糖基化改造提高脂肪酶表达的方法、突变酶及其应用.pdf

本发明公开了糖基化改造提高脂肪酶表达的方法、突变酶及其应用，属于酶工程领域。本发明是将米根霉脂肪酶的前导肽序列进行N-糖基化突变，将SAS和/或NT氨基酸分别改造为N-糖基化位点NGT和/或NLT，得到的突变体酶proROLA、proROLB、proROLAB的胞外蛋白浓度分别比未进行糖基化的proROL提高了211％、188％、233％，发酵罐培养时酶活分别达到8210U·mL-1、8457U·mL-1和9366U·mL-1，而未突变的proROL的胞外酶活几乎为零。本发明的米根霉脂肪酶具有显著提高的脂肪酶酶活，可以应用于食品、化工及生物能源等领域。

1.  一种脂肪酶突变体，其特征在于，所述突变体是在米根霉脂肪酶的基础上，将其前导肽的SAS和/或NT氨基酸位点突变为N-糖基化位点；所述突变体是以下任意一种：
(1)氨基酸序列是SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的序列；
(2)在严格条件下与(1)限定的氨基酸序列杂交且编码具有脂肪酶活性的蛋白质分子。

2.  根据权利要求1所述的脂肪酶突变体，其特征在于，所述米根霉脂肪酶突变前的氨基酸序列是SEQ ID NO.4所示的序列。

3.  含有权利要求1-2任一所述脂肪酶突变体的表达载体。

4.  根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为分泌型载体。

5.  根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为以下任意一种：pGAPZα，pPIC9，pPIC3K，pPIC9K，PAO815和pPICZα。

6.  含有权利要求1-2任一所述脂肪酶突变体的基因工程菌。

7.  一种权利要求6所述基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述方法是将编码权利要求2所述脂肪酶突变体的核苷酸序列克隆到表达质粒pGAPZα上，然后线性化质粒，并电转入毕赤酵母GS115的感受态细胞中。

8.  一种提高米曲霉脂肪酶表达的方法，其特征在于，所述方法是将米曲霉脂肪酶的前导肽进行N-糖基化突变，突变后脂肪酶的氨基酸序列是SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的序列。

9.  权利要求1所述脂肪酶突变体在食品、化工或生物能源方面的应用。

10.  权利要求6所述基因工程菌在酶制剂生产中的应用。

糖基化改造提高脂肪酶表达的方法、突变酶及其应用
技术领域
本发明涉及糖基化改造提高脂肪酶表达的方法、突变酶及其应用，属于酶工程领域。
背景技术
米根霉脂肪酶具有良好的1,3-位置特异性，优先催化中长链脂肪酸，在食品、化工及生物能源等方面都有很重要的应用。利用酶的水解、合成及转酯等活性，米根霉脂肪酶有不同的应用。
目前，米根霉脂肪酶的全基因序列已经在NCBI上公布。该酶包括26个氨基酸信号序列(presequsece)、97个氨基酸前导肽序列(prosequsence)和269个氨基酸成熟肽序列(mROL)所组成。已有研究表明前导肽对米根霉脂肪酶的分泌和折叠起着十分重要的作用：酶的分泌必需有前序列的20号到37号残基，而经折叠形成活性脂肪酶必需有38号到57号残基。米根霉脂肪酶在大肠杆菌中有很好的表达，但这些脂肪酶只能以无活性的形式表达。
P.pastoris是应用广泛、最高效的外源蛋白表达工具之一，基因的特性、内质网中的蛋白质折叠、蛋白从内质网到高尔基体的转运以及蛋白的翻译等许多因素都能影响P.pastoris表达蛋白的水平。P.pastoris表达蛋白产生N-糖基化是一种常见情况，糖基化能够稳定蛋白质的成熟构象，影响蛋白的活性及热稳定性，以及对蛋白质的正确折叠、运输、定位也起着重要作用。其中N-糖基化在许多蛋白质研究报道中都有着至关重要的作用，对蛋白的分泌等作用是必需的，人们对其研究也相对深入。通常，蛋白质的功能发生改变往往是由于蛋白的结构发生了变化，而蛋白质上增加一个大的糖链能极大的改变蛋白质的结构。
据研究报道N-糖基化对P.pastoris表达蛋白的分泌水平与活性等具有重要影响。Kohno等构建表达Kex2位点突变脂肪酶的P.pastoris基因工程菌，发现前导肽未被处理的RNL的热稳定性更高，且结合到脂肪酶上的糖链长度大小对RNL的热稳定性无影响。Ito等研究卵清蛋白的N-糖基化对蛋白分泌量的影响，证明292位N-糖基化对该蛋白的分泌折叠是必须的。Boivin等研究N-糖基化对P.pastoris表达的溶栓剂DSPAα1分泌水平和活性的影响，结果发现该蛋白的两个位点的N-糖链(N117和N362)对蛋白的分泌和酶活性具有重要作用。此外，根毛霉脂肪酶的N-糖基化研究也证明其对酶的分泌有关键作用，但N-糖基化对其酶活的获得却有消极作用。
本发明通过对米根霉脂肪酶的前导肽进行N-糖基化突变，获得了酶活和表达量提高的脂肪酶突变体。
发明内容
为了克服现有米根霉脂肪酶表达量和酶活较低的缺陷，本发明提供一种基于N-糖基化改造提高脂肪酶表达的方法，以及表达提高的脂肪酶及其应用。
本发明的第一个目的是提供一种表达提高脂肪酶突变体。
所述突变体，是在米根霉脂肪酶的基础上，将其前导肽的SAS和/或NT氨基酸位点突变为N-糖基化位点。
所述突变体，在本发明的一种实施方式中，是将前导肽序列中的SAS氨基酸位点突变成N-糖基化位点NGT，命名为proROLA，突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述突变体，在本发明的一种实施方式中，是将前导肽序列中的NT氨基酸位点突变成N-糖基化位点NLT，命名为proROLB，突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
所述突变体，在本发明的一种实施方式中，是将前导肽序列中的SAS、NT氨基酸位点分别突变成N-糖基化位点NGT、NLT，命名为proROLAB，突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
所述突变体，还可以是在严格条件下(Tm－10～15℃)与SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示氨基酸序列杂交且编码具有脂肪酶活性的蛋白质分子。
所述米根霉脂肪酶，在本发明的一种实施方式中，发生N-糖基化突变前的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，由于不同米根霉菌株来源的脂肪酶氨基酸序列仅有个别氨基酸的差异，因此，该方法不仅适用于SEQ ID NO.4序列，而且对氨基酸序列相似性达到80％以上的脂肪酶序列均适用于本专利。
所述米根霉脂肪酶，在本发明的一种实施方式中，发生N-糖基化突变前的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
本发明的第二个目的是提供含有所述脂肪酶突变体的表达载体。
所述表达载体为分泌型载体。
所述表达载体，在本发明的一种实施方式中，可以是以下任意一种：pGAPZα、pPIC9、pPIC3K、pPIC9K、PAO815或pPICZα。
本发明的第三个目的是提供含有所述脂肪酶突变体的基因工程菌。
所述基因工程菌，在本发明的一种实施方式中，是以毕赤酵母为宿主构建的。
所述基因工程菌，在本发明的一种实施方式中，其构建方法是：将编码所述脂肪酶突变体的核苷酸序列克隆到表达质粒pGAPZα上，然后线性化质粒，并电转入毕赤酵母GS115的感受态细胞中。
本发明的第四个目的是一种提高米曲霉脂肪酶表达的方法，是将米曲霉脂肪酶的前导肽的SAS和/或NT氨基酸位点进行N-糖基化突变。
所述方法，在本发明的一种实施方式中，突变后的脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。
所述方法，在本发明的一种实施方式中，是将突变后的脂肪酶以pGAPZα为载体，在毕赤酵母中进行表达。
本发明还要求保护所述脂肪酶突变体在食品、化工或生物能源等领域的应用，以及所述基因工程菌在酶制剂生产中的应用。
本发明的有益效果：
本发明的经过N-糖基化突变的米曲霉脂肪酶，在工程菌中进步表达时，不仅不会影响菌株的生长，而且具有显著提高的酶活和分泌量。摇瓶培养96h后，proROLA、proROLB、proROLAB的胞外蛋白浓度分别比未进行糖基化的proROL提高了211％、188％、233％；突变体proROLA、proROLB以及proROLAB的摇瓶发酵酶活分别达到150U·mL^-1、175U·mL^-1和200U·mL^-1，30L发酵罐发酵酶活分别达到8210U·mL^-1、8457U·mL^-1和9366U·mL^-1，而未突变的proROL的胞外酶活几乎为零。
附图说明
图1：前导肽突变示意图；
图2：表达突变前后脂肪酶的基因工程菌的生长曲线；
图3：基因工程菌株的蛋白分泌情况；
图4：不同时间下基因工程菌表达脂肪酶的SDS-PAGE；其中，M为蛋白marker，泳道1-5分别代表培养24h、48h、72h、84h和96h；
图5：不同发酵时间下的突变体酶活。
具体实施方式
实施例1：引入N-糖基化的突变酶及基因工程的构建
本发明在米根霉脂肪酶ROL的前导肽中设计3种N-糖基化位点突变体，即将SAS和NT氨基酸分别改造为N-糖基化位点NGT和NLT，突变酶分别命名为proROLA(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)和proROLB(氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)；将SAS和NT两个位点同时改造为N-糖基化位点的突变酶命名为proROLAB(氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示)。前导肽具体突变方式如图1所示。
具体构建方法如下：
(1)以含有SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的米曲霉脂肪酶基因proROL的载体pPIC9K-proROL、pGAPZα为模板，同时用限制性内切酶EcoR I、Not I双酶切，胶回收目的基因proROL和pGAPZα载体片段，用T4DNA连接酶连接目的基因和载体，构建重组质粒 pGAPZα-proROL。
(2)以重组质粒pGAPZα-proROL为模板，设计引物NGT-A F/NGT-A R和NLT-BF/NLT-BR分别进行全质粒PCR，构建分别将ROL基因中SAS、LT氨基酸突变成NGT、NLT的重组质粒，命名为pGAPZα-proROLA和pGAPZα-proROLB。构建完成后，再以质粒pGAPZα-proROLA为模板，用引物NLT-BF/NLT-BR全质粒PCR构建重组质粒pGAPZα-proROLAB。所用引物如表1所示。
表1 引物

(3)将上述构建的重组表达质粒pGAPZα-proROL、pGAPZα-proROLA、pGAPZα-proROLB及pGAPZα-proROLAB分别用限制性内切酶AvrII酶切线性化，胶回收目的片段，电转入酵母感受态GS115细胞，设计引物进行基因组PCR验证阳性菌株，即得到基因工程菌GS115/pGAPZα-proROL、GS115/pGAPZα-proROLA、GS115/pGAPZα-proROLB、GS115/pGAPZα-proROLAB。经测定，proROL、proROLA、proROLB、proROLAB基因在酵母基因组中均为单拷贝。
实施例2：表达突变酶与野生酶的基因工程菌的生长比较
以GS115/pGAPZα-proROL为对照，比较了表达米根霉脂肪酶突变体的基因工程菌的生长情况。
摇瓶发酵条件：将阳性转化子划线YPD-G418平板((w/v)：酵母膏1％，葡萄糖2％，琼脂粉2％，胰蛋白胨2％，G4180.025％)，30℃培养3d，挑单克隆接种至100mLYPD液体培养基((w/v)：酵母膏1％，葡萄糖2％，胰蛋白胨2％)中，30℃200rpm·min^-1摇瓶培养，每隔12h或24h取样。
菌株生长曲线如图2所示。结果表明，各突变菌株与对照生长情况相似，48h以内菌株生长迅速，72h后各菌株生长变得缓慢，趋于平稳。说明在米根霉脂肪酶基因中引入糖基化位点后不会影响各菌株的生长。
实施例3：N-糖基化对米根霉脂肪酶分泌水平的影响
本发明比较了表达突变酶和野生酶的基因工程菌的脂肪酶分泌情况。
将各基因工程菌进行发酵培养，具体培养条件：将阳性转化子划线YPD-G418平板，30℃培养3d，挑单克隆接种至100mLYPD液体培养基中，30℃200rpm·min^-1摇瓶培养，每隔12h或24h取样。
结果如图3所示，未引入糖基化位点的米根霉脂肪酶proROL的蛋白浓度最低，而引入两个糖基化位点的米根霉脂肪酶proROLAB的胞外蛋白浓度略高于只引入一个糖基化位点的脂肪酶proROLA和proROLB，初步判断引入的糖基化位点发生了糖基化，且影响了米根霉脂肪酶的分泌水平。结果显示，发酵培养96h后，proROLA、proROLB、proROLAB的胞外蛋白浓度分别比未进行糖基化的proROL提高了211％、188％、233％。
如图4为不同取样时间的SDS-PAGE图。由于分泌的米根霉脂肪酶前导肽被部分切割(图1中KR位点为切除信号肽的特异性酶切位点)，保留28个前导肽氨基酸，引入糖基化位点的前导肽片段也被切除了，因此分泌表达的米根霉脂肪酶分子量均一致。未引入糖基化位点脂肪酶proROL从24h-96h都几乎未分泌，其余引入糖基化位点脂肪酶的分泌量都随着时间延长而增加，84h达到最大，且突变酶proROLA和proROLAB的分泌量在相同时间段都略高于脂肪酶proROLB。
实施例4：摇瓶条件下N-糖基化对米根霉脂肪酶胞外酶活的影响
将构建的基因工程菌进行摇瓶发酵培养产酶，同时测定不同发酵时间的脂肪酶酶活。
具体条件：将阳性转化子划线YPD-G418平板，30℃培养3d，挑单克隆接种至100mL YPD液体培养基中，30℃200rpm·min^-1摇瓶培养，每隔12h或24h取样。
酶活力的定义为：每分钟在标准反应条件下产生1μmol pNP所用的酶量为一个脂肪酶水解酶活国际单位。酶活力的测定方法用pNPP法。
结果如图5所示。发酵过程中proROL的胞外酶活几乎为零，而其他三种引入N-糖基化位点的脂肪酶突变体的胞外酶活随着发酵时间的延长酶活不断增加，84h酶活达到最大值。突变体proROLA、proROLB以及proROLAB的酶活最高值分别达到150U·mL^-1、175U·mL^-1和200U·mL^-1。
实施例5：发酵罐条件下N-糖基化对米根霉脂肪酶胞外酶活的影响
将构建的基因工程菌进行30L发酵罐发酵培养产酶，同时测定84h发酵时间的脂肪酶酶活。
具体条件：将阳性转化子划线YPD-G418平板，30℃培养3d，挑单克隆接种至200mL YPD液体培养基中，OD值达到2-6时，接种于30L发酵罐中进行发酵培养，发酵过程中流加葡萄糖溶液，控制浓度为2％左右，流加氨水控制pH5.5，温度28℃，发酵84h之后测定脂肪酶酶活力。
酶活力的定义为：每分钟在标准反应条件下产生1μmol pNP所用的酶量为一个脂肪酶水 解酶活国际单位。酶活力的测定方法用pNPP法。
发酵结果显示，proROL的胞外酶活几乎为零，而其他三种引入N-糖基化位点的脂肪酶突变体proROLA、proROLB以及proROLAB的胞外酶活在84h酶活分别达到8210U·mL^-1、8457U·mL^-1和9366U·mL^-1。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。