种以叶原基为外植体的金钱松愈伤组织培养方法。背景技术 0002 金钱松是我国特有的古老。

6、孑遗松科树种。根据世界保护联盟(IUCN)新制定的物种受威胁的分类系统标准和中国植物红皮书的标准，金钱松被定为渐危种，并被列为国家二级保护植物。 0003 金钱松既是重要的园林植物，同时更是一种重要的、应用前景广阔的药用植物。研究发现，金钱松最主要的药用成分是从其树皮和根皮中提取出来的二萜类化合物土槿酸，它具有抗肿瘤、抗真菌、抗早孕和使胆囊自截等功效，尤其是抗肿瘤的功效使得金钱松的药用价值更加凸显。 0004 现代药理研究发现，土槿酸及其衍生物能作用于多种癌细胞，如胃癌细胞、宫颈癌细胞、肺癌细胞、乳腺癌细胞、卵巢癌细胞等，并具有明显的量效关系。土槿酸及其衍生物的抗癌机制是通过破坏。

7、肿瘤细胞凋亡来实现的，在细胞凋亡过程中土槿酸及其衍生物能够诱导肿瘤细胞产生凋亡小体和细胞凋亡峰，上调凋亡基因的表达，促凋亡蛋白与线粒体电压依赖性阴离子通道相互作用促进线粒体通透性转变孔开放，线粒体通透性转变孔高水平开放的直接效应是导致线粒体膜电位下降，最终导致肿瘤细胞凋亡。 0005 大量开展人工栽种金钱松是解决当前金钱松药材短缺的重要途径。目前金钱松人工种植主要采用有性繁殖和无性繁殖两种方式。有性繁殖即种子繁殖，由于金钱松存在结实率低、结实间隔期较长(一般35年结实)、采种条件苛刻(采种母树年龄以100年左右为最好)、种子成活率低(仅为60-70)、以及种子需低温保存等因素的限制。

8、，因此目前还不可能通过有性繁殖大量种植金钱松。无性繁殖即扦插繁殖，金钱松为菌根性树种，宜在海拔500m左右的山地建立永久性育苗基地或在土内有菌的林间育苗，植物生长周期长，并易受金钱松小卷蛾的严重危害，这些因素限制了金钱松的大量无性繁殖。 0006 利用组织培养技术生产药用植物具有生长周期短，繁殖率高、能有效避免灾害性气候对植物生长的不利影响等优点，可进行周年培养生产。目前还未见有关利用组织培养技术大规模地生产金钱松有效成分的研究报道。发明内容 0007 本发明的目的在于提供一种以叶原基为外植体的金钱松愈伤组织培养方法，该方法能实现对愈伤组织的有效诱导和快速增殖，以解决当前金钱松药。

9、材资源短缺的问题。 0008 为达到上述目的，本发明采用的解决方法包括下列步骤： 0009 (1)材料的选取和消毒：选取落叶后生长健康、无病虫害的金钱松植株上的芽，剥去芽上的芽鳞片后将芽放在超净工作台上，先用浓度为70的酒精消毒1050s，再用浓度为0.10.15的升汞消毒325min，最后用无菌水冲洗25次后用已灭菌的滤纸说明书CN 102599064 A 2/3页 4 吸干水分； 0010 (2)愈伤组织的诱导培养：取已消毒的芽，切取芽上的叶原基作为外植体接入愈伤组织诱导培养基MS+6-BA1.02.0mgL -1 +NAA0.11.0mgL -1 +IAA 0.10.5mgL。

10、 -1 + 蔗糖2050gL -1 +琼脂5.07.0gL -1 中进行培养，pH值为5.66.5，培养温度5 30、每天光照024小时、光照强度为10002000lx； 0011 (3)愈伤组织的增殖培养：选取无褐变、颜色为翠绿色、质地较紧密的愈伤组织，将其切成大小为38mm 3 的团块后转接入愈伤组织增殖培养基MS+6-BA 0.5 1.0mgL -1 +NAA 0.11.0mgL -1 +蔗糖2050gL -1 +琼脂5.07.0gL -1 或MS+6-BA 0.51.0mgL -1 +IAA 0.11.0mgL -1 +蔗糖2050gL -1 +琼脂5.07.0gL -1 中进行培。

11、养，pH值为5.66.5，培养温度530、每天光照024小时、光照强度为1000 2000lx。 0012 本发明通过对金钱松愈伤组织的有效诱导和快速增殖，缩短了金钱松药材的生长周期、降低了生产成本，且能实现大批量生产，从而可有效解决当前金钱松植物资源和药材资源短缺的问题；并且所生产的金钱松药材不变性，有效成分含量高。具体实施方式 0013 实施例1 0014 (1)材料的选取和消毒：选取落叶后生长健康、无病虫害的金钱松植株上的芽，剥去芽上的芽鳞片后将芽放在超净工作台上，先用浓度为70的酒精消毒30s，再用浓度为 0.1的升汞消毒15min，最后用无菌水冲洗4次后用已灭菌的滤纸吸干水分。

12、； 0015 (2)愈伤组织的诱导培养：取已消毒的芽，切取芽上的叶原基作为外植体接入愈伤组织诱导培养基MS+6-BA 1.0mgL -1 +NAA 0.3mgL -1 +IAA 0.1mgL -1 +蔗糖30gL -1 +琼脂 6.5gL -1 中进行培养，pH值为6.0，培养温度25、每天光照12小时、光照强度为1500lx，培养40d后愈伤组织诱导率为98； 0016 (3)愈伤组织的增殖培养：选取无褐变、颜色为翠绿色、质地较紧密的愈伤组织，将其切成大小为5mm 3 的团块后转接入愈伤组织增殖培养基MS+6-BA 1.0mgL -1 +NAA 0.5mgL -1 +蔗糖30gL -1。

13、 +琼脂6.5gL -1 中进行培养，pH值为6.0，培养温度25、每天光照12小时、光照强度为15001x，培养40天后愈伤组织增殖4倍。 0017 实施例2 0018 将实施例1步骤(2)中的愈伤组织诱导培养基改为MS+6-BA 2.0mgL -1 +NAA 0.5mgL -1 +IAA0.3mgL -1 +蔗糖30gL -1 +琼脂6.5gL -1 ，其它步骤同实施例1，外植体培养40d后愈伤组织诱导率为85。 0019 实施例3 0020 将实施例1步骤(3)中的愈伤组织增殖培养基改为MS+6-BA 1.0mgL -1 +IAA 0.5mgL -1 +蔗糖30gL -1 +琼脂6.。

14、5gL -1 ，其它步骤同实施例1，培养40天后愈伤组织增殖1.8倍。 0021 实施例4 0022 将实施例1步骤(3)中愈伤组织的增殖培养温度改为5，其它步骤同实施例1，培养40天后愈伤组织的增殖倍数不足1倍。说明书CN 102599064 A 3/3页 5 0023 实施例5 0024 将实施例1步骤(3)中愈伤组织的增殖培养条件改为每天光照24小时，其它步骤同实施例1，培养40天后愈伤组织增殖3倍。 0025 实施例6 0026 将实施例1步骤(3)中愈伤组织的增殖培养条件改为每天无光照，其它步骤同实施例1，培养40天后愈伤组织增殖1.5倍。 0027 比较实施例 0028 将实施例1步骤(2)中诱导愈伤组织的外植体改为芽，其它步骤同实施例1，芽外植体在培养40d后的愈伤组织诱导率仅为65，说明外植体的选择对愈伤组织的诱导率影响较大。说明书CN 102599064 A 。

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