过量新血管化的治疗.pdf

本发明涉及通过给予该细胞和/或其后代细胞来治疗或者预防与血管新生相关的疾病的方法。

1.  一种治疗和预防受试者中与血管发生相关的疾病的方法，所述方法包括将干细胞或者其后代细胞给予所述受体。

2.  根据权利要求1所述的方法，其中所述与血管发生相关的疾病选自由血管发生依赖性癌症、良性瘤、风湿性关节炎、牛皮癣、眼部血管发生疾病、Osler-Webber综合征、心肌血管发生、斑块内新血管化、毛细血管扩张、血友病性关节病、血管纤维瘤、伤口肉芽、肠粘连、动脉硬化症、硬皮病、肥厚性瘢痕、猫爪抓伤症和幽门螺杆菌溃疡组成的组。

3.  根据权利要求2所述的方法，其中所述与血管发生相关的疾病是眼部血管发生疾病。

4.  根据权利要求3所述的方法，其中所述眼部血管发生疾病选自由糖尿病视网膜病变、早产儿视网膜病变、黄斑变性、角膜移植排斥、新生血管性青光眼、晶状体后纤维组织增生症和虹膜红变组成的组。

5.  根据权利要求4所述的方法，其中所述眼部血管发生疾病是黄斑变性或者糖尿病视网膜病变。

6.  根据权利要求5所述的方法，其中所述黄斑变性是干性老年黄斑退化症或者湿性老年黄斑退化症。

7.  根据权利要求1到6中任一项所述的方法，其中所述干细胞从骨髓获得。

8.  根据权利要求1到7中任一项所述的方法，其中所述干细胞是间质前体细胞(MPC)。

9.  根据权利要求8所述的方法，其中所述间质前体细胞是TNAP⁺、STRO-1⁺、VCAM-1⁺、THY-1⁺、STRO-2⁺、CD45⁺、CD146⁺、3G5⁺或者它们的任意组合。

10.  根据权利要求9所述的方法，其中至少一些所述STRO-1⁺细胞是STRO-1^bri。

11.  根据权利要求1到10中任一项所述的方法，其中所述后代细胞是通过体外培养间质前体细胞获得的。

12.  根据权利要求1到11中任一项所述的方法，其中至少一些所述细胞是遗传修饰的。

13.  根据权利要求1到12中任一个所述的方法，其中所述与血管发生相关的疾病是血管发生依赖性癌症或者良性瘤，并且所述细胞被用来制造抗癌药物。

14.  干细胞或其后代细胞在生产用于治疗或者预防受试者中与血管发生相关的疾病的药物中的应用。

过量新血管化的治疗
技术领域
本发明涉及通过给药干细胞和/或其后代治疗或者预防与血管发生相关的疾病的方法。
背景技术
血管发生
血管血管新生(或者新血管化)是新的血管的形成和分化。一般，血管发生在健康的成人或者成熟的组织中是不存在的。但是，它出现在健康的机体中用于治疗伤口和在受伤或者损害之后将血流回复到组织中。在女性中，血管发生还出现在月经周期和怀孕的过程中。在这些过程中，新血管的形成是非常有条理的。
血管发生和疾病
在许多严重的疾病情况中，机体丧失对血管发生的控制。血管发生过量出现在如癌症、黄斑变性、糖尿病视网膜病变、关节炎和牛皮癣的疾病中。在这些情况中，新的血管提供病变组织营养，破坏正常组织，在癌症的情况中，新血管可以使肿瘤细胞进入循环并且在其它器官定殖(肿瘤转移)。
关于肿瘤生长是依赖于血管发生的假设首先在1971年被提出(Folkman、1971)。简单说来，该假设提出肿瘤体积扩张超过一定的程度必需新微血管的诱导作用。例如，小鼠中在血管前期的肺肿瘤微小转移是无法察觉的，除非通过组织切片的高倍显微镜。更多的支持肿瘤生长是依赖于血管发生的观念的间接证据可以在美国专利第5,639,725、5,629,327、5,792,845、5,733,876、和5,854,205号中找到。
为了刺激血管发生，肿瘤上调其多种血管生成因子的产生，包括成纤维细胞生长因子(αFGF和βFGF)(Kandel等，1991)和血管内皮细胞生长因子/血管通透性因子(VEGF/VPF和HGF。但是，许多恶性肿瘤也产生血管发生的抑制剂，包括血管抑素蛋白和凝血栓蛋白(Good等，1990；O′Reilly等，1994)。假定血管发生表型是新血管化的正向调节物和反向调节物之间的净平衡的结果(Good等，1990；O′Reilly等，1994)。已经确定了另外几种血管发生的内生抑制剂，尽管不是所有的都与肿瘤的存在相关。其包括血小板因子4(Gupta等，1995；Maione等，1990)、干扰素-α、干扰素诱导蛋白(Angiolillo等1995；Strieter等1995)，其被白介素-12和/或干扰素γ(Voest等，1995)、生长相关因子-β(Cao等，1995)和催乳素的16Kda N-末端片断(Clapp等，1993)诱导。
眼中的新血管化是严重的眼部疾病的基础，如老年黄斑退化症(AMD)和糖尿病视网膜病变。AMD是美国、加拿大、英格兰、威尔士、苏格兰和澳大利亚的年龄在65岁和65岁以上的患者的法定不可逆失明的最普遍的原因。尽管患者丧失他们的第一只眼睛的中心视觉的平均年龄是大约65岁，一些患者在他们四十或者五十岁的阶段中显示出该疾病的迹象。大约10％到15％的患者表现为该疾病的渗出性(湿性)形式。渗出性AMD的特点是血管发生和病理性新生血管的形成。该疾病是双向的，每年积累大约10％到15％在另外一只眼睛形成视觉障碍的风险。
糖尿病视网膜病变是糖尿病的并发症，其在大约40％到45％的诊断患有I型或者II型糖尿病的人中出现。糖尿病视网膜病变通常作用于两只眼睛，并且发展为四个阶段。第一阶段，轻度非增殖型视网膜病变，其特征是眼中的微血管瘤。出现视网膜中的毛细血管和小血管中的小面积水肿。在第二个阶段，中度非增殖型视网膜病变，提供视网膜的血管变得阻塞。在严重的非增殖型视网膜病变中，第三阶段，阻塞的血管导致提供给视网膜的血液的减少，并且视网膜发信号给眼睛从而新的血管(血管发生)提供给视网膜血液供给。在第四个和最高级的阶段，增殖型视网膜病变，产生血管发生，但是新的血管是不正常和脆弱的，并且沿着视网膜的表面和填充眼睛的玻璃体生长。当这些细弱的血管破裂或者漏血，产生了严重的视觉丧失和失明。
血管发生抑制剂
特异性地抑制内皮细胞增殖的血管发生抑制剂的实施例是血管抑素蛋白(O′Reilly等，1994)。血管抑素蛋白是大约38kDa的内皮细胞增殖的特异性抑制剂。血管抑素蛋白是含有3个或者5个血浆纤溶酶原的环状结构区(kringle)结构的血浆纤溶酶原的内部片断。已经显示血管抑素蛋白降低肿瘤重量和抑制某些肿瘤模式中的转移(O′Reilly等，1994)。另外一种血管发生抑制剂是内皮抑素蛋白，其是胶原蛋白或者XVIII的羧基片断(O′Reilly等，1997)。
具有发现和发展其它的可以单独使用或者和已知的血管生成药物联合使用的抗血管生成的药物的需要，从而治疗与血管发生相关的疾病。
发明内容
本发明令人惊奇地发现干细胞和其后代细胞可用于治疗和防止与血管发生相关的疾病。
在一个方面，本发明提供了治疗和防止受体中与血管发生相关的疾病的方法，该方法包含将干细胞或者其后代细胞给药于受体。
在一个优选的实施方案中，干细胞从骨髓获得。
优选，干细胞是间质前体细胞(MPC)。优选，该间质前体细胞是TNAP⁺、STRO-1⁺、VCAM-1⁺、THY-1⁺、STRO-2⁺、CD45⁺、CD146⁺、3G5⁺或者其任意组合。在另外一个实施方案中，至少一些STRO-1⁺细胞是STRO-1^bri。
在另外一个实施方案中，间质前体细胞还没有扩培并且是TNAP⁺。
在一个优选实施方案中，通过体外培养间质前体细胞获得后代细胞。
在另外一个实施方案中，至少一些细胞是遗传改性的。
在另外一个实施方案中，与血管发生相关的疾病是血管新生依赖性癌症或者良性肿瘤，并且该细胞用于产生抗癌药物。
还提供了干细胞和其后代细胞用于生产治疗或者防止受体的与血管发生相关的疾病的药物中的用途。
显而易见，本发明的一个方面的优选特性或者特征适用于本发明的许多其它方面。
贯穿本说明，词语“包括”应该被理解为表示包括声明了的部分、整体或者步骤，或者部分、多个整体或多个步骤的组，但是不排除任何其它的部分、整体或者步骤，或者部分、整体或步骤的组。
附图说明
图1.激光凝固了的眼部的CFP和FA
每个时间点的眼部的代表性照片显示了在7天(1b)、14天(1c)和28天(1d)的激光损伤(1a箭头)和相关的荧光素渗漏(由箭头表示)。
图2.每个时间点的激光损伤的平均严重程度评价值
使用密度计量学方法计算了CNV的程度，并且进行统计分析。14天的平均严重程度评价值显著高于激光治疗后7天(星号)(p＜0.01)。但是，虽然在14和28天之间，平均严重程度评价值升高，但是差异不是显著性的(p＞0.05)。这个结果是使用这种模型的其他品种的大鼠的特点。
图3.每个损伤程度评价值的频率值
在使用激光凝固模型的其他啮齿品种中发现每个损伤程度评价值的频率分布对于对照值是代表性的。其特点在于早期的0到轻度的渗漏和激光治疗之后14到28天之间的剧烈增加。0＝没有渗漏；1＝轻度；2＝中度；和3＝强渗漏。
图4.视网膜组织的H&E染色组织切片
正常的视网膜切片(a)显示所有的层完整(GC，神经节细胞；IPL，内网织层；INL，内核层；OPL，外网织层；ONL，外核层；RPE，视网膜色素上皮和CB，脉络床)。将激光治疗后7天的眼睛20倍放大(b)，可以看到布鲁赫膜(玻璃膜，Bruch’s membrane)的破裂(横条)。随后40倍的放大(c)显示在表现出血管渗漏的视网膜层中的红血细胞的存在(箭头)。但是，到28天在20倍(d)和40倍(e)的放大下，血细胞的存在更加明显。
图5.激光损伤的荧光显微观察
RPE呈现黄色，并且经过损伤位点可以看见该层的碎片。通过使用CD68抗体的免疫组织化学证明了没有明显的巨噬细胞。
图6.治疗了的眼睛的CFP和FA
使用对照-没有经过激光治疗的眼睛(a和b)作为比较。在7天(c和d)、14天(e和f)和28天(g和h)对于损伤的出现(箭头)使用CFP(c、e和g)和FA(d、f和h)来评价眼睛。
图7.平均渗漏程度评价值
计算出7天的对照组和研究组之间在程度上不存在显著的差异。与7天相比，由于CNV发展的荧光素的渗漏在14天或者28天没有显著上升，其显著低于对比时间点的对照组的程度评价值。
图8.每个损伤程度评价值的频率值
发现在使用激光凝固模型的其它啮齿品种中对于对照值每个损伤程度的频率分布是典型性的。其特点在于早期的0到轻度的渗漏和激光治疗之后14到28天之间的剧烈增加。0＝无渗漏；1＝轻度；2＝中度；和3＝强渗漏。
图9.眼睛的组织切片
显示出眼内炎迹象的眼睛中存在大量的巨噬细胞(箭头，10倍a，20倍b)。在未感染的眼睛中，视网膜表现正常，在损伤位点中没有血管的形成(c)。
图10.具有荧光素渗漏的激光凝固的百分率比较
该图显示了注射了Profreeze和注射了细胞的眼睛中在注射后不同时间点的具有荧光素渗漏的激光凝固的百分率。
图11.眼睛的H&E染色石蜡切片的光学显微观察
注射了Profreeze(A)和HMPCs(B)的眼睛的H&E染色石蜡切片的光学显微观察。箭头标记了脉络膜新生血管膜的厚度。
图12.脉络膜新生血管膜的厚度比较
该图显示了注射了细胞和注射了Profreeze的眼睛中的10个脉络膜新生血管膜的平均厚度。
具体实施方式
普通技术
除非另外特别地说明，这里所使用的所有技术和科学术语应该与所属领域(干细胞生物学、细胞培养、细胞遗传学、免疫学、免疫组织化学、蛋白质化学和生物化学)的一般技术人员通常理解的含义相同。
除非另有所指，本发明中使用的重组蛋白、细胞培养和免疫技术是本领域的一般技术人员熟知的常规程序。通过原始资料中的文献介绍和解释了这样的技术，如J.Perbal，A Practical Guide toMolecular Cloning，John Wiley和Sons(1984)，J.Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratoiy Manual，Cold Spring HarbourLaboratory Press(1989)，T.A.Brown(编辑)，Essential MolecularBiology：A Practical Approach，卷1and 2，IRL Press(1991)，D.M.Glover和B.D.Hames(editors)，DNA Cloning：A Practical Approach，卷1-4，IRL Press(1995和1996)，和F.M.Ausubel等(编辑)，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Pub.Associates和Wiley-Interscience(1988，包括了目前所有的补充材料)，Ed Harlow和David Lane(编辑)Antibodies：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbour Laboratory，(1988)，和J.E.Coligan等(编辑)CurrentProtocols in Immunology，John Wiley&Sons(包括了目前所有的补充材料)，并且通过引用结合于此作为参考。
与血管发生相关的疾病以及该疾病的治疗和预防
正如这里所使用的，术语“血管发生”被定义为组织血管化的过程，其包括新的和/或发育中的血管生长成为组织，其还被称为新血管化。该过程可以下述三种方式中的一个来进行：血管可以从已存在的血管长出，血管的重新发育可以开始于前体细胞(血管生成)，和/或现有的小血管可以在直径上增大。
正如这里所使用的，“与血管发生相关的疾病”是以过量和/或不正常的新血管化为特征的任何情况。
使用本发明的方法可以治疗或者预防任何与血管发生相关的疾病。与血管发生相关的疾病包括，但是不限制于，血管发生依赖性癌症，包括如实体瘤、如白血病的血液产生的肿瘤，以及转移瘤；良性肿瘤，例如血管瘤、听神经瘤、纤维神经瘤、颗粒性结膜炎和化脓性肉芽肿；风湿性关节炎；牛皮癣；眼部新生血管疾病，例如糖尿病视网膜病变、早产儿视网膜病变、包括干性老年黄斑退化症和湿性老年黄斑退化症的黄斑变性、角膜移植排斥、新生血管性青光眼、晶状体后纤维膜增生症、虹膜红变；Osier-Webber综合征；心肌血管新生性失明；斑块内新血管化；毛细管扩张；血友病性关节病；血管纤维瘤；和伤口肉芽。本发明的方法还可用于治疗或者预防具有病理性结果的血管发生的疾病如猫爪抓伤症(Rocheleminalia quintosá)和溃疡(幽门螺杆菌，Helicobacter pylorii)。
正如这里所使用的，“眼部血管新生疾病”是以过量和/或不正常的新血管化为特征的眼部的任何情况。
本发明的方法可以与其它治疗或者预防与血管发生相关的疾病的方法结合。这些其它治疗方法的种类取决于特定的血管新生疾病。例如，本发明的方法来治疗或者预防黄斑变性可以结合抗氧化剂和/或者锌的补充、给药哌加他尼钠(Pegaptanib)、使用美国专利第6,942,655号确定的方法和/或激光治疗。至于癌症，本发明的方法的治疗可以结合外科手术、放射治疗和/或化学治疗。
正如这里所使用的，术语“受体”(这里也被称为“患者”)包括温血动物，优选哺乳动物，包括人类。在一个优选的实施方案中，受体是灵长类动物。在一个更加优选的实施方案中，受体是人类。
正如这里所使用的，术语“治疗”包括对这里所限定的细胞进行治疗有效量的给药，以足够减少或者消除与血管发生相关的疾病的至少一个症状。
正如这里所使用的，术语“预防”包括对这里所限定的细胞进行治疗有效量的给药，以足够停止或者阻碍与血管发生相关的疾病的至少一个症状的增长。
干细胞和其后代
正如这里所使用的，术语“干细胞”表示自我更新的细胞，它们能够产生表型和基因型一致的后代以及至少一种其它终细胞类型(举例来说，末端分化细胞)。术语“干细胞”包括全能性的、多能性的和多效性的细胞，以及来自它们分化的祖细胞和/或前体细胞。
正如这里所使用的，术语“全能细胞”或“全能性的细胞”表示能够形成完整的胚胎(举例来说，胚泡)的细胞。
正如这里所使用的，术语“多能细胞”或“多能性的细胞”表示具有完整的分化多功能性的细胞，也就是成长为哺乳动物体的大约260种细胞类型的任意一种的能力。多能细胞可以是自我更新的，也可以在组织中保持休眠或者静止的。
“多效性的细胞”或“多效细胞”，我们指的是能够产生几种成熟细胞类型中的任意一种的细胞。正如这里所使用的，该短语包含成人干细胞或者胚胎干细胞和祖细胞，如，间质前体细胞(MPC)和这些细胞的多效后代。不像多能细胞，多效细胞不具有形成所有细胞类型的能力。
正如这里所使用的，“祖细胞”表示专属于分化成为特异型细胞或者形成特异类型组织的细胞。
间质前体细胞(MPC)是在骨髓、血液、牙髓细胞、脂肪组织、皮肤、脾、胰腺、脑、肾、肝脏、心脏、视网膜、脑、毛囊、肠、肺、淋巴腺、胸腺、骨、韧带、腱、骨骼肌、真皮和骨膜中发现的细胞；并且它们可以分化成为不同的种系，如中胚层、内皮层和外胚层。因此，MPC能够分化成为多种细胞类型，包括但是不限制于脂肪性的、骨的、软骨的、弹性的、肌肉和纤维结缔组织。特异性的谱系定型和这些细胞进入的分化途径取决于各种影响，这些影响来自机械影响和/或内生生物活性因子，如生长因子、细胞因子，和/或宿主组织建立的局部小环境条件。因此，间质前体细胞是非造血祖细胞，其分裂产生子细胞，该子细胞为干细胞或者及时地不可逆地分化产生表型细胞的前体细胞。
在一个优选实施方案中，本发明的方法中使用的细胞是从受体获得的样品的富集。这里所使用的术语“富集”、“富集的”或它们的变异表示了一个种群的细胞，其中与未治疗的种群相比，一种特殊细胞类型的比例或者多种特殊细胞类型的比例提高了。
在一个优选的实施方案中，本发明中使用的细胞是TNAP⁺、STRO-1⁺、VCAM-1⁺、THY-1⁺、STRO-2⁺、CD45⁺、CD146⁺、3G5⁺或者它们的组合。优选，STRO-1⁺细胞是STRO-1^bright。优选，STRO-1^bright细胞附加的是VCAM-1⁺、THY-1⁺、STRO-2⁺和/或CD146⁺中的一种或者多种。
在一个实施方案中，间质前体细胞是如WO 2004/85630所确定的血管周的间质前体细胞。
当我们指的细胞对于给定的标记物为“阳性”时，它可以为该标记物的低(低的或者暗的)或者高的(亮的，bri)的表达物，取决于该标记物在该细胞表面存在的程度，其中该术语涉及荧光强度或者细胞的颜色分类方法中使用的其它颜色的强度。在使用被分类的特定细胞种群上的标记物的条件下，可以理解低(或者暗的或者迟钝的)和高之间的差别。当我们在这里指的细胞对于给定的标记物为“阴性”时，它不表示该标记物在细胞中完全不表达。它表示该标记物被这个细胞表达的水平相对非常低，并且当被可探测地标记时它产生非常低的信号。
当在这里使用术语“亮的”时，它表示细胞表面上的标记物在被可探测地标记时产生相对高的信号。有时不希望被理论所限制，提出“亮的”细胞比样品中的其它细胞表达更多的靶标记蛋白(例如由STRO-1识别的抗原)。例如，当FACS分析确定的抗体由FITC-共轭STRO-1标记时，STRO-1^bri细胞比不亮的细胞(STRO-1^dull/dim)产生更强的荧光信号。优选，“亮的”细胞构成初始样品中含有的最亮的标记的骨髓单核细胞的至少约0.1％。在另外一个实施方案中，“亮的”细胞构成初始样品中含有的最亮的标记的骨髓单核细胞的至少约0.1％，至少约0.5％，至少约1％，至少约1.5％，或者至少约2％。在一个优选的实施方案中，STRO-1^bright细胞具有STRO-1表面表达的2log量值的更高的表达。这是相对于“背景”，也就是STRO-1^-细胞，进行计算的。通过比较，STRO-1^dim和/或STRO-1^intermediate细胞具有少于2log量值的STRO-1表面表达的更高的表达，通常为约1log或者少于“背景”。
当在这里使用时，术语“TNAP”包括组织非特异性碱性磷酸酶的所有亚型。例如，该术语包含肝脏亚型(LAP)、骨亚型(BAP)和肾亚型(KAP)。在一个优选的实施方案中，TNAP是BAP。在一个特别优选的实施方案中，这里使用的TNAP表示可以结合STRO-3抗体的分子，该抗体是由ATCC在布达佩斯条约规定之下于2005年12月9日保藏的保藏收录号PTA-7282的杂种细胞系产生的。
另外，在一个优选的实施方案中，该细胞能够产生形成无性系的CFU-F。
优选很大比例的多效细胞能够分化成至少两种不同的种系。谱系的非限定性实施例，多效细胞可以定型为该谱系，包括骨前体细胞；肝细胞祖细胞，其对于胆管上皮细胞和肝细胞是多效的；神经限制性细胞，其可以产生发育成少突细胞和星细胞的神经胶质细胞前体；发育成神经细胞的神经细胞前体；心肌和心肌细胞的前体，分泌胰腺β细胞系的葡萄糖感应胰岛素。其它的谱系包括，但是不限制于，成牙质细胞、成牙本质细胞和软骨细胞，和以下的前体细胞：视网膜色素上皮细胞、纤维原细胞、皮肤细胞如角化细胞、树突状细胞、毛囊细胞、肾管上皮细胞、平滑肌和骨骼肌细胞、睾丸祖细胞、血管内皮细胞、腱、韧带、软骨、脂肪细胞、纤维原细胞、骨髓基质、心肌、平滑肌、骨骼肌、周细胞、血管、上皮、神经胶质、神经细胞、星细胞和少突细胞。
在一个实施方案中，干细胞和其后代能够分化成周细胞。
在另外一个实施方案中，“多效细胞”通过培养不能产生造血细胞。
用于本发明的方法的干细胞可以来源于成人组织、胚胎或者胎儿。术语“成人”以其最广泛的含义被使用，包括出生后的受体。在一个优选的实施方案中，术语“成人”表示青春期后的受体。正如这里所使用的，术语“成人”还可以包括取自女性的脐带血。
本发明还涉及后代细胞的使用(其还被称为扩增细胞)，其由这里所披露的干细胞的体外培养产生。本发明的扩增细胞可以具有广泛的各种表型，这取决于培养条件(包括培养基中的刺激因子的数量和/或类型)、传代的数量等等。在某些实施方案中，在从亲本传代约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10代后获得后代细胞。但是，可以从亲本的任意次数的传代后获得后代细胞。
后代细胞可以通过在任何合适的培养基中培养来获得。用来表示细胞培养的术语“培养基”包括围绕着细胞的周围成分。培养基可以为固体、液体、气体或者相和物质的混合。培养基包括液体生长培养基，以及不支持细胞生长的液体培养基。培养基还包括凝胶状培养基，如琼脂、琼脂糖、凝胶和胶原基质。术语“培养基”还表示用于细胞培养的物质，即使它还没有接触细胞。换句话说，培养基用于细菌培养而制备的营养富集液体。
相似地，粉末混合物，当其与水或者其它液体混合而变成适合于细胞培养时，可以被称为“粉末培养基”。
在一个实施方案中，通过使用标记有STRO-3抗体的磁珠从骨髓分离TNAP+细胞来获得用于本发明的方法的后代细胞，其覆盖了前述的补充了20％胎儿小牛血清、2mM L-谷氨酰胺和100μM L-抗坏血酸-2-磷酸酯的α-MEM(见Gronthos等关于培养条件的详细信息，(1995))。
在一个实施方案中，这样的扩增细胞(至少5次传代后)可以为TNAP-、CC9⁺、HLA class I⁺、HLA class II^-、CD14^-、CD 19^-、CD3^-、CDlla-c^-、CD31^-、CD86^-和/或CD80^-。但是，在不同于这里所披露的培养条件下，不同标记物的表达可以改变是可能的。同样，虽然这些表型的细胞可能在扩增细胞群中占优势，这不表示不存在小部分不具有这种或这类表型的细胞(例如，小比例的扩增细胞可以是CC9-)。在一个优选的实施方案中，本发明的扩增细胞仍然具有分化成不同细胞类型的能力。
在一个实施方案中，本发明的方法中使用的扩增细胞群包括其中至少25％，更加优选至少50％的细胞是CC9+的细胞。
在另外一个实施方案中，本发明的方法中使用的扩增细胞群包括其中至少40％，更加优选至少45％的细胞是STRO-1+的细胞。
在另外一个实施方案中，后代细胞可以表达选自由LFA-3、THY-I、VCAM-I、ICAM-I、PECAM-I、P-选择素、L-选择素、3G5、CD49a/CD49b/CD29、CD49c/CD29、CD49d/CD29、CD29、CD 18、CD61、整合素β、6-19、血栓调节蛋白、CD10、CD13、SCF、PDGF-R、EGF-R、IGFl-R、NGF-R、FGF-R、瘦素-R、(STRO-2＝瘦素-R)、RANKL、STRO-1^bright以及CD 146组成的组或者这些标记物的任意组合的标记物。
在一个实施方案中，后代细胞可以为WO 2006/032092中定义的多效扩增MPC后代(MEMP)。制备后代来源于其的MPC的富集群的方法在WO 01/04268和WO 2004/085630中进行了披露。在体外环境中，MPC会很少以绝对的纯制备物存在，通常与组织特异性定型细胞(TSCC)的其它细胞在一起。WO 01/04268指出了以约0.1％到90％的纯度水平从骨髓收集这样的细胞。包括MPC(后代细胞来源于其)的种群可以直接从组织源收集，或者可选地，可以为已经在体外进行扩增的种群。
例如，可以从收集的、未扩增的、基本纯化的MPC种群(包括至少它们所存在的种群的总的细胞的至少约0.1％、1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或者95％)获得后代。例如，通过选择对于选自TNAP、STRO-1^bright、3G5⁺、VCAM-1、THY-1、CD146和STRO-2组成的组中的至少一个标记物呈阳性的细胞来达到这种水平。
MPC初始种群可以来源于WO 01/04268或WO 2004/085630中列出的任意一种或者多种组织类型，也就是骨髓、牙髓细胞、脂肪性组织和皮肤，或者可能更加广泛的来源于脂肪组织、牙齿、牙髓、皮肤、肝脏、肾、心脏、视网膜、脑、毛囊、肠、肺、脾、淋巴结、胸腺、胰腺、骨、韧带、骨髓、腱和骨骼肌。
MEMP可以与新收集的MPC区别开来，因为它们对于标记物STRO-1^bri是阳性的并且对于标记物碱性磷酸酶(ALP)是阴性的。相反，新分离的MPC对于STRO-1^bri和ALP都是阳性的。在本发明的一个优选实施方案中，至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或者95％的被给药的细胞具有STRO-1^bri、ALP^-表型。在另外一个优选的实施方案中，MEMP对于标记物Ki67、CD44和/或CD49c/CD29，VLA-3，α3β1中的一个或者多个是阳性的。仍然在另外一个优选的实施方案中，MEMP不显示TERT活性和/或对于标记物CD18呈阴性。
在一个实施方案中，细胞取自具有与血管发生相关的疾病的患者，使用常规技术体外培养并且给药于同源或者异源移植的患者。在可选的实施方案中，使用了一种或者多种已建立的人类细胞系的细胞。在本发明的另外一个实用的实施方案中，使用了非人类的动物细胞(或者如果患者不是人类，来源于其它物种)。
可以使用来源于任何非人类的动物种类的细胞(包括但是不限制于非人类灵长类动物、有蹄类动物、犬科动物、猫科动物、兔类动物、啮齿动物、鸟类和鱼类的细胞)来实践本发明。可以用来进行本发明的灵长类动物细胞包括但是不限制于黑猩猩、狒狒、猕猴、西半球或者东半球的任何其它猴子的细胞。可以用来进行本发明的有蹄类动物的细胞包括但是不限制于牛、猪、绵羊、山羊、马、水牛和野牛的细胞。可以用来进行本发明的啮齿动物的细胞包括但是不限制于小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠和沙鼠的细胞。可以用来进行本发明的兔类动物的种类的实施例包括家兔、北美西部产的大野兔、野兔、棉尾兔、雪鞋兔和鼠兔。鸡(Galhts gallus)是可以用来进行本发明的鸟类的实施例。
在本发明的方法中使用的细胞可以在使用前储藏。保存和储藏真核细胞，尤其是哺乳动物细胞的方法和方案在所属领域中是熟知的(例如Pollard，J.W.和Walker，J.M.(1997)Basic Cell CultureProtocols，Second Edition，Humana Press，Totowa，N.J.；Freshney，R.I.(2000)Culture of Animal Cells，Fourth Edition，Wiley-Liss，Hoboken，NJ.)。任何保持分离的干细胞，如间质干细胞/祖细胞，或其后代的生物活性的方法可以与本发明结合使用。在一个优选的实施方案中，使用低温贮藏来保持和储藏细胞。
细胞分选技术
用于本发明的方法的细胞可以使用多种技术获得。例如，可以使用借助于与细胞-抗体复合物相关的特性，或者连接到抗体上的标记的多种细胞分选技术，通过该技术细胞可以被物理分离。该标记可以为磁性颗粒或者荧光分子。抗体可以为交联的，这样它们形成多个细胞的聚集，其通过它们的密度是可分离的。可选地，抗体可以连接到理想的附着细胞的固定基质上。
在一个优选的实施方案中，使用结合TNAP⁺、STRO-1⁺、VCAM-1⁺、THY-1⁺、STRO-2⁺、3G5⁺、CD45⁺、CD146⁺的抗体来分离细胞。更加优选，使用结合TNAP⁺或者STRO-1⁺的抗体(或者其它结合剂)来分离细胞。
从未结合的细胞分离结合抗体的细胞的多种方法是已知的。例如，结合到细胞的抗体(或者抗同型抗体)可以被标记，然后通过观察到标记存在的机械细胞分选仪来分离细胞。荧光活化细胞分选仪在所属领域是熟知的。在一个实施方案中，抗TNAP抗体和/或STRO-1抗体连接到固体支持物。多种固体支持物是所述领域的一般技术人员已知的，包括，但是不限制于琼脂糖微球、聚苯乙烯珠、中空纤维膜、聚合物和塑料培养皿。抗体结合的细胞可以通过从细胞悬浮物简单地物理分离固体支持物从细胞悬浮物分离出来。
超顺磁性微粒可以用于细胞分离。例如，可以用抗TNAP抗体和/或STRO-1抗体涂布该微粒。抗体标记的超顺磁性微粒然后可以与含有所需细胞的液体一起孵育。该微粒结合到所需干细胞的表面，然后在磁场中收集这些细胞。
在另外一个实施例中，可以是细胞样品进行物理接触，例如固相连接抗TNAP单克隆抗体和/或抗STRO-1单克隆抗体。固相连接可以包含，例如，将抗体吸收到塑料、硝化纤维或者其它表面。抗体也可以被吸收到中空纤维膜的大孔(足够大到细胞流动穿过)的壁上。可选地，抗体可以共价地连接到表面或者珠子，如淀粉微球琼脂糖凝胶6MB大珠。固相连接的抗体与含有干细胞的悬浮液一起孵育的具体条件和持续时间取决于几个所使用的系统的特异性因素。但是合适条件的选择是所属领域的一般技术人员已知的。
以充足的时间使干细胞被结合之后，未结合的细胞被洗脱或者用生理缓冲液洗掉。未结合的细胞可以被回收，并且用于其它目的，或者在进行合适的测试以保证已经达到理想的分离之后再丢弃。然后通过合适的方法将结合的细胞从固相分离，主要取决于固相和抗体的性质。例如，可以通过剧烈搅拌将被结合的细胞从塑料培养皿洗脱。可选地，通过酶切或者消化固相和抗体之间的酶敏感的间隔序列从而洗脱被结合的细胞。连接到琼脂糖珠的间隔物(spacer)可以市场上获得，例如从淀粉微球。
然后，富集的洗脱细胞部分可以通过离心用缓冲液进行洗涤，可以将所述的富集部分为了以后的使用根据常规技术以活性状态被低温保藏，扩增培养和/或引入到患者中。
成份和给药
一般，药物组合物中被给予的细胞包含至少一种药物可接受载体。术语“药物可接受”表示那些在合理的医学判断的范围内，适合用于接触人类和动物的组织没有过量的毒性、刺激、过敏反应，或者其它并发症问题，合理的利益与风险比率相称的化合物、物质、组合物和/或药方。这里所使用的术语“药物可接受载体”表示要用可接受的物质、组合物或者媒介物，如液体或者固体填充物、稀释液、赋形剂，或者溶剂胶囊材料。
药物可接受载体包括盐、水溶性缓冲液、溶剂和/或分散介质。这样的载体的使用在所属领域中是熟知的。溶液优选是无菌的，并且流动达到可注射的程度。优选，该溶液在生产和储存的条件下是稳定的，并且通过使用例如苯甲酸酯类、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等来防止微生物，如细菌和真菌的污染来保存。
用作药物可接受载体的物质和溶液的一些实施例包括：(1)糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；(3)纤维素和衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；(4)黄蓍树胶粉；(5)麦芽；(6)凝胶；(7)滑石；(8)赋形剂，如可可脂和蜡栓剂；(9)油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)乙二醇，如丙二醇；(11)多羟基化合物，如丙三醇、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯，如油酸乙酯和十二酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)褐藻酸；(16)超纯水；(17)与血液浓度相同的盐；(18)林格液；(19)普通酒精；(20)pH缓冲溶液；(21)聚酯，聚碳酸酯和/或聚酸酐；和(22)药物制剂中使用的其它无毒的相容的物质。
用于本发明的方法的药物组合物包含聚合物载体和胞外基质。
多种生物的或者合成的基质材料(也就是，固体支持材料、生物粘合剂或者敷料剂，和生物/医学支架)适合用于本发明中。基质材料优选是医学可接受的，用于活体内应用的。这样的医学可接受和/或生物或生理可接受或者相容的材料的非限制性实施例包括，但是不限制于，可被吸收和/或不可被吸收的固体基质材料，如小肠黏膜下层(SIS)，例如来源于猪(或者其它SIS源)；交联或者非交联的藻酸盐、水状胶体、泡沫材料、胶原凝胶、胶原海绵、聚乙醇酸(PGA)网、聚乳酸羟基乙酸(PGL)网、羊毛状物(fleece)、泡沫辅料、生物粘合(举例来说，纤维蛋白胶和纤维蛋白凝胶)和一层或者多层死的去表皮的皮肤类似物。
纤维蛋白胶是一系列的外科密封剂，其已经被用于多种临床设置中。作为从事的一般技术人员，会认识到多种密封剂可用于本发明的方法的组合物中。但是，本发明的一个优选实施方案涉及与这里所披露的细胞在一起的纤维蛋白胶的使用。
当这里所使用的术语“纤维蛋白胶”表示通过在钙离子的存在下通过纤维蛋白胶的交联形成的不可溶的基质。该纤维蛋白胶可以从纤维蛋白原或者其的衍生物或者代谢物、纤维蛋白(可溶单体或者聚合物)和/或其来自生物组织或形成纤维蛋白基质的液体的复合物形成。可选地，纤维蛋白胶可以从纤维蛋白原或者其衍生物或代谢物，或者通过重组DNA技术产生的纤维蛋白产生。
纤维蛋白原也可以通过将纤维蛋白原和纤维蛋白胶形成的催化剂(如凝血酶和/或因子XIII)进行相互作用来形成。所述领域中的一般技术人员应该理解，纤维蛋白原在有催化剂(如凝血酶)的存在下蛋白水解分裂并且转化成纤维蛋白单体。然后，纤维蛋白单体形成聚合物，其可以交联形成纤维蛋白胶基质。纤维蛋白聚合物的交联可以通过催化剂，如因子XIII的存在而被提高。纤维蛋白胶形成的催化剂可以来源于血浆、冷凝蛋白质或者含有纤维蛋白原或者凝血酶的其它血浆组分。可选地，催化剂可以通过重组DNA技术产生。
凝块形成的速率取决于与纤维蛋白原混合的凝血酶的浓度。作为酶依赖性反应，温度越高(到达37℃)，凝块形成的速率越快。凝块的抗张强度取决于使用的纤维蛋白原的浓度。
在美国专利第5,643,192号披露了纤维蛋白胶的使用和其制备和使用的方法。美国专利第5,643,192号公开了纤维蛋白原的提取和来自单一捐献体的凝血酶成分以及用作纤维蛋白胶的只有这些成分的组合。美国专利第5,651,982号披露了纤维蛋白胶的另外一种制备和使用方法。美国专利5,651,982号提供了用作哺乳动物的局部密封剂的具有脂质体的纤维蛋白胶。
几个出版物披露了使用纤维蛋白胶用于传递治疗药物。例如，美国专利第4,983,393披露了用作阴道内插入物的组合物，其包含琼脂糖、琼脂、粘多糖盐溶液、胶原蛋白、纤维蛋白和酶。另外，美国专利第3,089,815披露了由纤维蛋白原和凝血酶组成的可注射药物制备物，美国专利第6,468,527披露了有利于将多种生物或者非生物药物传递到体内的特异性位点的纤维蛋白胶。这样的方法可以用在本发明的方法中。
合适的聚合物载体包括合成聚合物或者天然聚合物形成的多孔网或者海绵体，以及聚合物溶液。基质的一种形式是聚合物网或者海绵体；另外一种是聚合物水凝胶。可以使用的天然聚合物包括蛋白质，如胶原蛋白、清蛋白和纤维蛋白；和多糖，如藻酸盐和透明质酸的聚合物；合成的聚合物包括生物可降解的生物不可降解的聚合物。生物可降解的聚合物的实施例包括羟基酸的聚合物，如聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)和聚乳酸-乙醇酸(PLGA)，聚原酸酯、聚酸酐、聚磷腈和其组合。
生物不可降解聚合物包括聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、乙二醇二乙酸酯和聚乙烯醇。
可以形成具有延展性的离子或者共价交联的水凝胶的聚合物被用于将细胞胶囊化。水凝胶是当有机聚合物(天然或者合成的)通过共价、离子或者氢键交联从而形成的捕获水分子形成凝胶的三维开放式层格结构而形成的物质。可以用于形成水凝胶的物质的实施例包括多糖，如藻酸盐，聚磷嗪和聚丙烯酸酯，它们是离子交联的，或者嵌段共聚物，如Pluronics^TM或Tetronics^TM，聚环氧乙烷-聚丙二醇嵌段共聚物，其分别是通过温度或者pH值交联的。其它物质包括蛋白质，如纤维蛋白，聚合物如聚乙烯吡咯烷酮，透明质酸和胶原蛋白。
一般，这些聚合物在水溶液中，如水、缓冲盐溶液或者乙醇水溶液，至少是部分可溶的，其带有侧基或者它们的单价离子盐。具有可以与阳离子反应的酸性侧基的聚合物的实施例是聚磷腈、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物、聚乙酸乙烯酯，和磺化聚合物，如磺化聚苯乙烯。也可以使用通过丙烯酸或者甲基丙烯酸和乙烯醚单体或者聚合物的反应形成的带有酸性侧基的共聚物。酸性侧基的实施例是羧酸基团、磺酸基团、卤代(优选氟化)基团、酚OH基团、酸性OH基团。具有能够与阴离子反应的碱性侧基的聚合物的实施例是聚乙烯胺、聚乙烯吡啶、聚乙烯咪唑，和一些亚氨基取代的聚磷腈。聚合物的铵盐或者季盐也可以从骨架氮或者侧亚氨基形成。碱性侧基的实施例是氨基和亚氨基。
另外，用于本发明的方法的组合物可以包含至少一种治疗药物。例如，该组合物可以含有止痛剂从而帮助治疗炎症或者疼痛，另外的抗血管新生化合物，或者抗感染药物从而防止治疗的组合物的位点的感染。更详细地讲，有效的治疗药物的非限制性实施例包括以下的治疗类型：止痛剂，如非类固醇的抗炎药、麻醉性止痛药和水杨酸盐；抗感染药，如驱肠虫药、抗厌氧菌药、抗生素、氨基糖苷类抗生素、抗真菌抗生素、头孢菌素抗生素、大环内酯抗生素、其它β-丙醯胺抗生素、青霉素、对苯二酚抗生素、磺胺类抗生素、四环系抗生素、抗肺结核药物、抗结核抗肺结核药物、抗原生动物剂、抗阿米巴药、抗疟药、抗病毒剂、抗反转录病毒药物、灭疥癣药、抗炎药、皮质类固醇、抗炎药、止痒剂/局部麻醉剂、局部抗感染药、抗真菌局部抗感染药、抗病毒局部抗感染药；电解剂或者肾脏药，如酸化剂、碱化剂、利尿药、碳酸酐酶抑制剂利尿药、髓袢利尿药、渗透性利尿药、留钾利尿药、噻嗪类利尿药、电解质替代物和促进尿酸排泄药；酶，如胰腺酶和溶栓酶；肠胃病药，止泻药、胃肠抗炎药、抗酸抗溃疡药、胃酸泵抑制剂抗溃疡药、胃粘膜抗溃疡药、H2阻断剂抗溃疡药、胆石溶解药物、消化药、催吐剂、泻药和湿润性泻药，和促胃肠动力药；全身麻醉剂，如吸入式麻醉剂、卤化吸入式麻醉剂、静脉麻醉剂、巴比妥盐静脉麻醉剂、苯二氮静脉麻醉剂，和麻醉性止痛药静脉麻醉剂；激素和激素调整剂，如堕胎药、肾上腺素药、皮质类固醇肾上腺素药、男性激素、抗雄激素物质，免疫生物制剂，如免疫球蛋白、免疫抑制剂、类毒素，和疫苗；局部麻醉剂，如氨基局部麻醉剂和酯类局部麻醉剂；肌骨胳药物，如抗痛风抗炎药、皮质类固醇抗炎药、金制剂抗炎药、免疫抑制抗炎药、非类固醇抗炎药(NSAID)、水杨酸盐抗炎药、矿物；和维生素，如维生素A、维生素B、维生素C、维生素D、维生素E和维生素K。
可以与本发明一起以单一的组合物或者作为联合治疗来使用的其它的抗血管新生因子的实施例包括，但是不限制于血小板因子4；硫酸鱼精蛋白；硫酸甲壳素衍生物(由雪花蟹的壳制备)；硫酸化多糖肽聚糖复合物(SP-PG)(该化合物的功能可以通过类固醇，如雌激素，枸橼酸三苯氧胺的存在而被提高)；星孢菌素；基质代谢的调节物，包括例如脯氨酸类似物、羟脯氨酸、d，L-3，4-脱氢脯氨酸、硫杂脯氨酸、α，α-联吡啶、延胡素酸氨基丙腈酯；4-丙基-5-(4-吡啶)-2(3H)-唑酮；甲氨蝶呤；米托蒽醌；肝磷脂；干扰素；2巨球蛋白血清；CHIMP-3；糜蛋白酶抑素；环糊精十四硫酸酯；Eponemycin；喜树碱；烟曲霉素；硫代苹果酸金钠；抗胶原酶血清；α2-抗血纤维蛋白溶酶；比生群(Bisantrene)(美国国家癌症研究所National Cancer Institute)；氯苯扎利二钠(N-(2)-羧苯基-4-氯邻胺苯甲酸二钠)；沙利度胺(Thalidomide)；血管静止类固醇；AGM-1470；羧基胺基咪唑；和金属蛋白抑制剂，如BB94。
在某些实施方案中，治疗药物可以为生长因子或者影响细胞分化和/或增殖的其它分子。诱导最终的分化状态的生长因子在所属领域中是熟知的，并且可以从已经显示出诱导最终分化状态的任意的这样的因子中选择。在这里所披露的方法中使用的生长因子，在某些实施方案中，可以为自然产生的生长因子的变体或者片断。
用于本发明的方法的组合物可以包括细胞培养成分，举例来说，包括氨基酸、金属、辅酶因子，以及少量的其它细胞，例如通过干细胞的随后分化产生的，的培养基。
用于本发明的方法的组合物可以通过，例如将受体细胞从培养基沉积出来并且再将它们分散在理想的溶液或者物质中来制备。细胞可以通过，例如离心、过滤、超滤等从培养基沉积和/或置换出来。
熟练的技术人员可以容易地确定组合物中细胞和可选的载体的量，并且以本发明的方法进行给药。在一个实施方案中，在磷酸盐缓冲液中以0.001％到50％(重量)的量存在任何添加剂(除了活性细胞)，并且活性成为以大约微克到毫克的级别存在，如约0.0001wt％到约5wt％，优选约0.0001wt％到约1wt％，仍然更加优选约0.0001wt％到约0.05wt％或者约0.001wt％到约20wt％，优选约0.01wt％到约10wt％，并且仍然更加优选约0.05wt％到约5wt％。当然，对于任何要被给药于动物或者人类的组合物，和对于任何特殊的给药方法，因此优选确定：毒性，如通过确定合适的动物模型(举例来说如小鼠的啮齿动物)中的致死剂量(LD)和LD₅₀；组合物的剂量，其中成分的浓度和组合物给药的时间选择，其产生适当的反应。这样的确定无须出自熟练的工作人员的知识的过度实验，在这里引用了其披露和文件。并且，可以确定连续给药的时间而不需要过度实验。
组合物中的细胞的浓度为至少约5x10⁵个细胞/mL，至少约1x10⁶个细胞/mL，至少约约5x10⁶个细胞/mL，至少约约10⁷个细胞/mL，至少约2x10⁷个细胞/mL，至少约3x10⁷个细胞/mL，或者至少约5x10⁷个细胞/mL。
用于本发明的方法的组合物可以通过(除了别的以外)局部注射来给药，包括导管给药、系统注射、局部注射、静脉注射、子宫内注射或者胃肠外给药。当给药这里所披露的治疗组合物(举例来说，药物组合物)时，其通常会被配置成单位剂量可注射的形式(溶液、悬浮液、乳液)。
遗传改性细胞的产生
在一个实施方案中，本发明的方法中使用的细胞是遗传改性的。优选，该细胞遗传改性从而产生外源蛋白。一般，细胞会被遗传改性从而可从该细胞分泌外源蛋白。但是，在一个实施方案中，细胞可以改性从而表达功能性非蛋白质编码多核苷酸，如dsRNA(通常用于RNA沉默)、反义低聚核苷酸或者催化核酸(如核酶或者脱氧核酶DNAzyme)。
遗传改性细胞可以在有至少一种足够支持改性细胞生长的量的细胞因子的存在下培养。这样获得的遗传改性细胞可以立即使用(举例来说在移植中)，培养或者体外扩增，或者为了以后的使用而储存起来。该改性细胞可以以所属领域中熟知的方法储存起来，举例来说冷冻在液氮中。
这里所使用的遗传改性包括任何遗传改性方法，其包括将外生或者外来的多核苷酸引入到这里所披露的细胞中或者细胞中的外源基因的改性。遗传改性包括但是不限制于转导(在体内或者体外，病毒介导受体或者捐赠体的受体DNA转移到受体)，转染(具有分离的病毒DNA基因组的细胞的变化)，脂质体介导的转移，电穿孔、磷酸钙转染或者共沉淀和其它。转导的方法包括细胞与生产细胞的共培养(Bregni等，1992)或者与在有或者没有合适的生长因子或者聚阳离子下与单独的病毒上清夜培养。
在本发明一个有用的实施方案中，细胞被遗传改性从而含有破坏或者抑制血管新生的基因。该基因可以编码细胞毒素药物，如蓖麻毒素。在另外一个实施方案中，该基因编码引起免疫排斥反应的细胞表面分子。例如，细胞可以被遗传改性从而产生α1，3半乳糖基转移酶。这个酶合成为主要异种抗原的α1，3半乳糖基抗原决定位，并且它的表达造成基因改性的内皮细胞的通过已存在的循环抗体和/或通过T细胞介导的免疫排斥的超急免疫排斥。
优选以载体将外源多核苷酸引入到细胞中。载体优选包括被插入的编码序列的转录和翻译的必要部分。用于构造这样的治理的方法在所属的领域中是熟知的。例如，构造合适的表达载体的技术在Sambrook等的Molecular Cloning：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Press，N.Y.(3rd Ed.，2000)；和Ausubel等的CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，Inc.，New York(1999)详细地进行了披露。
载体可以包括，但是不限制于病毒载体，如逆转录酶病毒、腺病毒、腺相关病毒，和单纯疱疹病毒；粘粒；质粒载体；合成载体；和其它在所属领域中通常使用的重组载体。含有启动子和多核苷酸可以有效地连接于此的克隆位点的载体在所属领域中是熟知的。这样的载体可以在体外或者体内转录RNA，并且可以从如Stratagene(La Jolla，Calif.)和Promega Biotech(Madison，Wis.)的来源商业获得。特殊的实施例包括Stratagene的pSG、ρSV2CAT、pXtl；和Pharmacia的pMSG、pSVL、pBPV和pS VK3。
优选的载体包括逆转录病毒载体(见Coffin等″Retroviruses″，第9章pp；437-473，Cold Springs Harbor Laboratory Press，1997)。用于本发明的载体可以通过所属领域中熟知的方法重组产生。例如，WO94/29438，WO97/21824和WO97/21825披露了逆转录病毒包装质粒和包装细胞系的构造。示例性载体包括pCMV哺乳动物表达载体，如pCMV6b和pCMV6c(Chiron Corp.)，pSFFV-Neo，和pBluescript-Sk+。有用的逆转录病毒载体的非限制性实施例是那些来源于鼠、鸟或者灵长类动物的逆转录病毒。一般的逆转录病毒载体包括那些基于鼠莫洛尼氏白血病毒的(MoML V-载体)。其它源自MoMLV的载体包括Lmily、LINGFER、MINGFR和MINT。其它的载体包括那些基于类人猿(ape)白血病病毒(GALV)和莫罗尼(Moloney)小鼠肉瘤病毒(MOMSV)和脾灶形成病毒(SFFV)的。来源于鼠干细胞病毒(MESV)的载体包括MESV-MiLy。逆转录病毒载体还包括基于过滤性病毒的载体，非限制性实施例包括基于人类免疫缺陷病毒(HIV-I and HIV-2)的载体。
在产生逆转录病毒载体的构造中，可以将病毒的gag，pol和env序列从病毒中去除，创造插入外源DNA序列的空间。外源DNA序列编码的基因通常在长末端重复(LTR)的强病毒启动子的控制下表达。合适的控制调控序列的选择取决于使用的受体细胞，并且选择是在所属领域的一般技术人员的技能范围内。除了LTR的启动子之外，多种启动子是已知的。非限制性的实施例包括λPL启动子，人类细胞巨化病毒(CMV)立即早期启动子；莫罗尼小鼠肉瘤病毒(MMSV)鲁斯氏肉瘤病毒(RSV)，或者脾灶形成病毒(SFFV)的U3区启动子；颗粒酶A启动子；和颗粒酶B启动子。另外，可以使用可诱导的或者多种控制部分。对于所属领域的一般技术人员，合适的启动子的选择是显而易见的。
这样的构造可以被有效地包装到载体颗粒中，如果通过包装细胞系在转化中提供gag，pol和env的功能。因此，当构造载体被引入到包装细胞时，该细胞产生的gag-pol和env蛋白质与载体RNA组合从而产生分泌到培养基中的有感染性的病毒。这样产生的病毒可以感染和整合进入到靶细胞的DNA中，但是不产生感染性的病毒颗粒因为它缺少必要的包装序列。目前使用的大部分包装细胞系已经转染了单独的质粒，每一个含有必需的编码序列中的一个，这样在可以产生能够复制的病毒之前，多个重组事件是必需的。可选地，包装细胞系包含pro病毒。该pro病毒是残缺的，因此虽然它可以产生包装感染病毒所需要的所有蛋白，它自己的RNA不能被包装到病毒中。取而代之包装的是从重组病毒产生的RNA。因此，从包装细胞释放的病毒原液只含有重组病毒。逆转录病毒包装细胞系的非限制性实施例包括PA12、PA317、PE501、PG13、PSI.CRIP、RDI 14、GP7C4TA-G10、ProPak-A(PPA-6)和PT67。
其他合适的载体包括腺病毒载体(见WO 95/27071)和腺相关病毒载体。这些载体在所属领域中是熟知的，举例来说，Stem CellBiology and Gene Therapy，eds.Quesenberry等，John Wiley&Sons1998；和美国专利第5,693,531号和第5,691,176号中所披露的。源自腺病毒载体的使用在某些情况下使优选的，因为它们不能感染未分裂的细胞。不像逆转录病毒DNA，腺病毒DNA不能整合到靶细胞的基因组中。另外，腺病毒载体的携带外源DNA的能力要比逆转录病毒载体高得多。腺相关病毒载体是另外一个有用的传递系统。这种载体的DNA可以整合到未分裂的细胞中，使用腺相关病毒载体已经将多个多核苷酸成功地引入到不同的细胞类型中。
在一些实施方案中，载体或者构造体会包括两个或者多个异源多核苷酸序列。优选，额外的核酸序列是编码选择性标记物、结构基因、治疗基因或者细胞因子/化学因子基因的多核苷酸。
选择性标记物可以包括在构造体或者载体中，基于监控成功的遗传改性和为了筛选DNA已经被整合到其中的细胞的目的。非限制性实施例包括药物抗性标记物，如G148或者潮霉素。可以使用其它的阴性选择，例如其中的标记物是HSV-tk基因。该基因会使细胞对如阿昔洛韦或者更昔洛韦的药物敏感。通常使用NeoR(新霉素/G148抗性)，但是可以使用任何方便的标记，其基因序列在使用的靶细胞中不是已经存在的。其它的非限制性实施例包括低亲和力神经生长因子(NGFR)、增强型绿色荧光蛋白(EFGP)、二氢叶酸还原酶基因(DHFR)、细菌hisD基因、鼠CD24(HSA)、鼠CD8a(lyt)、产生对嘌呤霉素或者腐草霉素的细菌基因，和β-半乳糖苷酶。
可以在同一载体上或者通过第二载体将其它多核苷酸序列引入到受体细胞。在一个优选的实施方案中，选择性标记物可以以多核苷酸被包括在同一载体上。
本发明还包含遗传改性外源基因的启动子区域，从而外源基因的表达被上调，导致与野生型细胞相比编码蛋白质的产量提高。
提供抗癌药物
这里所使用的术语“抗癌药物”表示抑制或者防止癌细胞的功能和/或造成癌细胞的破坏的任何物质。例如，抗癌药物可以是细胞毒素药物。抗癌药物可以结合到干细胞或者其后代细胞。在一个实施方案中，干细胞或者其后代细胞，包含编码抗癌药物的转基因。
这里所使用的“细胞毒素药物”表示抑制或者防止细胞的功能和/或造成细胞的破坏的任何物质。该术语要包括化学疗法药物和如细菌、真菌、植物或者动物源的酶活性毒素的毒素，或者其片断。细胞毒素药物可以结合到细胞的靶向部分，如抗体。在一个优选的实施例中，细胞毒素由已经被遗传改性的细胞的转基因产生。
在一个优选的实施例中，抗癌药物不杀死干细胞或者其后代细胞。这样的药物的实施例包括IL-2、干扰素-γ、抗-VEGF单克隆抗体和生物活性核酸，如核酶和dsRNA，其靶向癌症细胞编码的重要基因。另外，抗癌药物可以是前毒形式，其在体内被加工(如分裂)从而释放活性的抗癌药物。
这里的术语“抗体”是以最广泛的意义使用的，特别涵盖了单克隆抗体、多克隆抗体、多特异抗体(举例来说双特异抗体)，和抗体片断，只要它们表现出想要得生物活性，例如结合癌细胞。抗体可以为鼠、人类、人化的、嵌合的，或者来源于其它种类。
“抗体片断”包含全长抗体的一部分，通常为其抗原结合或者可变区。抗体片段的实施例包括Fab、Fab′、F(ab′)₂，和Fv片断；双抗体；线性抗体；Fab表达库产生的片断、抗独特型(anti-Id)抗体、CDR(互补决定区)和以上任何一个的抗原决定部位结合片断，其免疫特异性地结合到癌细胞的抗原、单链抗体分子；来源于抗体片段的多特异抗体。
可以用作细胞毒素的酶活性蛋白质毒素和其片断包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片断、霍乱毒素、肉毒毒素、外毒素A链(来源于绿脓杆菌)、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、药莲毒素A链、α-八叠球菌毒素、油桐蛋白质、香石竹蛋白质、美洲商陆蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、泻果素、巴豆毒蛋白、肥皂草抑制剂、截短型细胞毒素、免疫毒素、mitogellin、局限曲菌素、酚毒素、伊诺霉素和新月毒素。
抗体-细胞毒素结合物所靶向的肿瘤相关药物或者细胞表面受体的实施例包括，但是不限制于BMPRlB(骨形成蛋白受体型IB)、E 16、STEAPl(六前列腺跨膜上皮抗原)、0772P(CA125，MUC16)、MPF(MSLN、SMR、巨核细胞集落刺激因子、间皮素)、Napi3b(NAPI-3B、NPTIIb、SLC34A2、溶质携带物家族34(磷酸钠)、成员2、钠依赖性磷酸盐转运体3b)、Sema 5b(FLJ10372、KIAA1445、Mm.42015、SEMA5B、SEMAG、轴突导向因子5b Hlog、sema域、七凝血栓蛋白重复(I型和类似1型)、跨膜区(TM)和短胞浆区、(轴突导向因子)5B、PSCA hlg(2700050C12Rik、C530008016Rik、RIKEN cDNA 2700050C12、RIKEN cDNA 2700050C12基因)、ETBR(内皮素B型受体)、MSG783(RNF 124、假定蛋白FLJ20315)、STEAP2(IPCA-I、PCANAPl、STAMPl、STEAP2、STMP、前列腺癌相关基因1、六前列腺跨膜蛋白)、TrpM4(BR22450、FLJ20041、TRPM4、TRPM4B、瞬时性受体电位阳离子通道、亚家族M、成员4)、CRIPTO(CR、CR1、CRGF、CRIPTO、TDGFl、畸胎瘤衍生生长因子)、CD21(CR2(互补受体2)或者C3DR(C3d/艾伯斯坦-巴尔病毒受体)或者Hs.73792)、CD79b(CD79B、CD79p、Igb(免疫球蛋白关联β)B29、FcRH2(IFGP4、IRT A4、SPAP1A(含有磷酸酶锚蛋白Ia的SH2域)、SPAP1B、SPAP1C)、HER2、NCA、MDP、IL20Rα、EphB2R、ASLG659、PSCA、GEDA、BAFF-R(B细胞活化因子受体、BlyS受体3)、CD22(B细胞受体CD22-β异构体)、CD79α、CXCR5(Burkitt淋巴瘤受体1)、HLA-DOB(结合多肽并且将它们递呈给CD4+T淋巴细胞的MHC类II分子(la抗原))、P2X5(嘌呤能受体P2X配体门离子通道)、CD72(B细胞分化抗原CD72、Lyb-2)、LY64(淋巴细胞抗原64(RP105))、FCRHl(Fc受体类似物蛋白)、IRTA2(免疫球蛋白超家族受体转移关联2)，和TENB2。
实施例
通过以下的非限制性实施例并且通过参考附图在下文中描述了本发明。
实施例1：脉络膜心血管形成的诱导(CNV)
材料和方法
动物的准备和麻醉
研究中总共使用了15只裸大鼠，实验室是根据视觉和眼科研究协会(ARVO)对于眼科和视觉研究中使用动物的声明来进行。所有的大鼠饲养在处于22℃恒温的笼里的隔离的、消毒的设施(每只笼2质动物)，12∶12小时的光/暗循环(0800小时的光)，任意获得食物和水。通过肌肉注射甲苯噻嗪(6mg/kg，Bayer AG，Germany)和注射可他命(50mg/kg，Lambert公司，USA)来麻醉大鼠。至少在激光凝固、玻璃体腔注射和照相之前10分钟，以2.5％苯肾上腺素(Chauvin Pharmaceuticals Ltd，Romford，Essex)和1％睫状肌松弛剂(Alcon，Belgium)扩张瞳孔。在实验的整个过程使用了无菌技术。
氪激光辐射
用手持滑盖作为接触眼镜通过蔡司狭缝灯对每只动物的左眼进行氪激光辐射(647.1nm，相干辐射系统，CA，USA)。以100μm直径、0.1秒持续时间和150mW的强度的设定，对每只眼睛围绕着后极部的视神经进行6-11个激光灼伤。
彩色眼底照相(CFP)
在照相之前，如在动物的准备和麻醉中提到的一样麻醉动物。在照相前至少10分钟，以2.5％苯肾上腺素(Chauvin PharmaceuticalsLtd，Romford，Essex)和1％睫状肌松弛剂(Alcon，Belgium)扩张瞳孔。使用小型动物眼底照相机(Kowa Genesis东京，日本)和KodakElite 200ASA胶卷进行大鼠眼底照相。
荧光素血管造影术(FA)
通过腹膜内注射0.1ml 10％的荧光素钠在所有的大鼠上进行荧光素血管造影术。使用与CFP相同的照相机(Kowa Genesis东京，日本)来对视网膜脉管系统进行照相，但是具有增加的用于荧光素血管造影术的阻挡滤片。在给药了荧光素钠之后，立即使用KodakTmax 400ASA单色专业胶片以0.5-1分钟的间隔进行单个照片的拍摄。
脉络膜新血管(CNV)的形成和程度
使用CFP和FA监控使用这个模型的眼睛中的脉络膜新血管(CNV)的形成和程度。麻醉了的动物被腹膜内注射0.3到0.4ml 10％的荧光素钠，使用荧光眼底照相对眼睛进行照相。使用密度计量方法计算荧光素渗漏的程度(Marano和Rakoczy，2005)。简单来说，使用LS-4000ED胶片扫描仪(Nikon Corp.，东京，日本)将荧光素血管造影扫描到电脑内用于输入Quantity基本密度计量软件(Bio-Rad，CA，美国)。计算每个损伤的相对荧光(rf)，然后通过与严重程度模板(其被用于产生rf间隔，其中0-20的rf，无渗漏；21-70，轻度渗漏；71-120，中度渗漏和＞121，严重渗漏)将这些值转化为严重程度评价值。通过ANOVA以Fishers LSD事后分析来比较各个时间点的平均严重程度评价值。在p＜0.05，差异认为显著。另外，计算每个损伤评价值的频率，制表并且以图表示。
组织研究
在注射后7天以过量的戊巴比妥钠(Nembutal)处死5只大鼠，剩余的10只大鼠在完成实验的28天被处死。将7天处死的动物中的两只的被激光治疗的眼睛植入到OCT培养基中并且液氮冷冻用于荧光显微观察和使用用于巨噬细胞观察得CD68抗体的免疫组织化学。在紫外光下检查切片，并且使用Olympus显微镜(Olympus，东京，日本)和Olympus DP70摄影机以20倍放大及2秒的曝光时间获取图像。其余的在7天和28天被人道处死的动物的眼睛被摘除，在10％中性缓冲盐或者4％多聚甲醛中固定4小时。为了组织病理学检查，在经过梯度酒精的常规治疗之后，眼睛被植入到石蜡中，以5μm进行切片，放置在硅化玻璃片上，并且用苏木精和曙红(H&E)染色。
结果
彩色眼底照相用于确定激光损伤的存在(图1a)。随后进行荧光素血管造影术从而证明每个损伤的荧光素渗漏水平，其提供了CNV发展水平的指示。激光凝固后7天的最初的临床观察显示对于多数损伤为0到轻度水平的渗漏(图1b)。在这个时间点之后，在14天观察到渗漏水平的急剧上升(图1c)，到28天，泄露水平似乎再次上升，但是与7-14天的上升相比是轻微的(图1d)。
随后计算了激光凝固后7、14和28天的每个损伤的严重程度评价值从而提供各个时间点的平均严重程度评价值(图2)。在7天，平均渗漏评价值正好在0到轻度的范围内(0.86±0.07)，表示在这个点渗漏是最低的。这个发现显示由于CNV的荧光素渗漏没有在其他啮齿动物种类的激光凝固之后的最开始的3到4天发生。在14天，因为CNV发展了，平均渗漏评价值从7天的水平显著升高(1.8±0.1p＜0.01)。在激光凝固后28天，损伤的平均严重评价值再次升高，但是与14天的评价值相比不显著(1.96±0.1；p＞0.01)，表示由于CNV的泄露在这个时间点附近达到最高。
进行第二项分析，其检测了每个时间点的每个损伤评价值的频率(表1和图3)。在7天，超过87％的损伤表现出0到轻度渗漏((29.3％0，58.6％轻度)，其余的显示出中度到严重的渗漏。到14天，每个损伤评价值的频率急剧变化，0到轻度评价值降低到总损伤的32.4％(分别为7％和25.4％)。多数损伤(47.9％)是在中度的范围内，表现出强渗漏的损伤的数目从7天的1％上升到19.7％，从而产生了总损伤的67.6％是在中度到严重的评价值。到28天，发展到更高评价值的损伤的数目放缓。0等级损伤的数目已经降低到2.8％，其是该模型的典型性，并且被认为作为小比例的激光损伤不能使Bruch膜破裂，因此从未发展CNV。多数评价值(70％)保持在中度到强度等级(分别为42.2％和28.2％)，其也是该模型的典型性。
表1.各个时间点上的每个损伤的频率

0＝无渗漏；
1＝轻度渗漏；
2＝中度渗漏；
3＝严重渗漏。
眼睛的组织切片显示了正常的没有激光作用过的视网膜的外观(图4a)，以及激光凝固之后的视网膜的外观，显示了损伤和Bruch膜的破裂(图4b，显示了横条)，其对于这个模型的有效性是必要的。在切片的检查中，在损伤位点中识别到了红血球的存在(图4c，箭头)，其是早期CNV发展的指示。到28天，红血球的存在表现出以显著的比例上升(图4d和e，箭头)。这些发现与计算的严重程度评价值和每个渗漏值的频率分布是相关的。
在紫外显微镜下，使用FITC标记的第二抗体用于可视化，在冷冻切片上进行CD68抗原(巨噬细胞)的观察。未观察切片的可视化(图5)显示视网膜组织表现的自身荧光，其中经过损伤位点(箭头)可看到残余的RPE层(以黄色显示)。在脱色和免疫观察之后，不能观察到巨噬细胞的可见迹象(未显示数据)。
讨论
确定了由这里所披露的氪激光凝固诱导的脉络膜新血管化是用于治疗眼部新血管化的能力的测试的合适模型。
实施例2：人类细胞在CNV发展上的作用
材料和方法
如实施例1一样，准备动物并且进行麻醉，进行氪激光辐射。也按照实施例1进行CNV的评价。
细胞的制备
根据Royal Adelaide医院的机构伦理委员会批准的程序，从健康的正常成人捐献者(20-35岁)分离骨髓(BM)。简单来说，将40ml的BM从髂嵴后部吸入到装有肝素锂抗凝剂的试管中。如以前所披露的(Zannettino et al.，1998)，使用Lymphoprep^TM(NycomedPharma，Oslo，挪威)通过密度梯度离心制备BMMNC。在于4℃以400x g离心30分钟后，用移液管去除淡黄色层，并且在由Hank′s均衡盐溶液构成的(HBSS；Life Technologies，Gaithersburg，MD)含有5％的胎牛血清(FCS，CSL Limited，Victoria，澳大利亚)的“HHF”中洗涤三次。
通过前面所披露的磁激活细胞分选来分离TNAP+细胞(Gronthos等，2003；Gronthos等，1995)。简单来说，大约1-3x10⁸BMMNC在由HHF中的10％(v/v)常规兔血清构成的封闭液中冰上孵育20分钟。细胞与200μl的10μg/ml STRO-3mAb溶液在封闭液中冰上孵育1小时。
然后通过400xg离心，将细胞在HHF中洗涤两次。加入羊抗鼠γ-生物素(Southern Biotechnology Associates，Birmingham，英国)的HHF缓冲液的1/50稀释液，然后细胞冰上孵育1小时。
细胞在如上的MACS缓冲液(补充了1％BSA、5mM EDTA和0.01％叠氮化钠的无Ca2+和Mn²⁺的PBS)，以0.9ml的终体积被重新悬浮在MACS缓冲液。
将100μl的链霉亲和素微珠(Miltenyi Biotec；Bergisch Gladbach，德国)添加到细胞悬浮液中，冰上孵育15分钟。细胞悬浮液洗涤两次，然后再悬浮在0.5ml的MACS缓冲液中，随后装载到微型MACS柱上(MS柱，Miltenyi Biotec)，以0.5mlMACS缓冲液洗涤三次从而回收未结合STRO-3mAb的细胞(2005年12月19日存放在美国细胞、菌种库(ATCC)，收录号PTA-7282，见共同未决国际专利申请WO 2006/108229)。在又添加了1ml MACS缓冲液之后，将该柱从磁体移开，通过正压分离TNAP阳性细胞。用链霉亲和素-FITC染色每个组分的一等分的细胞，用流式细胞仪检测纯度。
通过将其放置在以前披露的补充了20％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺和100μm L-抗坏血酸盐-2-磷酸盐的α-MEM(Gronthos等，1995)中建立从MACS分离的TNAP+细胞的基本培养。
这里所披露的制备的细胞还可以表示为人类间质前体细胞(HMPC)。
玻璃体内注射
通过在眼睛角膜的后部1mm的微点的玻璃体插入30-gauge针来进行玻璃体内注射。通过操作显微镜进行和直接观察插入和输液。小心不损害视网膜的晶状体。在激光凝固后一天在大鼠的左眼注射2μl细胞(5.625x 10⁴个细胞/μl)，试图将细胞放在玻璃体开口的上部和外围。
组织学研究
在28天实验完成以后，以过量的戊巴比妥钠(Nembutal)处死大鼠。摘除这些动物的所有眼睛，在10％中性盐缓冲液或者4％多聚甲醛中固定4小时。在经过梯度乙醇常规治疗之后，将眼睛植入石蜡，以5μm切片，放置在硅化玻璃片上，用苏木精和曙红(H&E)染色，从而进行组织病理学检查。
结果
使用CFP来确定动物的被治疗的眼睛中的激光损伤的存在，在CFP之后立即进行FA从而显示每个损伤的荧光素渗漏的水平(图6)。在注射了细胞但是没有激光凝固的对照眼睛中，眼底(图6a)和脉管系统(图6b)表现正常。在被治疗的眼睛中，注射后7天，激光损伤是清楚可见的(图6c，箭头)，FA显示对于多数损伤0到轻度水平的渗漏占优势(图6d，箭头)。在这个时间点之后，使用CFP14天的损伤仍然是清楚可见的(图6e，箭头)。但是，使用FA的最初观察(图6f)提示如在实施例1中的14天的对照眼睛中观察到的，渗漏没有显著升高。在注射后28天也发现了该情况，其中损伤仍然是清楚可见的(图6g，箭头)，但是渗漏似乎没有以显著的量升高(图6h)。
随后计算了注射细胞后7、14和28天的每个损伤的严重程度评价值，从而提供了每个时间点的平均严重程度评价值(图7)。在7天，平均渗漏评价值正好在0到轻度的范围内(0.88±0.14)，表示在这个时间点渗漏是最低的。该结果与实施例1(0.86±0.07)在同样的时间点测量的对照动物没有显著的差异(p＞0.05)。在14天，平均渗漏平均值没有从7天的水平显著升高((0.93±0.16，p＞0.05)并且显著低于14天对照组的损伤评价值(1.8±0.1，p＜0.01)。相似地，在注射后28天，损伤的平均严重程度评价值升高，但是与7天的评价值相比不显著(1.18±0.17；p＞0.01)并且显著低于对照组的对比评价值(1.96±0.1，p＜0.01)。
与实施例1相似，检测了每个时间点的每个损伤评价值的频率(表2和图8)。在7天，超过73％的损伤显示出0到轻度渗漏，剩余的显示中度渗漏。到14天，频率的分布没有显著的变化，39.9％的损伤仍然显示0渗漏。轻度渗漏的损伤有轻微的下降(35.3％到28.6％)，中度渗漏的损伤少量上升(26.5％到32.1％)，没有损伤存在严重渗漏。到28天，少量的损伤已经发展到严重程度(8.7％)，高比例的仍然表现为0渗漏(32.4％)。这些数据与对照组形成对比，其中在14和28天，0渗漏评价值得比例已经分别降低到7％和2.8％，严重损伤的数量分别为19.7％和28.2％。
表2各个时间点的每个损伤评价值的频率值


0＝无渗漏；
1＝轻度渗漏；
2＝中度渗漏；
3＝严重渗漏。
图9中呈现的眼睛的组织切片显示大量巨噬细胞的存在(图9a和b，箭头)，除了缺少任何可识别的视网膜组织以外。眼睛的切片没有巨噬细胞(图9b)，没有观察到感染的迹象，另外视网膜组织表现正常。另外在损伤位点没有观察到形成血管的迹象。
讨论
以6-10个损伤对15只裸大鼠的左眼的视网膜进行激光凝固。在接下来的一天，对被激光治疗的眼睛注射2μl细胞(5.625x10⁴个细胞/μl)，并且在3个时间点(注射后7、14和28田)接受眼科评价、CFP和FA。
最初的临床观察显示损伤内由于CNV发展的渗漏没有表现出随着时间升高。随后使用FA在损伤上的密度计量学显示是这种情况，从7到28天没有计算到平均荧光素渗漏显著的升高。另外，当用组织切片观察时，在灼伤位点没有观察到血管，表示血管新生被抑制。
实施例3：在CNV的激光诱导啮齿动物模型中优化干细胞治疗
材料和方法
动物
从西澳大利亚的动物资源中心获得20只8-10周龄的雌性CBH-rnu/Arc大鼠用于本研究。同型结合的CBH-rnu/Arc大鼠有很少或者没有毛并且是无胸腺的，具有与小鼠的裸突变相似的生殖障碍。它们的细胞介导的免疫被显著降低或者没有，T-淋巴细胞的功能显著降低，并且它们对于梭状杆菌的感染非常的敏感。
将CBH-rnu/Arc大鼠饲养在处于22℃恒温的铺垫有谷壳、顶部有过滤器的笼子中，12∶12小时的光/暗循环(0800小时的光)。食物和水随意获得。在整个研究过程中监控大鼠的物理状态(举例来说，重量、运动等)。
程序
根据Western Australia大学的实验动物伦理协会的指导条例和视觉与眼科研究协会的声明进行所有的程序。
麻醉和瞳孔扩大
所有的临床照相、玻璃体内注射和激光凝固都是以全身麻醉(其涉及克他命(50mg/kg，Lambert Company，美国)和甲苯噻嗪(6mg/kg，Bayer AG，德国)的混合物的肌肉注射)的大鼠进行的。以2.5％苯肾上腺素(Chauvin Pharmaceuticals Ltd，Romford，Essex)和1％睫状肌松弛剂(Alcon，Belgium)盐部滴液来扩张瞳孔。
细胞的制备
如上面的实施例2中所披露的来制备HMPC
激光凝固
用手持盖片作为接触眼镜.通过Zeiss狭缝灯对每只CBH-rnu/Arc大鼠的左眼进行氪激光辐射(647.lnm，相干辐射系统，CA，USA)。以100μm直径、0.1秒曝光时间和150mW能量的设定，在主要视网膜血管之间围绕着视神经对每只眼睛进行8到13个激光凝固。泡的形成被用作成功破裂Bruch膜的指示。
临床照相
使用带有插入的用于扩大视野的聚光透镜(VoIk Superfield，VoIk Optical，Mentor，OH)的改进的手持小型动物眼底照相机(Genesis；Kowa，东京，日本)来进行彩色眼底照相。在对大鼠腹膜注射100μl的10％荧光素钠溶液之后，使用共聚焦激光扫描检眼镜(Heidelberg Retinal Angiograph；Heidelberg Engineering，Carlsbad，CA).进行荧光素血管造影术。
玻璃体内注射
眼球结膜被切割，使用30-gauge的针来创造暴露巩膜最初的孔。然后将连接到5μl Hamilton注射器的32-gauge的针穿过巩膜中的孔进入到玻璃体腔中。使用微型传递系统控制的针的前进可以直接在操作显微镜下进行观察，当针的顶端达到玻璃体腔，药物被传送。在被撤离之前，针被保留在玻璃体腔内约1分钟，并且施用抗生素药膏(0.5％氯霉素滴剂，Chauvin Pharmaceutical Ltd.)来防止感染。每天观察被注射的眼睛，在注射后前三天施用氯霉素滴剂。
组织学评价
在注射后30天处死大鼠之后，收集器官，固定在Bouin固定剂(眼睛和视神经)或者3.7％甲醛缓冲夜中。器官在磷酸盐缓冲夜中(PBS，pH 7.2-7.4)洗涤三次，在梯度乙醇溶液中脱水，植入古体石蜡中。选择的组织被切片，用用于组织学检查的苏木精和曙红染色(H&E)。为了脉络膜新生血管膜厚度的形态计量学检测，从Profreeze^TM-(Lonza，Basel，瑞士，其包含CDM NAO冷冻培养基，7.5％DMSO和50％αMEM)和注射细胞的眼睛随机选取10个激光损伤。测量穿过这个纺锤形创口的最大垂直子午线作为厚度。
实验设计
物理检测20只CBH-rnu/Arc大鼠并且进行麻醉。在扩大了瞳孔之后，在每只大鼠的左眼进行激光凝固。在激光凝固之后形成泡被用作破裂的Bruch膜的指示。在每个眼睛进行总共8到13个激光凝固，是用彩色眼底照相迅速获取激光凝固分布的图像(1天)。
在激光凝固(0天)之后一天，10个激光凝固了眼睛被玻璃体内注射3μl Profreeze，其余的10个激光凝固了的CBH-rnu/Arc大鼠的眼睛玻璃体内注射3μl HMPC。对被注射的眼睛施用抗生素药膏。在接下来的3天，每天检查大鼠，注射后的前3天每天施用抗生素药膏。
在注射后的7、14和28天，在被治疗的眼睛上进行临床照相(彩色眼底照相和荧光素血管造影)。在注射后30天，通过二氧化碳窒息CBH-rnu/Arc大鼠，分离眼睛和器官。AU眼睛在Bouin固定剂中固定，而器官被放入3.7％甲醛缓冲夜中。然后在乙醇梯度溶液中使组织样品脱水，然后植入到固体石蜡中。选择的组织被切片，并且使用H&E染色。
结果和讨论
研究中使用的CBH-rnu/Arc大鼠的物理状态
CBH-rnu/Arc大鼠是健康的，在研究前和研究过程中处于健康的体重范围内。虽然它们在研究过程经受了不同的程序，但是他们被很好的饲养，并且基于从麻醉中完全恢复过来而正常地活动。一些在肌肉注射德位点有轻微擦伤，但是这不影响他们的活动、饲养和行为。
研究中使用的20只大鼠的眼睛在研究开始的时候是正常。每只大鼠的左眼和右眼是相等的尺寸。它们的瞳孔容易扩大，它们的眼球结膜、角膜、虹膜和晶状体都是正常的。在研究开始的时候，都具有清澈的玻璃体，正常的眼底和没有出血的视网膜脉管系统。
玻璃体在刚激光凝固之后是清澈的，激光凝固点是清楚和非常确定的。在几只眼睛中，偶尔会观察到由于激光凝固的意外布置造成的视网膜血管上的出血。
CBH-rnu/Arc大鼠眼中的Profreeze和细胞的毒性效果的分析
Profreeze和细胞被注射到每只大鼠的激光凝固了的眼睛的玻璃体内。所有的眼睛在刚注射之后是正常的。
在注射后7、14和28天，眼睛的彩色眼底照相和狭缝灯照相显示，除了#10，#24和#25大鼠，Profreeze和细胞的存在没有任何对眼镜的反作用：角膜是正常的，前房和玻璃体都是清澈的。#10和#24大鼠在注射后7天具有玻璃体浑浊，这妨碍了在这个时间点的照相。但是，玻璃体在14和28天又变得清澈。#25大鼠在7天具有前葡萄膜炎，并且在后面的时间点观察到部分白内障。部分白内障最可能是由于在注射过程中对晶状体的意外伤害造成的。由于麻醉相关的白内障使一些眼睛的临床图像不能进行。
为了评价是否Profreeze和细胞在玻璃体内传递后有任何的局部或者全身毒性作用，在注射后30天分离组织和器官。根据尸检报告，在Profreeze和细胞注射的大鼠中观察到了差不多相同频率的组织和器官的病理变化，提示出注射细胞的存在不会因为其自身具有任何的反作用。
Profreeze和细胞的功效分析
使用荧光素血管造影术通过评价荧光素渗漏来计算来量化激光诱导的大鼠CNV模型中新形成的膜。对Profreeze注射组和细胞注射组进行每个时间点的具有荧光素渗漏的激光凝固的百分数比例。
为了计算在激光诱导CNV模型中发展CNV的成功率，只使用具有荧光素血管造影术的眼睛，荧光素血管造影术可以被用于评价在激光凝固7天后的荧光素渗漏。基于这个原因，#24，#16，#19和#25大鼠被排出在这个评价之外。从总共进行的167个激光凝固，122或者73.1％在7天具有荧光素渗漏(表3)。这个比例落在别的研究组报道的范围内(Yanagi等，2002；等.，2004；Zou等，2006)。
表3：给予的激光凝固的总结和在注射后不同时间点上具有荧光素渗漏的激光凝固的数量
#NA：由于麻醉相关的白内障未获得。NA：未获得


在计算随着时间具有荧光素渗漏的激光凝固的比例的变化中，只包括了具有完整的荧光素血管造影术的细胞。在Profreeze注射组中，#16，rat#19，rat#20和#23大鼠被排除，在细胞注射组中，#8，#10和#24大鼠被从这个评价中排除。
在Profreeze注射组中，75％的激光凝固在激光凝固7天后具有荧光素渗漏，并且这在14天上升到80％，在激光凝固后28天降回到75％(图10)。相反，在HMPC注射的眼睛中，76.3％的光凝具有荧光素渗漏，并且这在14天降到65.8％，在激光凝固后28天进一步降到30.3％(图10)。这提示了细胞的存在具有抑制这个模型中新血管化的作用。
从眼睛的H&E染色切片的光学显微镜分析，在所有的Profreeze注射和HMPC注射眼睛中存在焦距的破坏(激光损伤)。这样的损伤由外丛状层或者外核层变薄构成。在外核层发现色素细胞和微血管。还发现视网膜色素上皮层的局部增厚，以及微血管浓度的局部升高。新生血管膜的存在，其作为具有单层或者多层视网膜色素上皮细胞的激光损伤中的纺锤形视网膜下纤维血管创口存在，是明显的，并且可以与光凝的眼睛中的临近的正常结构区别开来(图11)。
进行了10个随即选择的注射了Profreeze(n＝6)和细胞(n＝7)的眼睛的脉络膜新生血管膜的最大厚度的比较。Profreeze注射组的脉络膜新生血管膜的平均厚度是35.1±10.2μm，细胞注射组是16.3±4.7μm(图12)。平均厚度的差异是统计显著性的(p＜0.001，学生T检验)。
因为激光诱导CNV模型中的脉络膜新生血管膜的厚度被用作评价化合物或者分子抗血管发生活性的功效的参数之一(Lai等，2002；Berglin等，2003；Krzystolik等，2002；Ciulla等，2003)，HMPC注射眼睛的脉络膜新生血管膜厚度的降低显示出HMPC具有抑制激光诱导脉络膜新血管化的作用。
所述领域中的一般技术人员会意识到可以对如特异性实施方案中显示的发明进行多种改变和/或改动而不偏离被广泛地披露的本发明的精神和范围。因此，现有的实施方案在所有方面被认为是说明性的而非限制性的。
上面所讨论的所有出版物以其全部内容结合于此作为参考。
本申请要求美国专利第60/830,649和美国专利第60/830,651号的优先权，其全部内容结合于此作为参考。
已经包括在本说明中的文件、行为、材料、装置、物品等等的讨论只是为了提供本发明的环境的目的。不能将其看成是承认任何或者所有这些事件形成了在先技术基础的部分或者它们是本发明相关领域中的普遍的常识，因为它在本申请的每个权利要求的优先权日之前存在。
参考文献
Angiolillo，A.L.et al.(1995)J Exp Med.182：155-162.
Berglin，L. et al.(2003)Invest Ophthalmol Vis Sci 44：403-408.
Bregni，M.et al(1992)Blood 80：1418-1422.Cao，Y.et al(1995)JExp Med.182：2069-2077.
Chen，C.et al(1995)Cancer Res.55：4230-4233.
Ciulla，T.A.et al(2003)Br J Ophthalmol 87：1032-1037.
Clapp，C.et al(1993)Endocrinology.133：1292-1299.
El Bradey，M et al(2004)J Ocw/Pharmacol Ther 20：217-236.Folkman，J.(1971)N EnglJ Med.285：1182-1186.
Good，D.J.et al(1990)Proc Natl Acad Sci USA.87：6624-6628.
Gronthos，S.and Simmons，PJ.(1995)Blood 85：929-940.
Gronthos，S.et al.(2003)J Cell Sci 116：1827-1835.
Gupta，S.K efn/.(1995)Proc Natl Acad Sci USA.92：7799-7803.Kandel，J.et α/.(1991)Cell 66：1095-1104.
Krzystolik，M.G.et al.(2002)Arch Ophthalmol 120：338-346.
Lai，Y.K.et al.(2002)Ge^e Ther 9：804-813.
Maione，T.E.and Sharpe，R.J.(1990)Trends Pharmacol Sci.11：457-461.
Marano，RJ.and Rakoczy P.E.(2005)Clin ExperimentOphthalmol 33：81-89.O′Reilly，M.S.et al(1994)Cell.19：315-328.
O′Reilly，M.S.et al(1997)Cell.88：277-285.
Strieter，R.M.et al(1995)Biophys Biochem Res Commun.210：51-57.
Voest，E.E.et al(1995)JNatl Cancer Inst.87：581-586.
Yanagi，Y.et al.(2002)Invest Ophthalmol Vis Sci 43：3495-3499.Zannettino，A.C.et al(1998)Blood 92：2613-2628.
Zou，Y.et al(2006)J Ocul Pharmacol Ther 22：19-25.