治疗药物流产后出血的中药组合物及其制备方法 【技术领域】
本发明涉及一种治疗药物流产后出血的中药组合物。
技术背景
药物流产是指孕早期(怀孕七周内)采用以米非司酮为主的流产方法。目前，我国选用药物流产终止早孕的妇女总计已达1亿人次以上{胡景玲.药物流产不全的观察与护理.实用医技杂志，2004，11(6)：957}。与吸宫术相比，药物流产痛苦少，方法简便易行，有高度的可接受性{范慧之.上海市闸北区1992-2001计划生育手术资料分析.中国计划生育学杂志，2003，11(9)：537；杜明昆，应玉娣，郑怀美，等.药流与负压吸宫法的效果与可接受性的研究.生殖与避孕，1996，16(3)：194}。
米非司酮为抗孕激素类药物，其主要功能是作用于子宫内膜，导致胚胎组织坏死。米非司酮联合米索终止早孕为当今世界最成功的抗早孕新技术，在我国已有十余年的应用历史。虽然这一可使妇女免受手术之苦的避孕节育技术已为广大育龄妇女所接受，但其所固有的副作用也逐渐受到关注。临床使用该方法有5-10％的不全流产率{何晓明，张振钧.人工流产对其再次妊娠结局的影响.中国实用妇科与产科杂志，1996，12(5)：287}，阴道出血时间长(平均达2-3周)或出血量过多{经小萍，翁梨驹.米非司酮配伍米索前列醇终止早孕的剂量探讨.中华妇产科杂志，1995，30(1)：38；黄凤华，李遵训，代菊英，等.米非司酮抗早孕对纤维活性的影响.生殖与避孕，2000，20(2)：112；张群瑛，朱广侠，张新娥，等.米非司酮用于早孕药物流产作用的研究进展.国外医学妇幼保健分册，2003，5(14)：318-320}，药物流产后月经失调或不孕症的发生率分别高达60-80％{皮桂菊，胡国杰，潘勤.益母草冲剂、当归丸用于药物流产后腹痛及月经失调的疗效观察.齐鲁护理杂志，2002，8(5)：384；王炎，谈小秀.米非司酮药流与月经失调关系的探讨.华夏医学，1999，12(1)：45}和30-60％{庞柳英，张蕾，颜容仙.145例未产妇药物流产致输卵管阻塞性不孕的研究.现代医院，2005，5(11)：30；陈玉霞.药物流产继发不孕125例分析.中国误诊学杂志，2003，3(6)：916-917；李肖甫，敬明辉，唐新建，等.继发免疫性不孕与终止妊娠方式间的关系.中国免疫学杂志，2004，20(10)：683}，并且可诱发盆腔炎、子宫内膜炎等。这是目前国内外采取药物流产方法所共同面临的难题，很多病人需再次行清宫手术，或加用缩宫素、抗菌素等对症处理，增加了病人痛苦，延长了诊疗时间，花去更多医疗费用，但疗效并不令人满意。随着人们对计划生育优质服务的要求，以及国家对提高民众生殖健康水平需求的不断增强，积极探索和发展一种可用于防治药物流产副作用的安全、有效、简便的治疗方法，已成为避孕节育新技术研究领域中亟待解决的重要科技问题。而中医药在治疗药流后出血时间长、出血量多方面有明显的优势。
1993年上海中医药大学“祛膜汤治疗药流后阴道出血的临床与实验研究”课题组在戴德英教授带领下，开始涉足探索中药防治药流后副作用的研究工作，取得了较好的疗效。根据中医理论及临床经验，药流后出血可归属中医的“胞衣残留”，“恶露不绝”等范畴。药流时蜕膜及胎囊剥离部分遗留宫腔，导致胞衣滞留，瘀血不去，新血不生，同时胞内血脉损伤，而致离经之血外溢，出血不止。故治以祛瘀止血为主，选择蒲黄、益母草为君药，祛瘀生新，收敛止血；当归、桃仁、五灵脂活血化瘀止痛助君以为臣；黄芪益气摄血而为佐使。
祛膜汤经临床多年重复验证，并将服药时间由出现恶露不绝后被动服用到药流孕囊排出后立即服用的用药方法，能主动缩短出血时间，总有效率由87.76％提高到91.89％。临床观察表明祛膜汤能提高完全流产率高达97.1％，有效缩短药流后出血时间，减少出血量并改善全身不适症状。还能有效降低药流后血β-HCG，使药流10天后血β-HCG正常率为76％。前期实验研究发现，祛膜汤的作用机制具有多靶点作用：①兴奋子宫平滑肌，加强子宫收缩；②增强凝血酶的活性而止血；③改变病变子宫血管病理形态；④调节黄体分泌孕酮含量；⑤调整局部细胞因子；⑥影响血管活性物质等。
基于上述研究工作基础，本发明对祛膜汤进行了新药开发研究，争取研制出一种优质高效的治疗药物流产后出血的中药新药，以发挥中医药整体调节方面的优势，为广大育龄妇女带来福音。
【发明内容】
针对祛膜汤存在的服用剂量大、携带不便、不易贮存等缺点，本发明所要解决的技术问题是提出一种优质高效的治疗药物流产后出血的中药组合物。
为了解决上述技术问题，本发明提出的治疗药物流产后出血的中药组合物，由下列重量份的原料药制备而成的药剂：益母草6～7.3份、生蒲黄1.3～2.2份、五灵脂1～2.5份、黄芪1～2.5份、炮姜0.5～1.5份、桃仁0.5～1.5份。
作为优选技术方案，本发明上述治疗药物流产后出血的中药组合物中原料药及其重量份最好为：益母草6.67份、生蒲黄1.67份、五灵脂1.67份、黄芪1.67份、炮姜1份、桃仁1份。
本发明中药组合物可以是任何一种药剂学上所说的剂型，优选颗粒剂。
本发明中药组合物的制备并无特别之处。按重量份称取各原料药，加12倍量水浸泡30分钟，煎煮提取二次，每次1.5小时，滤过，合并2次滤液，浓缩至相对密度为1.05(20℃)，加乙醇至含醇量达到70％，静置12小时，滤过，滤液减压回收乙醇，并浓缩成相对密度为1.10(20℃)。加入适量辅料，喷雾干燥成粉，加适量辅料，干法制成1000g颗粒，分装，5.5克/袋，即得。
后续的试验例将证明，本发明中药组合物具有祛瘀止血之功效，主治：瘀阻胞宫之出血证；药物流产后蜕膜残留，出血不止。本发明重要组合物将祛膜汤开发成祛膜颗粒剂，减小服用剂量，方便携带，增强病人的顺应性，为广大药流患者带来福音。
【附图说明】
图1是制备本发明中药组合物的工艺流程图。
【具体实施方式】
下面结合附图和具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例应理解为仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等效变化和修饰同样落入本发明权利要求书所限定的范围。
实施例1
称取益母草3375g、生蒲黄843.75g、五灵脂843.75g、黄芪843.75g、炮姜506.25g和桃仁506.25g，按照如图1所示的工艺流程制成1000g颗粒(每克颗粒含生药量6.92g)，具体步骤包括：将以上六味原料药投入12倍量水中浸泡30分钟后，煎煮提取二次，每次1.5小时，滤过，合并2次滤液，浓缩至相对密度为1.05(20℃)，加乙醇至含醇量达到70％，静置12小时，滤过，滤液减压回收乙醇，并浓缩成相对密度为1.10(20℃)。加入适量辅料，喷雾干燥成粉，加适量辅料，干法制成1000g颗粒，分装，5.5克/袋，即得(以下称祛膜颗粒)。
实施例2
称取益母草3204g、生蒲黄694.2g、五灵脂534g、黄芪534g、炮姜267g和桃仁267g，按照如图1所示的工艺流程制成1000g颗粒(每克颗粒含生药量5.5g)，具体步骤包括：按照重量份称取原料药，加12倍量水浸泡30分钟，煎煮提取二次，每次1.5小时，滤过，合并2次滤液，浓缩至20℃下的相对密度为1.05；加乙醇至含醇量达到70％，静置12小时，滤过，滤液减压回收乙醇，并浓缩至20℃下的相对密度为1.10；加入适量辅料，喷雾干燥成粉，加适量辅料，干法制成1000g颗粒，分装，5.5克/袋，即得。
实施例3
称取益母草11607g、生蒲黄3498g、五灵脂3975g、黄芪3975g、炮姜2385g和桃仁2385g，按照如图1所示的工艺流程制成1000g颗粒(每克颗粒含生药量11g)，具体步骤包括：将以上六味原料药投入12倍量水中浸泡30分钟后，煎煮提取二次，每次1.5小时，滤过，合并2次滤液，浓缩至20℃下的相对密度为1.05；加乙醇至含醇量达到70％，静置12小时，滤过，滤液减压回收乙醇，并浓缩至20℃下的相对密度为1.10；加入适量辅料，喷雾干燥成粉，加适量辅料，干法制成1000g颗粒，分装，5.5克/袋，即得。
实施例4
称取益母草1050.7g、生蒲黄276.5g、五灵脂276.5g、黄芪276.5g、炮姜158g和桃仁158g，按照如图1所示的工艺流程制成1000g颗粒(每克颗粒含生药量2.2g)，具体步骤包括：将以上六味原料药投入12倍量水中浸泡30分钟后，煎煮提取二次，每次1.5小时，滤过，合并2次滤液，浓缩至相对密度为1.05(20℃)，加乙醇至含醇量达到70％，静置12小时，滤过，滤液减压回收乙醇，并浓缩成相对密度为1.10(20℃)。加入适量辅料，喷雾干燥成粉，加适量辅料，干法制成1000g颗粒，分装，5.5克/袋，即得。
下面结合药效药理试验对本发明作进一步说明。
试验例1(祛膜颗粒对去势SD大鼠动情周期和子宫重量的影响)
去势SD大鼠连续10天灌胃给予祛膜颗粒低、中和高剂量0.55、1.10和2.20g浸膏/kg(分别相当于5.5、11和22g生药/kg)。
去势大鼠模型的制备：54只大鼠，试验前适应性饲养7天。以3％的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，腹位固定，剪开背部皮肤，进行手术，摘除卵巢，缝合伤口。术后i.m给予庆大霉素0.2ml/只，连续3天；术后恢复3天后，每天进行阴道涂片，检查动情周期的变化，连续检查2个周期。选取去势成功的大鼠，将其分为5组，每组10-11只动物，每天灌胃给予祛膜颗粒，以苯甲酸雌二醇(E2)为阳性对照，以蒸馏水为阴性对照。连续给药10天。在给药期间，进行阴道涂片检查，观察各组动物动情周期地变化。
于最后一次给药24小时后，以3％的戊巴比妥钠0.5ml/只腹腔注射麻醉，(1)经腹主动脉取血，1500rpm×15min离心，取血清备用，测定血清雌二醇、孕酮浓度；(2)取血后，将大鼠子宫完整剪下，称重，计算脏器指数，观察各药对子宫重量、子宫水分摄取百分率的影响(3)福尔马林固定子宫，石蜡包埋，切片，进行病理组织学检查及免疫组化法检测雌、孕激素受体。
表1-1祛膜颗粒实验剂量设置
表1-2祛膜颗粒对去势SD大鼠体重(g)的影响
表1-3祛膜颗粒对去势SD大鼠动情周期的影响
*P＜0.05，与去势对照组相比。M-间情期；M-P-E-间情期间可见角化细胞；P-动情前期；E--动情期；
表1-4祛膜颗粒对去势SD大鼠子宫重量、子宫脏器指数以及水分摄取增加百分率的影响
*P＜0.05，与去势对照组相比。
表1-5祛膜颗粒对去势SD大鼠血清雌、孕激素的影响
*P＜0.05，与去势对照组相比。
结果显示：在去势SD大鼠，祛膜颗粒表现出较弱的雌激素样活性，该效应且呈剂量依赖性。
(1)大鼠一般状况良好，未见无明显异常反应，各组间体重增长未见明显差异(P＞0.05)。
(2)子宫活性：祛膜颗粒可使去势SD大鼠阴道涂片出现角化细胞。祛膜颗粒低、中和高剂量组子宫重量、子宫脏器指数、子宫湿重和干重呈增高趋势，低、中剂量组水分摄取增加百分率呈增高趋势；
(3)血清雌、孕激素：低、中和高剂量组血清P含量呈下降趋势，高剂量组间血清E2含量呈升高趋势。
试验例2(祛膜颗粒对米非司酮(Mf)和米索前列醇(Ms)诱导流产SD大鼠的影响)
给予米非司酮-米索前列醇(Mf-Ms)诱导SD大鼠流产，给予祛膜颗粒0.55、1.1和2.2g浸膏/kg(分别相当于生药5.5、11和22g/kg)连续7天。
表2-1剂量设置表
表2-2供试品配制方法
将大鼠♀♂按2∶1比例合笼，次日晨进行阴道涂片检查，以发现有精子为妊娠d1。将妊娠大鼠按体重随机分为6组，分别为正常妊娠对照组、Mf-Ms对照组，阳性药(宫血宁)组、祛膜颗粒低、中和高剂量组。各组均于妊娠d7分别灌胃米非司酮12.5mg/kg(上午9:00～9:30)和米索前列醇0.12mg/kg(下午17:00～17:30)，同时于阴道内置入定量棉球一个(棉球重85～90mg)。次日分别于上午(9:00～9.30)和下午(17:00～17:30)将棉球取出，以保鲜膜包裹，放入塑料袋中密闭冷藏保存，同时置换一个新棉球于阴道内，连续至d14天。
Mf-Ms对照组，阳性对照组、祛膜颗粒低、中和高剂量组分别于妊娠d8-d14天每天上午灌胃给予蒸馏水、宫血宁或祛膜颗粒低、中、高剂量，连续给药7天，末次给药24小时后以3％的戊巴比妥钠0.5ml/只腹腔注射麻醉，(1)经腹主动脉取血，取全血(加抗凝剂)和血清(1500rpm×15min离心)，测定血液学和血液流变学、血清雌二醇、孕酮浓度；(2)取血后，将大鼠子宫完整剪下，福尔马林固定，石蜡包埋，切片，进行病理组织学检查及免疫组化法检测雌、孕激素受体。
出血量测定方法：
用微量血红蛋白吸管大鼠尾静脉采血20цl，加入50g/L NaOH溶液4ml中，混匀待用。将收集的每鼠每天子宫出血棉球分别置于烧杯内，根据出血量的情况加适量50g/L NaOH浸泡挤压搓洗棉球血渍，浸洗后的溶液倒入另一烧杯内保存。再加适量50g/L NaOH浸泡棉球，挤压搓洗血渍，倒入保存容器。根据棉球血渍洗脱情况，决定是否再浸洗1～2次。将先后所有浸提液混匀，记录所用50g/L NaOH总量，取5ml浸提液过滤，分别将(1)已过滤的浸提液4ml、(2)大鼠尾静脉血50g/L NaOH溶液4ml(3)以50g·L-1NaOH为空白对照，在546nm波长记录吸光度(A)值。
计算公式：
V1＝稀释尾静脉血所用50g/L NaOH量(4ml)，
V2＝浸提子宫血所用50g/L NaOH量(ml)。
表2-3祛膜颗粒对米非司酮和米索前列醇诱导流产大鼠子宫出血量的影响
*P＜0.05，与Mf-Ms对照组相比；
表2-4祛膜颗粒对米非司酮和米索前列醇诱导流产大鼠子宫囊胚分级的影响
*P＜0.05，与Mf-Ms对照组相比；Mf---米非司酮；Ms----米索前列醇
表2-5祛膜颗粒对米非司酮和米索前列醇诱导流产大鼠血清雌、孕激素的影响
Mf-Ms：米非司酮(10mg/kg)-米索前列醇(0.1mg/kg)
表2-6祛膜颗粒对米非司酮和米索前列醇诱导流产大鼠血液学和血液流变学的影响
*P＜0.05，与Mf-Ms对照组相比；#P＜0.05，与正常对照组相比。
结果显示：祛膜颗粒可与Mf-Ms协同作用，促进流产大鼠胚囊排出，减少流产大鼠子宫出血量，该效应与缩短凝血时间，增加红细胞数量、纤维蛋白，红细胞压积有关。
(1)大鼠一般状况良好，未见无明显异常反应。
(2)与单独给予Mf-Ms流产组相比，祛膜颗粒组胚囊排出完全，低剂量组1/10只和高剂量2/10只动物子宫内可见绒毛和蜕膜组织残留，中剂量组3/9只子宫内可见绒毛和蜕膜组织残留，
(3)祛膜颗粒低、中和高剂量组V1、FIB、RBC、HGB和HCT升高，PT和TT呈下降趋势，各剂量组对血液流变学指标影响程度不同。
(4)祛膜颗粒对流产大鼠血清E2和P水平影响较复杂：各组血清P含量均呈升高趋势；低和高剂量组E2呈下降趋势，中剂量组血清E2含量呈升高趋势。
试验例3(祛膜颗粒对离体大鼠子宫肌收缩作用的影响)
单独给予祛膜颗粒低、中和高剂量0.02、0.1和0.2mg浸膏/ml(分别相当于生药0.2、1和2mg/ml)或与米非司酮和米索前列醇联合应用。阳性对照品：以缩宫素(Oxy)为阳性对照品，剂量(终浓度)为0.01u/ml。
表3-1剂量设置
表3-2离体实验供试品配制
[试验方法]
(1)祛膜颗粒对妊娠早期大鼠离体大鼠子宫肌条的影响[1，2]：将大鼠♀♂按2∶1比例合笼，次日晨进行阴道涂片检查，以发现有精子为妊娠d1。于妊娠d7天颈椎脱臼法处死大鼠，剖腹取出子宫，立即置于盛有预冷的洛氏液的平皿(将平皿置于冰上)中，期间不断给予O2，剥离附着于子宫壁上的结缔组织和脂肪组织，将子宫剪成等长度的4段离体标本(每侧各2段，均约1cm长)，在每个子宫标本两端接线(呈“+”形)，将子宫一端悬垂于麦氏浴管20ml的支架上，另一端固定于等张杠杆的短臂上。在营养液中连续通入O2和CO2混合气体，营养液温度维持在32±0.5℃，前负荷为1.0g，标本稳定10分钟。
(2)记录正常活动曲线10分钟，并以此为对照。
(3)在浴管中加入待试药，记录10分钟内的肌条收缩反应强度，用新鲜营养液连续冲洗3次，待标本稳定10分钟后，记录正常活动曲线10分钟，给予下一浓度。以缩宫素(终浓度为0.01u/ml)为阳性对照，以给药前为阴性对照。
(4)测定供试品祛膜颗粒在低、中、高3个不同供试浓度下对离体子宫肌条收缩性能的影响，每个浓度下采用8个不同肌条重复实验。
(5)供试品加样顺序：以优化拉丁方方法进行加样，每次实验时，4个标本同时进行。
(6)祛膜颗粒对未孕动情期大鼠离体大鼠子宫肌条的影响：实验前48小时给予皮下注射给予苯甲酸雌二醇2mg/kg-1(0.1ml)人工促使大鼠处于动情期，以提高子宫对药物的敏感性。颈椎脱臼法处死大鼠，剖腹取出子宫，同1法进行实验。
(7)祛膜颗粒对未孕动情期加用米非司酮和米索前列醇大鼠离体大鼠子宫肌条的影响：实验前48小时给予皮下注射给予苯甲酸雌二醇2mg/kg-1(0.1ml)人工促使大鼠处于动情期，同1法进行实验。米非司酮-米索前列醇、祛膜颗粒连续加入，加样间隔1分钟。
表3-3祛膜颗粒对未孕SD大鼠动情期离体子宫肌收缩的影响
*P＜0.05，与给药前相比
表3-4祛膜颗粒对妊娠早期SD大鼠离体子宫肌收缩的影响
*P＜0.05，与给药前相比
表3-5祛膜颗粒与Mf-Ms合用时对未孕SD大鼠动情期离体子宫收缩的影响
*P＜0.05，与给药前相比；#P＜0.05，与Mf-Ms相比。
表3-6祛膜颗粒与Mf-Ms合用时对妊娠早期SD大鼠离体子宫收缩的影响
结果显示：单独应用时，祛膜颗粒可增强未孕和妊娠早期(D7天)离体子宫肌条收缩强度和子宫活动力；与Mf-Ms合用时，祛膜颗粒可与Mf-Ms协同作用，进一步增强子宫收缩强度和活动力。
(1)与给药前相比，祛膜颗粒低、中和高剂量可提高对未孕SD大鼠子宫收缩强度和活动力，其中，中剂量组作用明显(P＜0.05)；
(2)与给药前相比，祛膜颗粒低、中和高剂量均可提高对妊娠早期SD大鼠子宫收缩强度和活动力，其中，中剂量组作用明显(P＜0.05)；
(3)与Mf-Ms相比，给予与Mf-Ms后再给予祛膜颗粒低、中和高剂量可增强未孕SD大鼠子宫收缩强度和活动力。其中，中剂量组作用明显(P＜0.05)。
(4)与Mf-Ms相比，给予与Mf-Ms后再给予祛膜颗粒低、中和高剂量可使妊娠早期SD大鼠子宫收缩强度和活动力呈增强趋势(P＞0.05)。
试验例4(祛膜颗粒对在体大鼠子宫肌收缩作用的影响)
单独给予祛膜颗粒低、中和高剂量0.55、1.1和2.2g浸膏/kg(分别相当于生药5.5、11和22g/kg)或与米非司酮和米索前列醇联合应用。阳性对照品：宫血宁胶囊，人用剂量为：0.13g/粒，1-2粒/次，3次/日，相当于人日用量为0.54-1.08g/人(60kg)，折合大鼠剂量为0.054-0.108g/kg，本实验拟采用剂量为0.1g/kg。
表4-1剂量设置
表4-2供试品配制方法
[试验方法]
1、祛膜颗粒对未孕大鼠子宫压力的影响：实验前48小时给予皮下注射给予苯甲酸雌二醇2mg/kg-1(0.1ml)人工促使大鼠处于动情期。3％戊巴比妥钠麻醉，麻醉后背位固定于手术台上，沿腹中线剪开下腹部，暴露子宫，经子宫角切一小口，将末端带有橡皮球囊的塑料管插入子宫内，自导管缓慢注入生理盐水，使球囊充满液体并排尽其中气体，使球囊紧贴子宫壁，导管另一端通过压力换能器与多导生理记录仪相连，缝合腹壁，灌胃给予祛膜颗粒低、中和高剂量或宫血宁，记录给药前及给药后120分钟内子宫内压力的变化，每个浓度下采用6-8个不同动物重复实验。
2、祛膜颗粒对妊娠早期大鼠子宫压力的影响：采用妊娠D5天大鼠进行实验。将大鼠♀♂按2∶1比例合笼，次日晨进行阴道涂片检查，以发现有精子为妊娠d1。于妊娠d5天3％戊巴比妥钠麻醉，麻醉后背位固定于手术台上，同1法进行实验。
3、祛膜颗粒与Mf-Ms联合应用对未孕大鼠子宫压力的影响：采用妊娠动情期大鼠进行实验。实验前48小时给予皮下注射给予苯甲酸雌二醇2mg/kg-1(0.1ml)人工促使大鼠处于动情期，同1法进行实验。
4、祛膜颗粒与Mf-Ms联合应用对妊娠早期大鼠子宫压力的影响：采用妊娠D5天大鼠进行实验。将大鼠♀♂按2∶1比例合笼，次日晨进行阴道涂片检查，以发现有精子为妊娠d 1。于妊娠d 5天3％戊巴比妥钠麻醉，麻醉后背位固定于手术台上，同1法进行实验。
表4-3祛膜颗粒对未孕SD大鼠动情期在体子宫肌收缩的影响
*P＜0.05，与给药前相比
表4-4祛膜颗粒对妊娠早期SD大鼠在体子宫肌收缩的影响
表4-5祛膜颗粒与Mf-Ms合用时对未孕SD大鼠动情期在体子宫收缩的影响
*P＜0.05，与给药前相比；#P＜0.05，与Mf-Ms相比。
表4-6祛膜颗粒与Mf-Ms合用时对妊娠早期SD大鼠在体子宫收缩的影响
*P＜0.05，与给药前相比；#P＜0.05，与Mf-Ms相比。
结果显示：单独应用时，祛膜颗粒可增强未孕和妊娠早期(D5天)在体子宫收缩强度和子宫活动力；与Mf-Ms合用时，祛膜颗粒可与Mf-Ms协同作用，进一步增强子宫收缩强度和活动力。
(1)与给药前相比，祛膜颗粒低、中和高剂量可提高未孕SD大鼠在体子宫收缩强度和活动力，其中，中剂量组收缩强度和高剂量组活动力增高明显(P＜0.05)。
(2)与给药前相比，祛膜颗粒低、中和高剂量可提高对妊娠早期SD大鼠在体子宫收缩强度和活动力。
(3)与Mf-Ms相比，给予与Mf-Ms后再给予祛膜颗粒低、中和高剂量可使未孕SD大鼠在体子宫收缩强度和活动力呈增强趋势(P＞0.05)。
(4)与Mf-Ms相比，给予与Mf-Ms后再给予祛膜颗粒低、中和高剂量可使妊娠早期SD大鼠子宫收缩强度和活动力呈增强趋势(P＞0.05)。
试验例5(祛膜颗粒对大鼠子宫组织雌、孕激素受体(ER、PR)的影响)
祛膜颗粒对不同状态下子宫组织中ER和PR反应性不同，祛膜颗粒与米非司酮协同作用，使PR表达呈下降趋势。
[试验方法]
1、将前述实验中去势SD大鼠和米非司酮-米索前列醇诱导流产大鼠的子宫组织福尔马林固定子宫，石蜡包埋，切片；
2、切片常规脱蜡之水：切片至二甲苯15min、至二甲苯15min、至无水乙醇5min、至95％乙醇5min、至75％乙醇5min、至水。
3、30％H2O2 1份+蒸馏水10份混合，37℃8min以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。
4、热修复抗原：将0.01M枸橼酸盐缓冲液(PH6.0)微波炉加热至沸腾，取出至不沸腾时将切片浸入，稍冷后再用低火加热使其温度保持在90-99℃间，热修复20min。室温冷却，滴加抗原修复液，37℃5-10min。PBS(PH7.2-7.6)洗涤1-2次，浸泡5min。
5、滴加5％BSA封闭液，37℃20min。甩去多余液体，不洗。
6、滴加稀释100倍的一抗(兔IgG)，每片50μl。37℃1小时或4℃过夜。PBS浸泡5min。
7、滴加生物素化山羊抗兔，37℃20min。PBS浸泡5min。
8、滴加SABC，37℃20min。PBS浸泡5min。
9、DAB显色：使用DAB显色试剂盒(AR1022)。取1ml蒸馏水，加试剂盒中的A，B，C试剂各一滴，混匀后加至切片，每片50μl。室温显色，镜下控制反应时间，一般在5-30min之间。蒸馏水洗涤。
10、封片：切片至75％乙醇2min、至95％乙醇2min、至无水乙醇2min、至二甲苯2min、至二甲苯2min。
PBS替代一抗作为阴性对照。核膜着色为兰色者视为阳性表达。应用Motic显微图象分析系统对染色阳性细胞进行计数，并计算阳性率，与阴性对照相比较。
表5-1祛膜颗粒对未孕大鼠动情期子宫雌、孕激素受体(ER、PR)水平的影响
*P＜0.05，与阳性对照组相比。
表5-2祛膜颗粒对米非司酮和米索前列醇诱导流产大鼠子宫雌、孕激素受体(ER、PR)水平的影响
Mf-米非司酮；Ms-米索前列醇
ER：祛膜颗粒对ER表达影响趋势不明显；
PR：在去势大鼠，祛膜颗粒中和高剂量组PR表达呈升高趋势；与米非司酮-米索前列醇合用时，祛膜颗粒低、中和高剂量可与米非司酮协同作用，使PR表达呈下降趋势。