与猪有效乳头对数性状相关的SNP分子标记及应用.pdf

本发明属于家畜分子标记制备技术领域，具体涉及与猪有效乳头对数性状相关的SNP分子标记及应用。该SNP分子标记由全基因组关联分析中得到，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1-2以及图2-3所示。进一步利用所得到的SNP经单倍型分析得到一个如图4所示的相应的单倍型。本发明的标记及单倍型可用于猪有效乳头数分子育种中。

1.  一个与猪有效乳头对数性状相关的SNP分子标记，其特征在于，所述的分子标记的核苷酸序列如下所示：
CAAATGTTAACTGTTACTCTTAGGCTTCTTTGCAATTATTATGAATGCCATGGGAATTGTTTACAATGGAGCCTTCATTTCTAGTCCCTCATGTGTGTGTTTTATTTTCACTTTGAAATTTTAGGAAAGGATAAATAAGARGAAGAATGTGGAAAGTGAATCTGTGCCCAGGAGAGAGAGTCTATAATGTATTTAAAAGCTGTAAAATAGAAGTAAGAGATTCTACAATGAAGGGGGGAGTCAGTAAGTCCTTCTCCAACTCTAATAGCTAAAATATTCTAGGAAGAAGAGCTAAATCCC
上述序列141位的碱基R是C或A，导致多态性。

2.  一个与猪有效乳头对数性状相关的SNP分子标记，其特征在于，所述的分子标记的核苷酸序列如下所示：
ATTGATTTGTTCCACAAACTAGCAAAGATGTATCTTACTCTACTAAGCTTTCTCTGATTCACTTTCATACAATCTCTTTCCCCTCTTTCAATATTAAATGGTAGTTCTACTTTGGGTTATCAGTAAGAGAGGAACAGTTTAGACARAAAGTTTTTAAGGTTAGAAAATATTCCCTCTCCTGTCACTCTCCAAATTGTACCAAAATCTTGTAAAAAGTGACTTGGAAGTTTTGACTAGCAACACAATGAGAAGCAGAAGCTATTGCTCTGGGTCCTGCTTATACTACACATTTCATTCCTT
上述序列146位的碱基R是C或A，导致多态性。

3.  权利要求1或2所述的SNP分子标记构成一个猪基因型的单倍型的标记。

4.  权利要求1或2所述的分子标记单独或组合使用在猪有效乳头对数性状检测中的应用。

5.  与猪有效乳头对数性状相关的SNP分子标记的制备方法，其特征在于下列步骤：
1)提取猪基因组DNA；
2)记录采样群体猪群的有效乳头对数；
3)将猪基因组DNA样品在全基因组芯片上作基因分型；
4)采用R语言下的GenABEL软件包对猪乳头对数的全基因组进行关联分析，从中选取与有效乳头对数性状显著关联的SNP，利用Ensembl网站的Variant Effect Predictor工具，注释该SNP，然后利用生物信息学方法，对目标区域内的基因进行功能注释。

与猪有效乳头对数性状相关的SNP分子标记及应用
技术领域
本发明属于家畜分子标记制备技术领域，具体涉与猪有效乳头对数性状相关的SNP分子标记及应用。
背景技术
众所周知，母猪泌乳力对仔猪的成活和哺乳期生长有重要影响，在营养、健康水平一致的条件下，乳头数多的母猪可以哺乳更多的仔猪，从而产生更大的经济效益，许多种猪场在选留种猪时，将乳头数作为一个重要的指标性状。乳头数作为一个中等遗传力性状，传统选育条件远不能达到我们的选育目的，试图寻找性状相关分子标记来辅助育种成为改良这一性状的一大途径。
乳头数是一种不连续的中等遗传力性状，不同品种的动物的乳头数有较大差异。猪的乳头数大约为8～18个。研究表明，乳头数与一些繁殖性状如窝产仔数、泌乳力和断乳窝重之间有中等程度的表型相关和遗传相关，研究乳头数的遗传规律改良这一性状对母猪繁殖性能和提高生产效率具有重要意义。
目前利用QTL定位以及候选基因法已经确定了许多与乳头数相关的QTL区域及候选基因。但是候选基因法只能检索预先设定候选基因，而不能识别新基因；QTL定位的限制在于QTL区域一般跨度很大，很难做到精细定位。如今，全基因组关联分析(Genome-wide Association Study，GWAS)已成为识别与重要经济性质有关的候选基因或特定地基因组区域的新策略。相对候选基因法和QTL定位，GWAS可以更准确的定位和识别新基因。它在家畜育种中已经得到广泛的应用，如提高奶牛产奶量等。随着猪高密度的SNP(Single nucleotide polymorphism,单核苷酸多态性)芯片的开发，以及猪基因组测序工作的完成(Groenen,Archibald et al.)，GWAS为猪的分子育种开辟了一个新领域。
目前，已经证明与猪乳头数相关的基因有RLN基因、FSHβ基因、ESR基因、LEF1基因等。RLN(relaxin gene,RLN)位于SSC1q28-29区域。松弛素是一种多肽激素，在结构上类似胰岛素，参与毛囊的循环发育，具有维持女性怀孕调节分娩时期，调控男性睾丸发育的功能。另外，在雌激素的作用下，松弛素还可促进乳腺发育。Wimmers等人研究发现，relaxin在乳腺中也有表达，其与翻乳 头的形成有关。基因FSHβ位于SSC2p1.2-1.6区域，其编码的促卵泡激素β亚基(follicle-stimulating hormone beta subunit，FSHβ)能结合促黄体激素，促卵泡激素，从而导致卵子和精子的发生。ESR(estrogen receptor)基因位于SSC1p24-25区域,其编码的雌激素受体是一种配体激活转录因子家族中的一种核酸受体，对雌激素基因在雌性动物组织的表达与调控有重要影响。结合了配体的ESR与特定的DNA序列相互作用可以改变雌激素基因的转录,从而通过对雌性第二性征、繁殖周期、生殖力、妊娠维持的影响。
WWP1(WW domain containing E3ubiquitin protein ligase 1)位于猪4号染色体上，包含1个N端C2结构域、4个串联的WW结构域(用于结合底物)和1个C端用于转移泛素的HECT催化功能域。WWP1作为E3连接酶作用于一些含有PY motif的蛋白(如Smad2，KLF5，P63，ErbB4/HER,RUNX2)和一些不含有PY motif的蛋白(如Smad4，KLF2，ESP15)。有研究报道WWP1调节DAF-2insulin-like信号网络和转化生长因子TGF-beta信号通路，在肿瘤、间充质细胞分化、神经系统疾病，和衰老等生理病理发展中起作用。但是WWP1对乳腺发育的影响尚未有人研究过。本发明利用全基因组关联分析方法将有效乳头数位点定位在该基因上，说明WWP1对乳腺的发生发育及乳头个数有一定影响。前人的研究发现，影响乳头发育的一个重要的信号通路是EGRF家族通路，Nrg3和编码Nrg3受体(ErbB2和ErbB4)的基因(Tbx2和Tbx3)在乳腺相应的位置表达，影响乳腺的数量和位置，而WWP1已被证实会通过RNF11(RING finger protein 11)上调ErbB2和EGFR，并影响乳腺的发育，WWP1可能通过调节EGFR通路影响乳头的数量与发育。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供两个与猪有效乳头对数性状相关的SNP分子标记和这两个SNP构成的单倍型的鉴定与应用。本发明利用全基因组关联分析的方法寻找与猪有效乳头对数性状相关的SNP分子标记，以此作为猪有效乳头对数相关的SNP分子标记在标记辅助选择中的应用。
本发明通过以下技术方案实现：
申请人通过克隆得到一个与猪有效乳头对数性状相关的SNP分子标记，该分子标记的核苷酸序列如下所示：
CAAATGTTAACTGTTACTCTTAGGCTTCTTTGCAATTATTATGAATGCCATGGGAATTGTTTACAATGGAGCCTTCATTTCTAGTCCCTCATGTGTGTGTTTTATTTTCACTTTGAAATTTTAGGAAAGGATAAATAAGAR(C/A)GAAGAATGTGGAAAGTGAATCTGTGCCCAGGAGAGAGAGTCTATAATGTATTTAAA AGCTGTAAAATAGAAGTAAGAGATTCTACAATGAAGGGGGGAGTCAGTAAGTCCTTCTCCAACTCTAATAGCTAAAATATTCTAGGAAGAAGAGCTAAATCCC
上述序列141位的碱基R是C或A，导致多态性。
本发明通过克隆得到另一个与猪有效乳头对数相关的SNP分子标记，该分子标记的核苷酸序列如下所示：
ATTGATTTGTTCCACAAACTAGCAAAGATGTATCTTACTCTACTAAGCTTTCTCTGATTCACTTTCATACAATCTCTTTCCCCTCTTTCAATATTAAATGGTAGTTCTACTTTGGGTTATCAGTAAGAGAGGAACAGTTTAGACAR(C/A)AAAGTTTTTAAGGTTAGAAAATATTCCCTCTCCTGTCACTCTCCAAATTGTACCAAAATCTTGTAAAAAGTGACTTGGAAGTTTTGACTAGCAACACAATGAGAAGCAGAAGCTATTGCTCTGGGTCCTGCTTATACTACACATTTCATTCCTT
上述序列146位的碱基R是C或A，导致多态性。
本发明制备的分子标记可以单独或组合使用在猪乳头数分子育种中的应用。
申请人提供了一种与猪有效乳头对数性状相关的SNP分子标记的制备方法，其步骤如下述：
1)提取猪基因组DNA；
2)记录采样群体猪群的有效乳头对数；
3)将猪基因组DNA样品在全基因组芯片上作基因分型；
4)采用R语言下的GenABEL软件包进行猪乳头数的全基因组关联分析，从中选取与有效乳头对数显著关联的SNP，运用Ensembl网站的Variant Effect Predictor工具，注释该SNP，然后利用生物信息学方法，对目标区域内的基因进行功能注释，通过QTLdb网站检索该位点是否落在报道的与猪有效乳头数性状有关的QTLs中，进一步确定与猪有效乳头对数性状相关联的SNPs。
本发明通过全基因组关联分析(GWAS)的方法得到与猪有效乳头对数性状相关联的SNP分子标记，为猪的分子标记辅助选择提供了两个新的分子标记。
更详细的技术方案参见《具体实施方式》。
附图说明
序列表SEQ ID NO：1是从Ensembl网站下载的与猪有效乳头对数相关基因WWP1第18内含子部分核苷酸序列，经过检测分析得到本发明的第一个分子标记，序列长度为300bp，在该序列的141bp处存在一个等位基因的突变，即由C突变为A。
序列表SEQ ID NO：2是从Ensembl网站下载的与猪有效乳头对数相关基因 WWP1第10内含子部分核苷酸序列。经过检测分析得到本发明的第二个分子标记，序列长度为300bp，在该序列的146bp处存在一个等位基因的突变，即由C突变为A。
图1：是本发明的技术流程图。
图2：本发明克隆的猪WWP1基因第18内含子的部分序列,其中位于猪4号染色体WWP1基因第18个内含子第12150位碱基处(在本克隆的片段中的第141bp处)的即括号内为等位基因的突变位点。
图3：本发明克隆的猪WWP1基因第10内含子的部分序列，其中位于猪4号染色体WWP1基因第10个内含子第285位碱基处(在本克隆的片段中的第146bp处)的即括号内为等位基因的突变位点。
图4：本发明分析得到的由多态性位点rs80833057和rs319476952构成的一个单倍型。
具体实施方式：
实施例1
一、实验群体的构建
本实施例中的研究猪群为杜洛克×二花脸F2资源群体，采用远交系F2代设计，F0代由8头无血缘关系的杜洛克公猪(国外血缘猪品种，为常用品种，华中农业大学试验猪场提供)和18头二花脸母猪(中国地方猪血缘品种，为常用品种，华中农业大学试验猪场提供)组成，F1代13头公猪与38头母猪避免近亲(全同胞或半同胞)交配。所有F2代都是F1代母猪头胎所产，群体系谱记录详细。猪群自由采食、饮水，整个饲喂方式、饲养条件等始终保持一致，为常规方法。
二、实验样品的采集以及数据的整理
收集上述仔猪断尾及耳组织浸泡于75％乙醇中置于-20℃冰箱备用，并记录仔猪有效乳头对数。
三、猪基因组DNA的提取与检测
取0.02克组织，用常规报导的苯酚氯仿抽提法(具体方法参考萨姆布鲁克J分子克隆实验指南[M].2版.金冬雁，黎孟枫译)提取基因组DNA,将基因组DNA溶解于TE缓冲液中。制备1.2％琼脂糖凝胶，吸取2ul DNA原液，与3ul双蒸水混合稀释，加入1ul上样缓冲液(碧云天D0071DNA上样缓冲液6×)。80V温压电泳20min，同时以Marker作为标记对照物，置于凝胶成像系统中观测DNA片段大小和亮度及是否存在降解情况。利用Beckman核酸与蛋白检测仪；将DNA 原液稀释500倍，加入比色皿中，置于检测孔；检测所测DNA样品的值及浓度，并将所得浓度换算为原液浓度。依原液浓度酌量加入TE稀释至50ng/ul，标明记录；将DNA原液于-20℃长期冻藏备用。
四、SNP芯片基因型判定及基因型数据的质控
应用R软件包GenABEL对基因型数据进行质量控制，选择的标准为：①选择个体检出率(individual call rate)大于95％的个体；②选择SNP检出率(SNP call rate)大于95％的个体；③选择次等位基因(minor allele frequency,MAF)大于3％的个体；④剔除哈代温伯格平衡检验小于10-6的个体。
五、数据整理与分析
1)表型数据分析
利用SAS 9.2统计分析软件，对猪有效乳头对数性状进行描述性统计分析，包括计算该性状的平均值、标准差、最大值和最小值。
2)全基因组关联分析
使用R语言下GenABEL软件包中的GRAMMAR-GC算法，即基于混合模型及回归的快速全基因组关联及基因组对照法(Genome-wide Rapid Association using the Mixed Model and Regression-Genomic Control)来进行有效乳头对数的关联分析。得到的关联结果用R环境下的gap软件包绘制每个性状的曼哈顿图。
3)检验SNP与性状关联的显著性
当某个SNP符合P<10-3条件时，我们就认为这个SNP达到了全基因组的基因组水平显著。
4)SNP注释
根据芯片SNP信息，在Ensembl网站(www.ensembl.org)的Sus scrofa Buid 10.2数据库中，运用Variant Effect Predictor工具，注释该SNP，即确定SNP位点所在染色体及其在染色体上的物理位置，并由此确定这些显著SNPs在Ensembl数据库中已知基因的内部还是侧翼区域内。然后利用生物信息学方法，根据Ensembl、NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)、DAVID(david.abcc.ncifcrf.gov)等网站提供的基因结构、基因类型、基因功能和通路等信息，对目标区域内的基因进行功能注释。
5)单倍型分析
选定染色体上包含所有与有效乳头对数相关的显著SNPs的区域，并利用Haploview(Version 4.2)进行连锁不平衡分析和单倍型分析。具体步骤如下：将待分析的SNP相应的map文件和ped文件导入到Haploview软件分析。其中，map文件有两列，一列是SNP的ID号，一列是该SNP在染色体上的位置(参 照NCBI数据库猪10.2版的基因组)；ped文件的前六列是固定的，依次为家系ID、个体ID、父本ID、母本ID、性别(“1”代表公畜；“2”代表母畜)、表型值，其次是基因型。
六、结果分析
对猪WWP1基因第18内含子多态性位点rs80833057(MARC0027031)基因型检测结果表明在261个个体中AA(AA)基因型有60个，AB(AC)基因型有128个，BB(CC)基因型有73个。所分析的性状是有效乳头对数。结果见表1。
表1 WWP1基因第18内含子多态性位点rs80833057基因型与有效乳头对数的关联分析

注：*表示差异显著，P<0.05；**表示差异极显著P<0.01；表中性状值为平均数±标准误。(以下表格中同)
由表1可知：WWP1基因第18内含子的SNP位点rs80833057与有效乳头对数呈极显著相关(p<0.01)。对有效乳头对数有显著影响的WWP1基因第18内含子中SNP位点rs80833057基因型与有效乳头对数关联分析的详细结果见表2。
表2 SNPs位点rs80833057(WWP1)基因型有效乳头对数的最小二乘均数

由表2可知，BB基因型的有效乳头对数显著高于AA基因型(p<0.01)和AB基因型(p<0.01)。因此B等位基因(C等位基因)是有效乳头对数的有用标记。
对猪WWP1基因第10内含子多态性位点rs319476952(DISA0001353)基因型捡测结果表明在261个个体中AA(AA)基因型有30个，AB(AC)基因型有130个，BB(CC)基因型有101个。所分析的性状是猪有效乳头对数。所得到的相关性状是猪有效乳头对数。结果见表3。
表3 WWP1基因第10内含子多态性位点rs319476952基因型与有效乳头对数的关联分析

由表3可知：WWP1基因第10内含子的SNP位点rs319476952与有效乳头对数呈极显著相关(p<0.01)。
对有效乳头对数有显著影响的WWP1基因第10内含子中SNP位点rs319476952基因型的最小二乘均数见表4。
表4 SNPs位点rs319476953(WWP1)基因型有效乳头对数的最小二乘均数

由表4可知，BB基因型的有效乳头对数显著高于AB基因型(p<0.05)和AA基因型(p<0.01),BB基因型的有效乳头对数最多。因此B等位基因(C等位基因)是猪有效乳头对数的有用标记。
由单倍型分析可知，这两个SNP(rs80833057和rs319476952)的连锁不平衡系数(D’)为1，即这两个位点间存在完全连锁不平衡。根据与有效乳头对数性状的关联分析结果可知，单倍型CC是猪有效乳头对数的有用标记。这两个SNP分子标记及其构成的单倍型可以运用到猪的分子标记辅助选择中，进而可提高对猪的重要指标有效乳头对数性状的选择。