一种倒提壶提取物及其制备方法和应用.pdf

本发明一种倒提壶提取物，分子式C30H44O8。本发明还提供上述倒提壶提取物的制备方法，步骤为：倒提壶全草干燥粉碎，用水回流；提取液浓缩后用乙醇进行醇沉，滤除沉淀，上清液回收乙醇，再加适量水稀释，分别用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶剂，得到浸膏；浸膏经纯化得到倒提壶提取物。本发明还提供了倒提壶酸的在制药领域中的应用。本发明倒提壶提取物属于新化学实体，属于原始创新；该化合物结构新颖，从构效关系上分析，具有很强的生物学活性；本发明明确了倒提壶中的有效成分，使倒提壶可以被现代药物剂型所利用，进一步促进了传统药的现代化，有着广阔的应用前景。

1.  一种倒提壶提取物，分子式C₃₀H₄₄O₈，结构如式I：


2.  权利要求1所述倒提壶提取物的制备方法，步骤为：
倒提壶全草干燥粉碎，用水回流；提取液浓缩后用乙醇进行醇沉，滤除沉淀，上清液回收乙醇，再加适量水稀释，分别用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取回收溶剂，得到乙酸乙酯部位浸膏和正丁醇部位浸膏；所述两种浸膏经纯化得到倒提壶提取物。

3.  如权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述纯化是：取正丁醇部位浸膏先用D101大孔树脂吸附，再依次用体积百分比10％、30％、50％、70％和90％乙醇进行梯度洗脱；取上述50％乙醇的洗脱液浓缩成正丁醇部位浓缩浸膏；取正丁醇部位浓缩浸膏或乙酸乙酯部位浸膏，以氯仿：甲醇(100:0→100:20)梯度洗脱，洗脱液浓缩得到析出物，所述析出物再经过重结晶。

4.  如权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述醇沉是用乙醇调至质量百分比浓度50～75％进行醇沉。

5.  权利要求1所述倒提壶提取物的在制药中的应用，是应用于制备抗肝损伤药物制剂。

6.  如权利要求5所述的应用，其特征在于所述药物制剂是口服制剂或注射剂。

一种倒提壶提取物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种倒提壶提取物及其制备方法和应用，属于制药技术领域。
背景技术
倒提壶(Cynoglossum amabile Stapf et Drumm)，紫草科琉璃草属植物，多年生草本，分布于我国云南、贵州、广东、广西、新疆等地。其地上部分又叫狗屎花、狗舌花、蓝布裙、蓝花参、小绿连草等，其地下部分异名鸡爪参、狗屎花根、接骨草根等；倒提壶全草入药，其味苦，性凉，有清热利湿，散瘀止血，止咳，镇痛支功效，是我国布依族常用治疗疟疾、肝炎、痢疾、咳嗽、风湿性关节炎、支气管炎、膀胱炎、尿道炎等症的民族药物，但倒提壶草药的有效化学成分至今尚未见有文献报道，因此该草药用于治疗疾病仅停留在直接以植物直接入药的阶段，既不能量化，也不能用其他方式合成，更不适于制备成现代药物的剂型。
发明内容
本发明针对已有技术的不足，目的在于提供一种全新的、能够将倒提壶入药时量化、被现代药物剂型所利用的倒提壶提取物。
本发明的另一目的是提供上述倒提壶提取物的制备方法。
本发明还有一个目的是提供上述倒提壶提取物在制药领域中的应用。
本发明通过以下技术方案实现上述目的：
一种倒提壶提取物，白色，熔点>300℃，分子式C₃₀H₄₄O₈，结构如式I：

本发明还提供上述倒提壶提取物的制备方法，步骤为：
倒提壶全草干燥粉碎，用水回流提取；提取液浓缩后用乙醇进行醇沉，滤除沉淀，上清液回收乙醇，再加适量水稀释，依次用氯仿、乙酸乙酯或正丁醇萃取，回收溶剂，得到乙酸乙酯部位浸膏和正丁醇部位浸膏；所述两种浸膏经纯化得到倒提壶提取物，本发明称之为倒提壶酸，是一种五环三萜化合物。
所述纯化是：取正丁醇部位浸膏，先用D101大孔树脂吸附，再依次用体积百分比10％、30％、50％、70％和90％乙醇进行梯度洗脱；取上述50％乙醇的洗脱液浓缩成正丁醇部位浓缩浸膏；取正丁醇部位浓缩浸膏或乙酸乙酯部位浸膏，以氯仿(A):甲醇(B)(100:0→100:20)梯度洗脱(优选的梯度设置见表1)，洗脱液(优选100:8的洗脱液)经过浓缩得到白色固态析出物，该析出物再经过反复重结晶，得到白色粉末状的目标产物进行反复重结晶，得白色粉末状的目标产物。
表1 洗脱梯度设置

本发明倒提壶酸的提取工艺更具体地可表示为：将倒提壶全草干燥粉碎，用水回流提取3次，每次2-3小时；合并提取液、浓缩，加乙醇调至75％进行醇沉，放置24小时后过滤去除沉淀，上清液回收乙醇至无醇味，加适量水稀释，依次以氯仿、乙酸乙酯、正丁醇梯度萃取，回收溶剂，分别得到乙酸乙酯和正丁醇部位浸膏。得到的正丁醇部位浸膏用D101大孔树脂、上述不同浓度的乙醇进行梯度洗脱，取乙酸乙酯部位浸膏或正丁醇部位经大孔树脂吸附后用50％乙醇洗脱下来的洗脱液，经浓缩后得到的浸膏进行硅胶柱层析，以氯仿-甲醇(100:0→100:20)梯度洗脱，100:8洗脱部位进行反复重结晶，得白色粉末状的目标产物——倒提壶酸。
本发明倒提壶酸的在制药领域中的应用是将倒提壶提取物应用于现代制药，制备成片剂，胶囊，固体分散体，纳米乳及其缓控释制剂。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明倒提壶提取物属于新化学实体，属于原始创新；该化合物是一种新的五环三萜皂苷，结构新颖，从构效关系上分析，该化合物具有3个羧基，理论上比齐墩果酸结构更理想，具很强的生物学活性；本发明明确了倒提壶中的有效成分，使倒提壶可以被现代药物剂型所利用，进一步促进了传统药的现代化，有着广阔的应用前景。
附图说明
图1是实施例1的HMBC谱图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案。
实施例1
倒提壶酸的制备：本实施例所用药材购自中药材市场，由广东药学院中药学院刘基柱老师鉴定。薄层色谱和柱色谱硅胶为青岛海洋化工厂产品，所用试剂为分析纯。
将倒提壶全草10Kg干燥粉碎，用水回流提取3次，每次2-3小时；合并提取液、浓缩，加乙醇调至75％进行醇沉，放置24小时后过滤去除沉淀，上清液回收乙醇至无醇味，加适量水稀释，分别以氯仿、乙酸乙酯、正丁醇梯度萃取，回收溶剂，得浸膏。正丁醇部位浸膏用D101大孔树脂、不同浓度的乙醇进行粗分。取乙酸乙酯部位浸膏40g和正丁醇大孔树脂50％乙醇洗脱部位浸膏8.5g分别进行硅胶柱层析，以氯仿-甲醇(100:0→100:20)梯度洗脱，100:8洗脱部位进行反复重结晶，共得倒提壶酸500mg。
本发明的倒提壶酸结构解析：倒提壶酸，白色粉末，10％硫酸-乙醇110℃下显蓝色，熔点>300℃，HRESI-EI结合¹³CNMR确定化合物的分子式C₃₀H₄₄O₈。
IR谱示有3523(OH)，1702(羧酸C＝O)。¹HNMR和¹³CNMR数据如表2所示：
表2 ¹HNMR和¹³CNMR数据

¹HNMR谱显示5个与季碳相连的角甲基单峰质子信号δ 0.68、0.92、0.96、1.08、1.10，提示可能为三萜类化合物；烯氢δ 5.18和活泼氢信号δ 12.04。¹³CNMR谱和DEPT图谱显示有30个碳信号(结合HSQC谱得知，有一个重叠峰)：5个甲基，9个亚甲基，6个次甲基，10个季碳原子(包括3个羧基季碳原子)。δ 178.29、178.09、177.68为三个羧羰基碳信号，δ 143.69、121.57为一对烯键碳原子信号，这是区分Urs-12-en和olean-12-en类似物的显著特征，该值表明化合物为olean-12-en类似物。确定该化合物为具有olean-12-en基本骨架的三萜。
在EI-MS图谱中，示有脱去HCOOH的m/z486，主要为RDA裂解m/z278，及其脱去-COOH等继续生成的m/z233，m/z219。
HMBC谱显示，角甲基氢信号0.96、1.08分别与两个羧羰基碳相关，确定3个羧基其中的2个是由C4、C20上的角甲基氧化而来。根据这两个角甲基碳信号化学位移值δ0.96(12.5)、δ1.08(27.97)，羧基位置在C23、C30。由HMBC谱相关，确定另一个羧基在C28，HMBC谱图见图1。
HSQC谱验证同碳上的质子连接关系：δ67.10(3.44，1H，brs)，δ79.03(3.51，1H，dd，J＝9.5Hz)，HMBC谱显示H24与C(δ79.03)、H(δ3.51)与C(δ67.10)相关，确定两个羟基连接在C2(δ67.10)、C3(δ79.03)上，由H2的偶合常数确定H2、H3为aa偶合，推断出C2、C3位置上连接的-OH的空间构型为α、β。
根据HMBC谱相关，参考文献^[6]，对¹HNMR和¹³CNMR数据进行了全归属，确定该化合物为2α，3β-齐墩果烷-12-烯-23，28，30-酸(2α，3β-dihydroxyolean-12-en-23，28，30-trioic acid)，命名为倒提壶酸。
实施例2
取昆明种小白鼠60只，称重，随机分为对照组、四氯化碳肝损伤模型组和给药组，每组20只，常规饲养。对照组小鼠和模型组小鼠灌服0.1％吐温80溶液，给药组灌服倒提壶酸20mg/kg(用0.1％吐温80配制成混悬液)，每天1次，连续给药7d后，模型组和给药组一次性均ip 0.1％ CCl₄(用花生油配置，0.1mL/10g)，12h后摘眼球取血，取血清测定相应指标。结果显示，与四氯化碳肝损伤模型组相比，给药组小鼠血清ALT和AST明显下降(p<0.05和p<0.01)，SOD活性升高和MDA显著降低(p<0.05和p<0.01)，说明倒提壶酸对四氯化碳所致的脂质过氧化肝损伤具有一定的保护作用。