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本发明公开了一种乙酰胆碱酯酶的分泌型表达载体,包括启动子、表达标签、结构基因和终止子,在启动子和表达标签之间连接芽孢杆菌B16中性蛋白酶前体信号肽;其构建方法为:1)合成含有芽孢杆菌B16中性蛋白酶前体信号肽和6his标签的基因片段;克隆乙酰胆碱酯酶成熟肽的基因片段;2)通过SOE-PCR方法将所述的两个基因片段连接,得到含有芽孢杆菌B16中性蛋白酶前体信号肽、6his标签和乙酰胆碱酯酶成熟肽基因。