一株菊酯类农药降解菌及其菌剂制备方法 【技术领域】
本发明涉及一株分离自大叶黄杨叶际的拟除虫菊酯类农药降解菌，及其菌剂制备方法。属于生物技术领域。
技术背景
菊酯类农药是广谱性杀虫剂，具有速效、高效、低毒、低残留，对作物安全等特点，除对140多种害虫防治有特效外，有些菊酯类农药还对地下害虫和螨类害虫有较好的防治效果。中国专利(授权公告号：CN 1063017C)公布了一种爱福丁、拟除虫菊酯(氰戊菊酯，氯氰菊酯)为有效成分的复配杀虫剂，主要用于防治小菜蛾，斜纹夜蛾等农业害虫。中国专利(授权公告号：CN 1242675C)公布了一种用阿维菌素和高效氯氰菊酯作为主要成份，加乳化剂，混合有机溶剂和水配成的杀虫剂组合物，可防治梨木虱，斑潜蝇等害虫。
作为高效、低毒杀虫剂，拟除虫菊酯主要用于防治棉田、菜地、果树和茶叶上的农业害虫以及卫生害虫。近几年来其使用量越来越大，拟除虫菊酯已经成为传统有机磷农药的替代品之一，但是近些年发现其对水生态系统危害较大。如王彦美等(高效氯氟氰菊酯对黄鳝的急性毒性作用，安徽农业科学，2008，36(12)：4999-5000)报道48h时0.0552μg/L的高效氯氟氰菊酯即使黄鳝全部死亡。
国内外对菊酯类农药残留进行了一些研究，主要有农药的使用和残留、降低农残的对策、农药在植物体内和环境中的降解规律、农药降解微生物的研究等。但是，对于如何降低农残地研究仅限于合理使用农药、改进农艺措施、加强管理等，具体措施不够完善，缺乏直接降低靶标农药残留的有效方法；另外，对农药降解菌的研究多局限于菌株的分离及其生理特性的测定。
刘君寒等(一株氯氰菊酯降解菌的分离和鉴定，南京农业大学学报2007，30(3)：68-72)从氯氰菊酯污染土壤中，分离到一株可降解氯氰菊酯和联苯菊酯铜绿假单胞菌。洪永聪等发表文章(蜡状芽孢杆菌菌株TR2对氯氰菊酯降解作用的小区试验，青岛农业大学学报(自然科学版)2008，24(4)：291-293)指出通过室内盆栽和茶园小区的试验，蜡状芽孢杆菌菌株TR2可有效减少茶园小区氯氰菊酯的残留。
目前，尚未发现有文献报道从植物叶际分离出菊酯类农药的降解菌及其菌剂制备方法。
【发明内容】
本发明的目的是提供一株分离自大叶黄杨叶际的菊酯类农药降解菌，及其菌剂制备方法。
本发明所提供的生防菌株是由我们实验室从大叶黄杨的叶面上分离筛选出来的。将其编号为EBL-07，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为二零零八年十月十三日，分类命名为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。保藏编号为：CGMCC No.2699。该菌株具有下列性质：
菌落形态特征及菌体形态特征
在LB固体培养基上菌落呈深褐色、扁平、不规则、边缘锯齿状。在LB液体培养基中为墨绿色，无芽孢，革兰氏染色呈阴性，氧化酶和接触酶皆为阳性，V.P反应为阴性，可水解明胶，能运动。
抗药性测定
菌株对6种抗生素的敏感性测定结果表明：菌株对卡那霉素、氨苄青霉素有抗性，对多粘霉素、氯霉素、四环素、庆大霉素敏感。
16S rDNA基因序列
用27f与1492r为引物进行扩增出的该菌株的16S rDNA基因的部分序列，测序结果递交到GenBank，登录号为EF545556。在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/网站上用blast程序与已登陆细菌菌株的16S rDNA基因序列进行比较，结果表明与多粘类芽孢杆菌的相似性最高，达到99％以上。
本发明所述的菌剂的生产方法如下：
1、培养基配制：a)LB培养基(固体，1L)：蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠5g，琼脂20g，加水至1L，pH 7.0；b)LB培养基(液体，1L)：蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠5g，加水至1L，pH 7.0；c)种子培养基(液体，1L)：MgSO40.10g，KH2PO40.50g，NaCl 0.50g，K2HPO41.50g，蔗糖10g，蛋白胨5g，加水至1L，pH 7.0；d)发酵培养基(液体，1L)：MgSO40.10g，KH2PO40.50g，NaCl 0.50g，K2HPO41.50g，蔗糖10g，玉米浆5g，加水至1L，pH 7.0；以上培养基均在121℃灭菌20min。
2、菌种活化：挑取拟除虫菊酯降解菌至LB固态培养基，28℃连续划线挑单菌落培养两次后，挑取单菌落在LB液态培养基，于28℃，150r/min摇床振荡培养培养过夜；
3、液体种子制备：向高温灭菌的种子培养基中，按照5％-10％的接种量接种拟除虫菊酯降解菌，于25-35℃，200r/min摇床振荡培养12-24h，得到液体种子。
4、液态发酵：向高压灭菌的种子培养基中，接种拟除虫菊酯降解菌，于25-35℃，200r/min摇床振荡培养18-72h。
5、菌剂制备：培养好的发酵液经细菌计数后，调节至108-1010cell/mL，加入甘氨酸(质量分数0.5％)，包装使用。
由本发明技术方案生产的拟除虫菊酯降解菌剂能够有效降解叶片拟除虫菊酯残留。以下通过具体实施例详细说明本发明的实施，目的在于帮助读者更好地理解本发明的精神实质，但不作为对本发明实施范围的限定。
实施例1：拟除虫菊酯降解菌剂制备
1)培养基配制：a)LB培养基(固体，1L)：蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠5g，琼脂20g，加水至1L，pH 7.0；b)LB培养基(液体，1L)：蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠5g，加水至1L，pH 7.0；c)种子培养基(液体，1L)：MgSO40.10g，KH2PO40.50g，NaCl 0.50g，K2HPO41.50g，蔗糖10g，蛋白胨5g，加水至1L，pH 7.0；
d)发酵培养基(液体，1L)：MgSO40.10g，KH2PO40.50g，NaCl 0.50g，K2HPO41.50g，蔗糖10g，玉米浆5g，加水至1L，pH 7.0；以上培养基均在121℃灭菌20min。
2)菌株活化：挑取拟除虫菊酯降解菌至LB固态培养基，28℃连续划线挑单菌落培养两次后，挑取单菌落在LB液态培养基，于28℃，150r/min摇床振荡培养培养过夜；
3)液体种子制备：向高温灭菌的种子培养基中，接种拟除虫菊酯降解菌，于30℃，200r/min摇床振荡培养20h，得到液体种子。
4)液态发酵：向高压灭菌的种子培养基中，接种拟除虫菊酯降解菌，于30℃，200r/min摇床振荡培养24h。
5)培养好的发酵液经细菌计数后，调节至1010cell/mL，加入甘氨酸(质量分数0.5％)，包装使用。
实施例2：拟除虫菊酯降解菌剂对大叶黄杨叶面高效氯氰菊酯降解效果
1)选取未经施用高效氯氰菊酯的大叶黄杨，选取两个地块，各15m2，喷洒施用量为3g/亩；
2)6h后，均匀喷施农药降解菌菌剂100mL(109cfu/mL)，以喷施清水作对照；
3)2d后，五点取样法检测大叶黄杨叶面高效氯氰菊酯残留，发现处理组较对照组高效氯氰菊酯残留量减少76％。
实施例3：拟除虫菊酯降解菌剂对油菜叶面氟氯氰菊酯降解效果
4)选取未经施用氟氯氰菊酯的油菜，选取两个地块，各15m2，喷洒施用量为1g/亩；
5)6h后，均匀喷施农药降解菌菌剂100mL(109cfu/mL)，以喷施清水作对照；
6)2d后，五点取样法检测油菜叶面氟氯氰菊酯的残留，发现处理组较对照组氟氯氰菊酯残留量减少83％。