乙肝病毒X蛋白及其编码基因在制备治疗肝癌的药物中的用途.pdf

本发明属于疾病基因治疗领域。涉及乙肝病毒X蛋白基因(HBx)在制备治疗肝癌及肝癌并发症的药物中的用途。本发明的技术方案是提供乙肝病毒X蛋白基因(HBx)及其编码的蛋白在制备治疗肝癌及肝癌并发症的药物中的用途。本发明将将乙肝病毒X蛋白基因重组入腺病毒载体，用于肝癌的治疗的药物。本发明创造性地将本领域一般认为作为病毒启动子的转录激活因子参与了病毒致病的HBx蛋白用于制备治疗肝癌的药物，并通过体内外实验表明具有良好的效果，能很好的治疗肝癌及由肝癌引起的并发症肝腹水，为本领域肝癌的治疗提供了一种新的选择。

权利要求书

乙肝病毒x蛋白及其编码基因在制备治疗肝癌的药物中的用途
技术领域
本发明属于疾病基因治疗领域。涉及乙肝病毒X蛋白基因(HBx)在制备治疗肝癌及肝癌并发症的药物中的用途。
背景技术
肿瘤是严重危害人类健康和人们生命的常见疾病，肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，从发现肝癌发现到死亡时间一般不超过半年，已成为人类主要死因之一。中国是肝癌发病大国，发病率和死亡率占全球45％。肝癌在我国的发病率居癌症的第二位，是第二位的癌症杀手，其恶性程度很高、病情发展很快、治疗难度较大、预后较差。因此，研究治疗肝癌的药物具有重要的意义。随着分子生物学，免疫学、细胞生物的快速发展，以肿瘤免疫治疗、基因治疗为代表的肿瘤生物治疗有望成为继手术治疗、化疗和放疗后肿瘤治疗的新武器。
乙肝病毒是一种嗜肝病毒科，小嗜肝病毒中一各成员，是引起人罹患肝炎的最主要的原因，一旦感染人类，病毒会长期停留在肝组织。肝癌发病与肝炎病毒关系密切。肝炎病毒很多，有甲肝、乙肝、丙肝等等，在我国比较多见的是乙肝，我国乙肝病毒表面抗原阳性(HBsAg)的人群很多。据调查，我国乙肝高发区与肝癌高发区是一致的，而肝癌组织内，也可以发现乙肝病毒，说明肝癌和乙肝病毒关系密切，一般90％～95％肝癌患者的肝炎病毒呈阳性。一般认为，乙肝病毒可以入侵肝细胞的细胞核内，整合到肝细胞的DNA上，导致肝细胞在分裂和复制的时候出现突变，突变以后就变成癌细胞了。但是，乙肝病毒引起肝癌的真正原因和具体过程尚不清楚。乙肝病毒X蛋白(X蛋白或HBx蛋白)是一种多功能蛋白，可能通过作为病毒启动子的转录激活因子参与了病毒致病，被一些学者认为可能是参与了乙肝病毒引起肝癌的因素之一，当前研究也主要集中关注乙肝病毒HBx蛋白基因的致肝癌作用。本领域目前没有乙肝病毒HBx蛋白用于防治慢性肝炎、肝癌及其并发症的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为治疗肝癌的药物的制备提供新的思路。本发明的技术方案提供乙肝病毒X蛋白基因在制备治疗肝癌或其并发症的药物中的用途。
本发明所解决的第二个技术问题是提供了乙肝病毒X蛋白在制备治疗肝癌或其并发症的药物中的用途。
本发明所解决的第三个技术问题是提供了一种治疗肝癌的药物。该治疗肝癌的药物是由是由乙肝病毒X蛋白或装载有乙肝病毒X蛋白基因的表达载体添加药学上可以接受的辅助性成分制备而成。
进一步的，上述表达载体是腺病毒。
更进一步的，上述腺病毒是血清型5的腺病毒。
优选的，上述装载乙肝病毒X蛋白基因的表达载体由下列步骤制备而成：
a、利用酶切位点将乙肝病毒X蛋白编码基因连接入入门载体；
b、再利用基因同位重组原理，将含有X蛋白基因的入门载体与包含腺病毒基因组的载体在重组酶的作用下进行体外的同位重组，构建含有目的基因和腺病毒基因组的重组质粒；
c、将含有目的基因和腺病毒基因组的重组质粒经Pac I线性化后转染293细胞，包装成为含有目的基因的重组腺病毒；
d、利用整合了Ad5 DNA片段E1区的人胚胎肾细胞293包装重组腺病毒；
e、收集纯化重组腺病毒，添加辅料，分装，即得。
其中，上述乙肝病毒X蛋白基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
其中，上述乙肝病毒X蛋白具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
本发明内容的一种具体实现方式如下：
乙肝病毒HBx蛋白基因经过PCR扩增后，发现由465个核苷酸组成，由154个氨基酸编码。
乙肝病毒HBx蛋白基因的核苷酸序列如下(SEQ ID NO.1)：
ATGGCTGCTAGGCTGTGCTGCCAACTGGATCCTGCGCGGGACGTCCTTTGTTTACGTCCCGTCGGCGCTGAATCCTGCGGACGACCCTTCTCGGGGTCGCTTGGGACTCTCTCGTCCCCTTCTCCGTCTGCCGTTCCGACCGACCACGGGGCGCACCTCTCTTTACGCGGACTCCCCGTCTGTGCCTTCTCATCTGCCGGACCGTGTGCACTTCGCTTCACCTCTGCACGTCGCATGGAGACCACCGTGAACGCCCACCAAATATTGCCCAAGGTCTTACATAAGAGGACTCTTGGACTCTCAGCAATGTCAACGACCGACCTTGAGGCATACTTCAAAGACTGTTTGTTTAAAGACTGGGAGGAGTTGGGGGAGGAGATTAGGTTAAAGGTCTTTGTACTAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGGTCTGCGCACCAGCACCATGCAACTTTTTCACCTCTGCCTAA
乙肝病毒HBx蛋白基因编码的氨基酸序列如下(SEQ ID NO.2)：
MAARLCCQLDPARDVLCLRPVGAESCGRPFSGSLGTLSSPSPSAVPTDHGAHLSLRGLPVCAFSSAGPCALRFTSARRME
TTVNAHQILPKVLHKRTLGLSAMSTTDLEAYFKDCLFKDWEELGEEIRLKVFVLGGCRHKLVCAPAPCNFFTSA
采用Gateway技术利用Nco1和Xho1酶切位点将上述X蛋白基因连接入入门载体。再利用基因同位重组的原理，将含有HBx蛋白基因入门载体与包含腺病毒基因组的载体在重组酶的作用下进行体外的同位重组，构建含有目的基因和腺病毒基因组(E1，E3缺失)的重组质粒。将含有目的基因和腺病毒基因组(E1，E3缺失)的重组质粒经Pac I线性化后转染整合了Ad5DNA片段E1区人胚胎肾293细胞，包装成为含有目的基因重组腺病毒(Ad—X)。
本发明的有益效果在于：创造性地将本领域一般认为作为病毒启动子的转录激活因子参与了病毒致病的HBx蛋白用于制备治疗肝癌的药物，并通过体内外实验表明具有良好的效果，能很好的治疗肝癌及由肝癌引起的并发症肝腹水，为本领域肝癌的治疗提供了一种新的选择。
附图说明
图1 简要构建技术路线。
图2 X蛋白基因的凝胶电泳图谱。
图3 表达载体X蛋白体外表达的验证。
3-A.Western-blot鉴定AD-HBX感染细胞后目的基因的表达：1.AD-LacZ感染Hepa细胞；2.AD-HBX感染Hepa细胞；
3-B.RT-PCR鉴定AD-HBX感染细胞后目的基因的表达：1.AD-LacZ感染Hepa细胞；2、3.AD-HBX感染Hepa细胞。
图4 21天的的小鼠成瘤率。
图5 36天的的小鼠成瘤率。
图6 小鼠肿瘤生长曲线1。
图7 小鼠肿瘤生长曲线2。
图8 小鼠肿瘤生长曲线3。
图9 小鼠生存曲线1。
图10 小鼠生存曲线2。
图11 小鼠生存曲线3。
图12 HBx抑制Hepa1-6细胞的增值。
图13 HBx抑制HepG2细胞的增值。
图14 Ad-HB抑制Hepa1-6和HepG2细胞的平板克隆形成能力。
图15 Ad-HBx抑制Hepa1-6和HepG2细胞的体外成瘤能力。
图16 Ad-HBx诱导Hepa1-6和HepG2细胞G2/M期阻滞。
图17 Ad-HBx抑制动物模型肿瘤生长。
图18 Ad-HBx延长荷瘤小鼠的生存时间。
图19 HBx对腹膜通透性的抑制作用。
图20 HBx对H22诱导的恶性腹水的抑制作用。
图21 腹水中肿瘤细胞红细胞计数。
具体实施方式
以下结合附图通过对具体实施方式的描述以详细说明但不限制本发明。
具体而言
实施例一 重组腺病毒Ad-X的制备
构建过程的简要技术路线见图1。主要包括以下步骤
a、采用Gateway技术利用Nco1和Xho1酶切位点将乙肝病毒X蛋白基因连接进入门载体；
b、再利用基因同位重组的原理，将含有X蛋白基因的入门载体与包含腺病毒基因组的载体在重组酶的作用下进行体外的同位重组(请核实同位重组这种说法)，构建含有目的基因和腺病毒基因组(E1，E3缺失)的重组质粒；
c、将含有目的基因和腺病毒基因组(E1，E3缺失)的重组质粒经Pac I线性化后转染293细胞，包装成为含有目的基因的重组腺病毒(Ad—X)；
d、利用整合了Ad5 DNA片段E1区的人胚胎肾细胞293包装重组腺病毒；
e、收集纯化重组腺病毒，添加辅料，分装，即得。
1、克隆的构建和鉴定
重组腺病毒的构建过程按Gateway试剂盒——AdenoVator Vector Systems的说明书进行。
2、X基因的扩增及克隆的构建
2.1 X基因的扩增
2.1.1 引物设计
根据X基因序列(见图5)设计并合成PCR引物，
上游引物(SEQ ID NO.3)：
5TTAACCATGGCTGCTAGGCTGTGCTGC3
NCO1酶切位点
下游引物(SEQ ID NO.4)：
5GGCTCGAGTTAGGCAGAGGTGAAAAAGTTG3
XhO1 酶切位点
2.1.2 X基因的扩增
使用TaKaRa公司的Taq DNA聚合酶扩增X cDNA片段，
按照说明进行操作，PCR反应条件如下：
DdH₂O                63μl
10×扩增缓冲液       10μl
50mM MgCL            5μl
2.5mM dNTP           2μl
上游引物(10μM)       2μl
下游引物(10μM)       2μl
模板cDNA(~1ng)       1μl
Taq DNA polymerase(1U/μl) 1μl
PCR反应混合物在94℃变性5分钟后，按下列条件进行反应：
94℃变性30秒；50℃退火45秒；72℃延伸60秒。反应30个循环。然后72℃再延伸10分钟。
1％Agarose电泳检测PCR产物大小。
2.1.3 X基因的回收和纯化
PCR产物用NCO1和Xho1双酶切，37℃作用2小时，1％ Agarose电泳后，使用Promega公司试剂盒，按照产品说明书的方法回收PCR片段；
X基因片段大小为465bp。
2.2 扩增入门载体——pENTR^TM11
2.2.1 入门载体的细菌培养
将本实验室保存的入门载体——pENTR^TM11的E.Coli接种于含有Kanamycin LB液体培养基中，37℃摇动培养过夜。
2.2.2 入门载体提取
以Omega试剂公司的质粒提取试剂盒(Promega.E.N.N.A.Plasmid Miniprep KitD6942)提取质粒。
1％ Agarose电泳检测质粒载体出现线型、开环、超螺旋结构的三条带。
2.2.3 入门载体的酶切分析
以NCO1酶切入门载体，以确定入门载体大小是正确。
NCO1               1μl
10X K Buffer       2μl
0.1％ BSA          2μl
Plasmid DNA        5μl
DW                 10μl
Total volume       20μl
37℃作用1小时，1％ Agarose电泳检测质粒大小。
出现2.7Kb一条带。
2.2.4 入门载体经NCO1和Xho1双酶切，37℃作用2小时，1％ Agarose电泳后，使用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver 2.0按试剂盒的方法回收载体片段；
2.2.5 X基因与入门载体的连接
将回收的X基因片段和载体的片段按一定比例，在T4DNA连接酶连接，16℃温育过夜连接。转染Top10细胞。
X基因片段      0.68μl
pENT11         5μl
Ligation Sol   5.68μl
轻轻混匀上述反应体系后，置16℃连接过夜。
2.2.6 转化大肠杆菌Top 10感受态细胞
连接混合物1～3μl加入至100～200μl感受态细胞中，在冰上冷却10分钟，42℃热休克90秒，再冰上放置2分钟，加SOC培养基400～700μl，37℃培养45分钟后图布于平版LB-Kanamycine⁺，结果出现了克隆。
2.2.7 重组单克隆鉴定
2.2.7.1 酶切分析
10X Buffer     2μl
10％BSA    0.2μl
DNA        5μl
NCO1       1μl
DW to      20μl
37℃作用2小时，1％ Agarose电泳后，出现了与理想的片段大小一致。
2.2.7.2 PCR特异性条带的扩增
采用X基因特异性引物进行PCR扩增，结果扩增出了465bp的片段。
2.2.7.3 X基因的序列测定
酶切验证重组成功的阳性克隆送上海博亚生物技术有限公司自动测序仪(ABI PRISM3730 DNA sequencer)测序。获得了与预测的序列完全相同的片段。
3.包含腺病毒基因组的重组质粒的构建
将含有腺病毒基因组(E1，E3缺失)目的质粒(Amp^R)转化入BD.3.1感受态细胞，制备目的载体。
3.1 目的载体的鉴别
3.1.1 酶切
以BamH1单酶切，切出了大小分别为19000bp，14000bp，1900bp，465bp四个条带。
10x Buffer        2μl
DNA               5μl
BamHI             1μl
DW                12μl
Total volume      20μl
37℃作用2小时，0.8％琼脂糖电泳。
3.1.2 PCR检测，确认为目标产物。
4.表达载体的构建
4.1 采取同位重组的方法，利用Invitrogene公司的Gateway技术将入门载体和目的载体在重组酶的作用下进行体外的同位重组，获得含有腺病毒基因组(E1，E3缺失)的环状质粒pAdenoVator ΔE1E3，筛选重组子——pAd-F或pAd-P或pAd-FP，再进行鉴定。
Entry Clone          10μl
Destination Vector   2μl
5XLR clonase buffer    4μl
TE Buffer pH 8.0      to 16μl
LR clonase^TM enzyme    4μl
轻轻混匀上述反应体系后，置25℃作用过夜。
加蛋白酶K2μl，37℃作用10分钟，转化DH5α感受态细胞。
4.2 表达质粒转化DH5a感受态细胞
将同位重组连接混合物1μl加入50μl的感受态DH5a细胞中，轻轻混匀后，冰上放置30分钟，在42℃热休克30秒，再冰上放置2分钟，加入450SOC(Amp—)培养基，37℃摇动培养1小时。取20μl涂布LB(Amp^r)，37℃培养过夜，出现了菌落。
4.3 筛选重组克隆pAd-X
4.3.1 检查平版上的克隆，对照组没有克隆生长，重组平板上长出了克隆。
4.3.2 挑取2个较小的克隆接种于5ml LB，振摇培养16-18小时；
4.3.3 立即抽提质粒，0.7％ Agarose电泳检查质粒的大小；
4.3.4 以X蛋白基因进行特异引物进行PCR扩增，检查是否有465bp的特异性条带扩增出来。
将提取的质粒用于PCR扩增，以鉴别是否重组成功。

4.3.5 将筛选到的重组子分别转化DH5α感受态细胞，大量扩增并制备重组质粒。
6.重组质粒——pAd-X转染293细胞，筛选重组腺病毒Ad-X
6.1 脂质体转染293细胞
按照试剂盒方法进行。转染后细胞置于孵箱，37℃，5％CO₂培养，5～10天，直至所有细胞出现CPE。收获细胞及其上清，-20℃/37℃反复冻融三次，离心去细胞碎片，上清即为病毒种子液，保存于-80℃。
6.2 单克隆重组腺病毒的筛选——重组腺病毒空斑的形成
1)将消化后的293接种6孔板，置于孵箱，37℃，5％CO₂培养；
2)待细胞贴壁后，将6.1制备的病毒种子液用DMEM做5个稀释度：1:10^-3、1:10^-4、1:10^-5、1:10^-6、1:10^-7，将6孔板中细胞，每孔加入1ml的病毒稀释液，同时设立阴性对照孔，只加入1ml DMEM2％，置于孵箱，37℃，5％CO₂培养1小时；
3)1小时后，在单层细胞上均匀覆盖一层5ml1.25％ agarose/DMEM5％，置于孵箱，37℃，5％CO₂培养直至空斑形成；
4)其中每隔4-5天，再在细胞及琼脂表面覆盖一层1.5ml1.25％ agarose/DMEM5％以提供细胞生长的营养物质；
5)大约在第7天形成在显微镜下可见的空斑，第10天就可形成在显微镜下非常明显的空斑及从培养皿底部看过去得到肉眼可见的白色点状，第14天就可挑取空斑。
6.3 小规模扩增重组腺病毒
1)在培养皿上各选择6个边界清晰，做好标记；
2)无菌条件下，挑取空斑，转移至24孔板，每孔加入0.5ml DMEM5％；
3)37℃放置24小时以使病毒颗粒从琼脂中释放出来；
4)同时，接种293细胞于24孔板；
5)第二天，移去培养基，小心加入100μl的病毒液，轻轻在单层细胞表面混匀，置于孵箱，37℃，5％CO₂培养90分钟；
6)加入DMEM 5％补足1ml，轻轻混匀；
7)将24孔板置于孵箱，37℃，5％CO₂培养直至完全CPE出现；
8)当细胞达到完全CPE时，收获细胞及其上清，-20℃/37℃反复冻融三次，离心去细胞碎片，上清即为病毒种子液，保存于-80℃。
6.4 大规模培养HBx重组腺病毒
利用生物反应器进行病毒规模化培养，收获病毒液和细胞。细胞经三次反复冻融后，离心，收集上清进行病毒纯化。
病毒纯化工艺为：病毒液—经过0.8/0.45μm过滤—300kD超滤—阴离子交换一步柱层析—300kD超滤/脱盐浓缩—过滤除菌—病毒原液。
6.5 获得的X蛋白基因和蛋白的验证
6.5.1 X蛋白基因的苷酸序列(SEQ ID NO.1)：由465个核苷酸组成，编码154个氨基酸的蛋白质(SEQ ID NO.2)。
6.5.2 表达载体中X蛋白基因的验证
回收目标蛋白带，用于基因序列测定(见图2)，结果证明该目标蛋白由465个核苷酸组成，由154个氨基酸编码，核苷酸和氨基酸序列也与报道一致。
6.5.3 X蛋白体外表达的验证见图3，结果表明有X蛋白表达。
因为腺病毒具有宿主范围广，可以感染非分裂和分裂时期的细胞；感染效率高，可得到高滴度的腺病毒(10¹²pfu/ml)；插入的外源基因片段可以达到7.5kb，可介导外源基因瞬时高表达；复制过程中不整合到宿主细胞染色体中，无插入突变的危险；易于操作等生物学特性，所以，本发明选用复制缺陷型的血清5型腺病毒作为基因治疗的载体，创新性利用HBx作为乙肝病毒的一种抗原物质，开发治疗肝癌的药物。
本发明利用Gateway技术，将HBx蛋白基因连接到入门载体，再将带有目的基因的入门载体与带有腺病毒基因信息的目的载体进行体外重组，选用带有包装腺病毒的293细胞包装完整的重组腺病毒。通过CsCL密度梯度离心和柱层析纯化，获得质量较好的纯化病毒，并对病毒质量按照《人基因治疗及制剂质量控制原则》进行了病毒的各项质量控制。
通过蚀斑筛选和PCR鉴定本发明得到的重组腺病毒为复制缺陷型，未含有具复制活性的腺病毒(Replication competent adenovirus，RCA)。然后用RT-PCR和Western blot方法对Ad-HBx的体外表达进行了研究。利用筛选出的病毒进行肝癌的治疗，并对其作用机理进行研究。
实施例二 本发明X蛋白重组腺病毒的功效实验
所用的主要仪器设备：
1)PCR仪：Hybaid公司，型号：PxE。
2)恒温摇床：Forma公司，型号：4580。
3)凝胶成像系统：Bio-Rad公司，型号：Fluor-S。
4)电穿孔仪：Bio-Rad公司，型号：Gene Pulser Xcell。
5)生物安全柜：Forma公司，型号：A/B3。
6)CO2孵箱：Forma公司，型号：3111。
7)液氮罐：Forma公司，型号：8031。
8)倒置相差显微镜：Olympus公司，型号：CK40。
9)倒置相差显微镜：Nikon公司，型号：TE2000U。
10)冷冻高速离心机：Beckman公司，型号：J25。
11)冷冻超速离心机：Beckman公司，型号：Optima L-100XP。
12)超低温冰箱：SANYO公司，型号：MDF-382E。
13)紫外分光光度仪：Bio-Rad公司，型号：SmartSpec 3000。
14)酶标仪：Bio-Rad公司，型号：550。
15)核酸水平电泳系统：Bio-Rad公司。
16)蛋白垂直电泳系统：Bio-Rad公司，型号：Mini PROTEIN 3。
17)纯水仪：Millipore公司，型号：EASYpure UF 07412。
1、X蛋白重组腺病毒的对小鼠肝癌的成瘤性的影响
将小鼠(C57)接种小鼠肝癌细胞后，以HBx蛋白重组腺病毒分别对小鼠进行治疗。不同时间的小鼠成瘤率见图4、图5。不同时间的小鼠肿瘤生长曲线见图6、图7及图8，不同时间的小鼠生存曲线见图9、图10及图11。
2、X蛋白重组腺病毒对肝癌荷瘤小鼠的治疗
(1).细胞增殖活力检测
MTT：1.0×10⁴个Hepa1-6和HepaG2细胞接种到96孔板过夜贴壁后用Ad-HBx或Ad-null(MOI＝30，50and100)感染，4h后弃病毒，感染72h后加入MTT孵育4小时，加入DMSO，酶标仪检测570nm波长处吸光值。
MTT结果表明HBx能够抑制Hepa1-6(图12)和HepG2(图13)细胞的增值(P<0.01)，抑制率为15％～35％。
平板克隆实验：Hepa1-6和HepaG2细胞接种到6孔板，待长至～95％融合时用Ad-HBx或Ad-null(MOI＝30)感染，4h后将细胞消化、重悬，分别按2,000个/孔和1,000个/孔接种于6孔板。10天后，4％多聚甲醛固定染色，光镜下计克隆数(>50个细胞为一克隆)。
Ad-HBx能够明显抑制Hepa1-6和HepG2细胞的平板克隆形成能力(P<0.01)(图14)。
(2)软琼脂克隆形成实验(体外成瘤)
6孔板中铺2.0mL0.5％下层琼脂糖培养基，5×10³个Hepa1-6，HepaG2细胞或Ad-null或Ad-HBx感染的Hepa1-6，HepaG2细胞重悬在1mL0.375％上层琼脂糖培养基中，铺于下层培养基之上。37℃，5％ CO₂培养2周后，体视显微镜下计克隆数(>100细胞为一个克隆)。
Ad-HBx能够明显抑制Hepa1-6和HepG2细胞的体外成瘤能力(P<0.01)(图15)。
(3)流式细胞术分析
2.0×10⁵and5.0×10⁵个HepG2或Hepa1-6细胞接种于6孔板过夜贴壁后用Ad-HBx或Ad-null(MOI＝30)感染。72h后收集细胞，加PI染色后上流式细胞仪分析细胞周期和凋亡。
Ad-HBx能够明显诱导Hepa1-6和HepG2细胞G2/M期阻滞(P<0.01)(图16)。
(4).细胞形态学观察
Ad-HBx或Ad-null(MOI＝30)感染72h后的HepG2或Hepa1-6细胞用4％多聚甲醛固定和PI染色后，倒置荧光显微镜下观察细胞形态和细胞核的形态。
Ad-HBx能够明显诱导细胞变圆和细胞体积增大，细胞核呈巨大核和多核。
(5).体内动物实验
1.5×10⁶个Hepa1-6细胞接种于6—8周龄C57小鼠皮下，接种6天后待形成皮下瘤后，随机分成三组并给予瘤内注射治疗，每3天1次，共4次：
①生理盐水组(n＝8，100μl/只，瘤内注射)
②空病毒Ad-null对照组(n＝7，2×10⁸pfu/100μl/只，瘤内注射)
③Ad-HBx治疗组(n＝8，2×10⁸pfu/100μl/只，瘤内注射)
观察小鼠肿瘤体积和荷瘤小鼠生存时间。
动物实验结果表明Ad-HBx能够抑制肿瘤生长(图17)，并且显著延长荷瘤小鼠的生存时间(图18)。
(6).组织学分析
治疗结束后3天将小鼠处死，剥离肿瘤组织固定、包埋、切片行H&E和CD31免疫组织化学染色。
组织学分析表明Ad-HBx在体内不经能够直接杀伤肿瘤细胞，还能够诱导淋巴细胞浸润及肿瘤新生血管形成，从而抑制肿瘤生长。
实施例三 本发明X蛋白重组腺病毒抗肝癌腹水的治疗作用实验研究
1.方法
1.1 鼠肝癌细胞株(H22)的培养取保存于液氮中的小鼠肝癌H22细胞，37℃复苏，含10％胎牛血清的1640培养基37℃，5％CO₂的孵箱中培养。待细胞长满后，收集细胞，无血清1640培养基洗涤细胞，细胞计数，取1×10⁷个H22细胞接种于小鼠腹腔中，腹腔传代3次。
1.2 腹水模型的建立抽取适量腹水，细胞计数，用生理盐水稀释腹水浓度为2.5×10⁶/ml，每只小鼠腹腔内接种细胞5×10⁵/个。
1.3 恶性腹水的治疗接种三天有腹水形成后，将小鼠随机分组，每组7只。第一组为AD-HBX治疗组；每三天腹腔注射3×108pfu重组HBx腺病毒，共3次.
1.4 腹膜渗透性的观察治疗结束后第3天每组随机取5只从小鼠的尾静脉注射0.2mlEvan蓝(5g/L)，2h后处死小鼠并收集腹水，将腹水离心后用酶标仪检测Evan蓝的浓度，检测波长为540nm，从而分析腹膜渗透性。
1.5 细胞计数腹水涂片同时处死其他小鼠。收集、计量腹水，并计数腹水中红细胞、肿瘤细胞。取少量腹水，涂片，室温放置5min，瑞氏染液染色1min，自来水冲洗，晾干，封片。
1.6 流式细胞术检测肿瘤细胞周期和凋亡每组小鼠收集等体积腹水，3000r/m，离心3min，PBS洗涤细胞三次，制成单细胞悬液，每个样本细胞总数为1×10⁶再加入碘化丙锭(PI)避光染色30min，采用美国BD公司FACSort型流式细胞仪检测细胞周期分布情况。
1.7 统计学方法各组测定数据间的显著性检验采用t检验。
2 实验结果
2.1 对腹膜渗透性的影响
结果显示重组人HBx腺病毒治疗组小鼠的Evan蓝OD值明显低于空载组及生理盐水对照组(P<0.05)，见图19。从图上我们可以看出，Ad-HBx明显延缓了肿瘤细胞对腹膜的侵犯，显示了Ad-HBx对肿瘤细胞的恶性增殖的抑制作用。
2.2 对腹水的抑制作用
治疗结束后第三天将全部小鼠处死，量取各组小鼠腹水总量，求平均值，见图20.结果显示重组人HBx腺病毒处理组与腺病毒空载组及生理盐水对照组相比，小鼠的腹水量均受到明显的抑制(P<0.05)。
2.3 细胞计数及肿瘤细胞计数
将各组小鼠腹水细胞分别集中，5000r/m，离心10min，生理盐水洗涤并稀释合适浓度，细胞计数。结果显示重组人HBx腺病毒处理组小鼠腹水中的红细胞及肿瘤细胞明显少于空载组及生理盐水对照组(P<0.05)，见图21。根据前面所得的结果，不难看出HBx首先抑制肿瘤细胞的恶性增殖，遏制其对腹膜的侵犯，最终延缓血性腹水的发生。
2.6 腹水涂片观察肿瘤细胞和红细胞
HBx处理组的肿瘤细胞可见较多类似于凋亡的细胞，而仅有少量红细胞存在；而在对照组可见正在分裂的肿瘤细胞，且有大量红细胞的存在，进一步证实了HBx抑制肿瘤细胞，进而延缓对腹膜的侵犯的结论。
2.7 腹水中肿瘤细胞的凋亡及细胞周期改变的测定
细胞流式结果表明，重组人HBx腺病毒治疗组肿瘤细胞较空载腺病毒及生理盐水组有明显的G2/M期阻滞，并未见明显的细胞凋亡。
HBx重组腺病毒用于治疗小鼠肝癌作用研究，主要观察了HBx对小鼠成瘤性的影响。首先将转化有HBx基因的小鼠肝癌细胞(Hepa1-6)皮下接种小鼠，设立转化有空腺病毒小鼠肝癌细胞以及没有转化任何基因的正常的肝癌细胞。再分别以Ad—HBx、Ad—null、PBS分别对小鼠进行治疗。通过观察小鼠形成肿瘤早迟、肿瘤生长大小、小鼠的生存期等方面指标，对HBx重组腺病毒的抗肿瘤活性进行研究。采集HBx重组腺病毒免疫小鼠的脾组织，分离淋巴细胞，测定小鼠特异性的T淋巴细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤作用以及参与治疗肝癌的主要的一些细胞因子进行了研究。
结果发现HBx对小鼠成瘤性有显著的抑制作用，实验组小鼠肿瘤形成迟，接种肿瘤细胞后21天时，80％小鼠没有肿瘤，对照组却有100％小鼠形成了肿瘤；实验组少数部分小鼠在中后期长出了肿瘤，但是，肿瘤生长速度较对照组小鼠肿瘤生长慢、体积小；实验组小鼠生存期比对照组小鼠生存期长。免疫小鼠T淋巴细胞对肝肿瘤细胞具有明显的特异性的杀伤作用，其中CD8+T淋巴细胞主要参与了HBx重组腺病毒诱导的对肿瘤细胞的杀伤作用。IFN-γ，IL-2等细胞因子参与了HBx抗肿瘤活性的作用。本研究表明HBx重组腺病毒具有良好的杀伤肿瘤细胞的作用。结果表明HBx在制备治疗肝癌的生物基因药物上前景很大。
另外，还将本发明HBx蛋白重组腺病毒在体外对靶细胞的杀伤作用进行了研究，结果表明HBx对肝癌细胞具有杀伤作用，主要是通过干扰细胞生长周期达到杀伤肿瘤细胞的作用。利用HBx重组腺病毒治疗小鼠肝腹水试验发现HBx对小鼠腹水的治疗作用也很明显。
总之，本发明利用HBx重组腺病毒治疗肝癌及肝癌引起的肝腹水，收到了明显的抑制肿瘤实验结果，为肝癌治疗生物药物的制备提供了新的选择。
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