一株降解菊酯类农药的芽孢杆菌及其菌剂的生产方法 【技术领域】
本发明属于生物技术领域，涉及一株分离自甘蓝叶际的能高效降解拟除虫菊酯类农药的芽孢杆菌，及其菌剂的生产方法。
技术背景
菊酯类农药是广谱性杀虫剂，具有速效、高效、低毒、低残留，对作物安全等特点，能有效的防治粮油作物和经济作物的害虫。近几年来其使用量越来越大，拟除虫菊酯已经成为传统有机磷农药的替代品之一，但是，菊酯类杀虫剂在茶叶、蔬菜等经济作物上的过高残留，带来了食品安全问题。近些年发现其对水生态系统也有较大危害，如王彦美等(高效氯氟氰菊酯对黄鳝的急性毒性作用，安徽农业科学，2008，36(12)：4999-5000)报道48h时0.0552μg/L的高效氯氟氰菊酯即使黄鳝全部死亡。
国内外对菊酯类农药残留进行了一些研究，主要有农药的使用和残留、降低农残的对策、农药在植物体内和环境中的降解规律、农药降解微生物的研究等。但是，对于如何降低农残的研究仅限于合理使用农药、改进农艺措施、加强管理等，还缺乏直接降低靶标农药残留的有效方法；另外，对农药降解菌的研究多局限于菌株的分离及其生理特性的测定。
刘君寒等(一株氯氰菊酯降解菌的分离和鉴定，南京农业大学学报2007，30(3)：68-72)从氯氰菊酯污染土壤中，分离到一株可降解氯氰菊酯和联苯菊酯铜绿假单胞菌。洪永聪等发表文章(蜡状芽孢杆菌菌株TR2对氯氰菊酯降解作用的小区试验，青岛农业大学学报(自然科学版)2008，24(4)：291-293)指出通过室内盆栽和茶园小区的试验，蜡状芽孢杆菌菌株TR2可有效减少茶园小区氯氰菊酯的残留。
植物的叶际是指植物的地上部分，包括叶、茎、花、果等的表面或内部的小环境。在植物的叶际范围内生活着多种微生物，主要有细菌、真菌、放线菌等，这些在叶际生存的微生物称为叶际微生物。对于叶际微生物而言，植物叶际环境相当恶劣，在强烈的日照下，其表面干燥，温度可以达到40℃～55℃，紫外线强烈，而夜晚温度又骤降，还有刮风、下雨等天气变化等。因此，对于分离自土壤、污泥等来源的微生物，不一定能适应植物叶际的恶劣环境。本专利是从植物叶际分离出的一株菊酯类农药降解菌，能够在植物叶际环境下保持良好的降解性能。目前尚未发现从植物叶际分离出降解菊酯类农药的芽孢杆菌及其菌剂生产方法的文献报道。
【发明内容】
本发明的目的是提供一株分离自甘蓝叶际的能够高效降解菊酯类农药的芽孢杆菌，并提供该菌剂的生产方法。
本发明所提供的生防菌株是由我们实验室从甘蓝的叶面上分离筛选出来的。将其编号为TL-3，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2008年10月13日，分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。保藏编号为：CGMCC No.2698。该菌株的16S rDNA基因序列已经递交到了GenBank数据库，登录号为FJ361191。在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/网站上用blast程序与已登录细菌菌株的16S rDNA基因序列进行比较，结果表明与枯草芽孢杆菌的相似性最高，可以达到99.7％以上。
本发明所述的菌剂的生产方法如下：
1、培养基配制：
1)菌种保藏培养基(固体，1L)：蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠5g，琼脂20g，
加水至1L，pH 7.0-7.5；
2)菌种活化培养基(液体，1L)：蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠5g，加水至1L，pH 7.0-7.5；
3)种子培养基(液体，10L)：MgSO41.0g，KH2PO45.0g，NaCl 5.0g，K2HPO4 15.0g，蔗糖100g，蛋白胨50g，加水至10L，pH 7.0-7.5；
4)发酵培养基(液体，200L)：MgSO4 20g，KH2PO4 100g，NaCl 100g，K2HPO4300g，糖蜜10kg，(NH4)2SO4 1kg，加水至200L，pH 7.0-7.5；
以上培养基均在121℃灭菌20min。
2、菌种活化：挑取菊酯类农药降解菌至菌种保藏培养基，30℃连续划线挑单菌落培养两次后，挑取单菌落在菌种活化培养基中，于30℃，150r/min摇床振荡培养过夜；
3、液体种子制备：向装有高温灭菌的种子培养基的发酵罐中，按照5％-10％的接种量接种菊酯农药降解菌，于25-37℃，通气培养12-24h，得到液体种子。
4、液态发酵：向装有高温灭菌的发酵培养基中，接种菊酯类农药降解菌，于25-37℃，通气培养18-60h，得到活菌体培养物。
5、菌剂制备：培养好的发酵液经细菌计数后，超滤浓缩，调节至1010cell/mL，加入甘氨酸(质量分数0.3％-2％)和甘油(质量分数0.5％-5％)，灌装保藏。使用时用水稀释500-1000倍。
由本发明技术方案生产的菊酯类农药降解菌剂能够有效降解作物表面残留的菊酯类农药。以下通过具体实施例详细说明本发明的实施，目的在于帮助读者更好地理解本发明的精神实质，但不作为对本发明实施范围的限定。
实施例1：菊酯类农药降解菌剂生产
(1)培养基配制：
1)菌种保藏培养基(固体，1L)：蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠5g，琼脂20g，加水至1L，pH 7.2；
2)菌种活化培养基(液体，1L)：蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠5g，加水至1L，pH 7.2；
3)种子培养基(液体，10L)：MgSO4 1.0g，KH2PO4 5.0g，NaCl 5.0g，K2HPO4 15.0g，蔗糖100g，蛋白胨50g，加水至10L，pH 7.2；
4)发酵培养基(液体，200L)：MgSO4 20g，KH2PO4 100g，NaCl 100g，K2HPO4 300g，糖蜜10kg，(NH4)2SO4 1kg，加水至200L，pH 7.2；
以上培养基均在121℃灭菌20min。
2、菌种活化：挑取菊酯类农药降解菌至菌种保藏培养基，30℃连续划线挑单菌落培养两次后，挑取单菌落在菌种活化培养基中，于30℃，150r/min摇床振荡培养过夜；
3、液体种子制备：向装有高温灭菌的种子培养基的发酵罐中，按照5％的接种量接种菊酯农药降解菌，于30℃，通气培养20h，得到液体种子。
4、液态发酵：向装有高温灭菌的发酵培养基中，接种菊酯类农药降解菌，于30℃，通气培养26h，得到活菌体培养物。
5、菌剂制备：培养好的发酵液经细菌计数后，超滤浓缩，调节至1010cell/mL，加入甘氨酸(质量分数0.5％)和甘油(质量分数1.5％)，灌装保藏。
实施例2：菊酯类农药降解菌剂对甘蓝叶面高效氯氰菊酯降解效果
1)选取未经施用高效氯氰菊酯的甘蓝，选取两个地块，各15m2，喷洒施用量为3g/亩；
2)6h后，均匀喷施农药降解菌剂(用清水稀释500倍)，以喷施清水作对照；
3)2d后，五点取样法检测甘蓝叶面高效氯氰菊酯残留，发现处理组较对照组高效氯氰菊酯残留量减少80％左右。
实施例3：菊酯类农药降解菌剂对油菜叶面氟氯氰菊酯降解效果
1)选取未经施用氟氯氰菊酯地油菜，选取两个地块，各15m2，喷洒施用量为1g/亩；
2)6h后，均匀喷施农药降解菌剂(用清水稀释800倍)，以喷施清水作对照；
3)2d后，五点取样法检测油菜叶面氟氯氰菊酯的残留，发现处理组较对照组氟氯氰菊酯残留量减少75％左右。