没食子酸在制备抗 HPV 药物中的应用 【技术领域】
本发明提供了一种没食子酸在制备治疗抗 HPV 药物中的应用。背景技术 人类乳头状瘤病毒 (HPV) 引起的性传染极为普遍， 单是美国就有两千万人染得此 病。HPV( 人乳头瘤病毒 ) 是继 “世纪绝症” 艾滋病后的一种无药可救的性病， 不论男女都有 可能感染 HPV， 女性染病后甚至可引致子宫颈癌。由于 HPV 通过皮肤直接传染， 使用安全套 也无法预防。
全世界有四亿四千万的人口受到 HPV 的感染， 每年至少有五十万的妇女被诊断有 子宫颈癌， 这些大部分发生在开发中的国家。HPV 是引起子宫颈癌与生殖器疣， 俗称 “菜花” 的元凶， 在一百多种的 HPV 类型当中， 已经知道有 37 种靠性接触传染， 能够导致性病。它们 广泛存在于成年人族群， 来无影去无踪， 没有任何症状。第 6 和第 11 类型可以引起男女两 性的生殖器疣。这种疣本身并非癌症， 但是它造成的疼痛和心理创伤非言语所能形容。
但是， 迂回感染了高风险的 HPV 类型就可以导致子宫颈癌、 其它生殖器癌或肛门 癌。这些高风险的类型大约有 19 种之多， 其中以造成子宫颈癌的第 16 和第 18 类型最为常 见。
子宫颈癌是一个感染性疾病， 它是可以预防， 可以治疗、 治愈和消灭的。子宫颈癌 是由于人乳头瘤病毒感染引起的。 如果能够预防 HPV 感染， 就可以说能够预防子宫颈癌 ； 如 果没有 HPV 感染， 可以说不会得宫颈癌。这是已有定论的， 这是在会上得到公认的。这里讲 的宫颈癌， 就是指子宫颈的浸润癌， 简称 CC。一般来讲， 宫颈癌就是浸润癌 ； 其他的癌前病 变， 就叫 CIN， 包括宫颈的原位癌， 把它归在 CIN3 里面。如果是浸润癌， 就叫子宫颈癌了。
没食子酸， IUPAC 命名 ： 3， 4， 5- 三羟基苯甲酸， 五倍子酸， 英文名称 Gallic acid， 别名 3， 4， 5-Trihydroxy benzoic acid ； Gallic acid ； 3， 4， 5-trihydroxy-Benzoic acid ； 3， 4， 5-trihydroxybenzoic acid ； 3， 4， 5-trihydroxy-benzoic acid， 分子式 C7H605 ； 分子 量 170.12 ； 物理性质 ： 针状结晶 ( 无水甲醇或氯仿 )， 熔点 235 ～ 240° ( 分解 )， 其结构简 式如下 ：
属有机酸及酚类， 用于 1. 抗菌抗病毒 ： 体外对金黄色葡萄球菌、 八叠球菌、 α- 型 键球菌、 奈瑟氏球菌、 绿脓杆菌、 弗氏痢疾杆菌、 伤寒杆菌、 副伤寒杆菌 A 等有抑制作用， 体 外， 在 3％的浓度下对 17 种真菌有抑菌作用， 对流感病毒亦有一定抑制作用 ； 2. 抗肿瘤 ： 对 吗啉加亚硝钠所致的小鼠肺腺瘤有强抑制作用。
人类乳突病毒 (Human Papillomavirus， 简称 HPV) 是一种嗜上皮性病毒， 有高度
的特异性， 长期以来， 已知 HPV 可引起人类良性的肿瘤和疣， 如生长在生殖器官附近皮肤和 粘膜上的人类寻常疣、 尖锐湿疣以及生长在粘膜上的乳头状瘤。像乙肝病毒一样， HPV 也是 一种 DNA 病毒。 它原是多瘤空泡病毒科的一员， 1999 年国际病毒分类委员会 (ICTV) 取消多 瘤空泡病毒科， 代之以乳头瘤病毒科， 因此， HPV 便归属此门下。 发明内容 本申请的发明人意外发现， 没食子酸具有抗 HPV 的作用。
因此， 本发明提供没食子酸在制备抗 HPV 药物中的应用。
本发明还提供没食子酸在制备预防或治疗 HPV 相关疾病的药物中的应用。
本发明所述的 HPV 相关疾病包括但不限于子宫颈癌、 其它生殖器癌或肛门癌或生 殖器疣。
本发明所述的没食子酸可以是含没食子酸的鸦胆子的水提液。
本发明所述的没食子酸可以按如下方法制备 ：
取鸦胆子的干燥果实破碎， 以纯水加热回流提取， 水提液浓缩后以乙酸乙酯萃取， 萃取液浓缩得浸膏 ； 以硅胶柱层析分离， 采用湿法装柱， 干法上样， 用二氯甲烷、 二氯甲烷∶ 甲醇 100 ∶ 1 ～ 1 ∶ 1 梯度洗脱， 收集各组分 ； 收集各组分经薄层层析分析， 合并相同成份 的洗脱组分 ； 硅胶柱层析各组分经薄层层析分析， 合并相同成份的洗脱组分， 选取成分较单 一且含量较高的组分。
优选地， 本发明所述的没食子酸可以按如下方法制备 ：
取鸦胆子的干燥果实破碎， 以纯水加热回流提取， 水提液浓缩后以乙酸乙酯萃取， 萃取液浓缩得浸膏 ；
以硅胶柱层析分离， 采用湿法装柱， 干法上样， 用二氯甲烷、 二氯甲烷∶甲醇 100 ∶ 1 ～ 1 ∶ 1 梯度洗脱， 每 500mL 收集一份， 共收集 113 份， 收集各组分经薄层层析分 析， 合并相同成份的洗脱组分 ；
将硅胶柱分离的第 80 ～ 83 份继续进行凝胶柱层析分离， 以甲醇洗脱， 每 8mL 收集 1 份， 共收集 65 份， 17 ～ 21 份有黄色结晶析出 ；
取凝胶柱分离的第 19 份进行 ODS 反向柱层析分离、 纯化， 以 20 ％甲醇洗脱， 每 50mL 为一份， 共收集 6 份， 第 3、 4 份有白色针状结晶析出， 即为没食子酸。
为了说明本发明的没食子酸的抗 HPV 作用， 本发明提供了以下实验 ：
没食子酸抗 HPV-DNA 的 PCR 检测
本实验研究的没食子酸来源于苦木科植物鸦胆子 Brucea javanica(L.)Merr 的干 燥成熟果实的提取物， 具体研究内容如下 ：
药材鉴定 ：
鸦胆子的鉴定
居于历代 “本草” 对中药形态特征的记述往往不十分详尽和准确。致使中药的品 种混乱现象相当突出， 同名异物， 同物异名等始终未能澄清。这对中药的生产、 科研均有妨 碍。 此外， 中药市场以次充好、 以假乱真现象也较普遍， 为了控制中药质量、 保证中药研究的 可信度， 中药材的鉴别有着十分重要的意义， 为此， 我们根据 《中国药典》 2005 年版第一部中 鸦胆子的相关内容， 对本课题研究中所用的鸦胆子进行品种鉴定。
1 实验药材
鸦胆子 (20080410) 广东康美药业股份有限公司
2 实验方法
2.1 鉴定方法
根据 《中国药典》 2005 年版第一部中鸦胆子的相关内容规定， 鸦胆子的品种鉴定主 要是从性状和与其它物质鉴别两方面。具体的标准、 方法和结果见表 1。
表 1 鸦胆子的鉴定
2.2 鉴定结果
符合 《中国药典》 2005 年版第一部中关于鸦胆子的规定， 本药材为苦木科植物鸦胆 子 Brucea javanica(L.)Merr 的干燥成熟果实。
3 结论
本品完全符合 《中国药典》 2005 年版第一部中关于鸦胆子的规定。
以下所有实验研究所用鸦胆子均为通过本鉴定方法鉴定过的品种， 即为 ： 苦木科 植物鸦胆子 Brucea javanica(L.)Merr 的干燥成熟果实。
鸦胆子抗人乳头瘤病毒的 PCR 检测方法
目前， 药效学研究方法， 主要包括体内药效学和体外药效学实验， 体内药效学实验 主要是通过公认的动物模型实现。我们综合国内外的最新的研究进展发现， 人是人乳头瘤
病毒的唯一的自然宿主， 尖锐湿疣尚无动物模型， 无法进行体内药效学实验， FQ-PCR 技术作 为一种体外扩增特异核酸技术， 已经广泛应用到临床检测以及科学研究领域， 其具有高度 敏感性、 特异性、 操作简便、 快速等特点。
本实验对鸦胆子水提液进行提取、 分离与纯化的同时， 应用此技术对尖锐湿疣做 体外药效学实验以追踪其抗 HPV-DNA 的有效物质。
1 材料及与试剂
ABI 7700 荧光定量 PCR 仪 美国 ABI 公司
人乳头瘤病毒 HPV(6/11 型 ) 核酸扩增荧光检测试剂盒 (20080310) 深圳匹基公司 鸦胆子各种提取分离与纯化物质 本实验室提供
2 实验方法
2.1 尖锐湿疣疣体标本的准备
标本采集于广州中医药大学第二附属医院皮肤病性病专科门诊， 收集发生于外阴 部位的典型新鲜尖锐湿疣疣体标本。精确称其重量后， 加入少量的生理盐水， 匀浆器匀浆， 制成疣体混悬液， 用生理盐水将其稀释成不同的比例， 分别提取 HPV-DNA， 用荧光定量聚合 酶链反应 (FQ-PCR) 仪扩增 HPV-DNA， 根据扩增结果， 选用 HPV-DNA 拷贝数为 106 时的疣体混 悬液作为疣体标本。 2.2 药物的配制
本实验主要由体外药效学实验来追踪鸦胆子抗 HPV-DNA 的物质基础， 因此药物的 配制如下 ：
鸦胆子提取分离得到的水溶性物质以生理盐水溶解 ( 若配制不同浓度则以生理 盐水稀释 )， 充分振荡均匀， 使药液为无沉淀的水剂各 50μL， 配制三组备用。体外药效学 PCR 实验的具体工艺流程图见 ( 图 1)。
2.3 药物与疣体的相互作用
2.3.1 鸦胆子水溶性物质与疣体的相互作用
取出水溶性药液一组， 加入尖锐湿疣疣体标本 50μL 混匀， 置于 37℃的温育箱， 期 间经常摇匀， 尽可能使药物与疣体组织充分作用， 在温育的第 1、 3、 5 和 7 天分别取标本进行 FQ-PCR 检测。其它 2 组按照同样的方法操作。以生理盐水做阴性对照。
2.2.4 荧光定量 PCR 检测 HPV-DNA 含量
2.2.4.1HPV-DNA 提取
按照人乳头瘤病毒 HPV(6/11 型 ) 核酸扩增荧光检测试剂盒附带的 HPV-DNA 提 取方法提取 HPV-DNA ： 取出标本， 轻微振荡混匀， 13000 转 /min 离心 15min， 弃上清液， 再加 入 25μLDNA 提取液 2， 充分混匀， 100℃干浴 10min， 13000 转 /min 离心 10min， 上清液即为 HPV-DNA 模板。
2.2.4.2 定量标准曲线
按照试剂盒要求， 设立 4 个系列浓度的 HPV-DNA 定量阳性标准品， 依次为 5×107 拷 贝数 /mL、 5×106 拷贝数 /mL、 5×105 拷贝数 /mL、 5×104 拷贝数 /mL 见， 以起始拷贝数的自 然对数为横坐标， 循环阈值为纵坐标， 得到回归直线见 ( 图 3) 和标准曲线， 据此对样品的拷 贝数进行定量。
2.2.4.3HPV-DNA 扩增
按照试剂盒操作说明， 取检测试剂盒中的 PCR 反应液 37.6μL， TaqDNA 聚合酶 0.4μL， UNG0.03μL 于 PCR 反 应 管 中， 再 加 入 HPV-DNA 模 板 2μL， 扣 严 管 盖， 置于定量 FQ-PCR 仪上循环扩增。HPV-DNA 经高温变性、 低温退火及中温延伸进行循环扩增， 循环程序 设置为 ： 37℃， 5min ； 94℃， 1min ； 95℃， 5s ； 60℃， 30s， 共作 40 个循环。 反应体系设为 20μL。
2.2.4.4 结果分析条件设定
在 荧 光 定 量 PCR 技 术 中， 实 验 结 果 根 据 CT 值 计 算， C 代 表 Cycle， T 代表了 Threshold， CT 值的含义是 ： 每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。 研究表明， 每个模板的 CT 值与该模板起始拷贝数的对数存在线性关系， 起始拷贝数越多， CT 值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线， 其中横坐标代表起始拷贝数的 对数， 纵坐标代表 CT 值。因此， 只要获得未知样品的 CT 值， 即可从标准曲线上计算出该样 品的起始拷贝数。根据试剂盒说明书， 使用 ABI7700 荧光定量 PCR 仪进行结果分析时， 基线 (baseline) 取为 1-10 或 1-15 个循环的荧光信号， 阈值 (threshold) 设定原则以阈值线刚 好超过正常阴性对照品扩增曲线 ( 无规则的噪音线 ) 的最高点为准。同时在扩增开始前或 结束后设定内标标准品拷贝数。
3 实验结果 当 HPV-DNA 的扩增结果为阳性 ( 拷贝数的指数≥ 103) 时， 得到标准的 S 型曲线见 图 ( 图 3) ； 当表中 HPV-DNA 的扩增结果为阴性 ( 拷贝数的指数＜ 103 时 )， 得到不规则的曲 3 线见 ( 图 4)。当表中 HPV-DNA 的扩增结果为阴性 ( 拷贝数的指数＜ 10 ) 时， 说明药物能抑 3 6 制 HPV-DNA 扩增 ； HPV-DNA 的扩增结果为阳性 ( 拷贝数的指数≥ 10 但＜ 10 ) 时， 说明药物 对 HPV-DNA 抑制作用与其指数的变化成反比， 当 HPV-DNA 的拷贝数的指数愈大时， 抑制作用 愈小， 即药物作用愈小 ； 当 HPV-DNA 的拷贝数的指数愈小时， 抑制作用愈大， 即药物作用愈 大。
鸦胆子水提液的有效物质筛选工艺与抗 HPV 检测结果
根据前面鸦胆子系统提取及萃取物的药效实验结果， 为保持最大有效物质量， 本 部分实验将利用柱色谱等方法对鸦胆子水提液的乙酸乙酯萃取物进一步分离纯化， 同时以 HPLC 进行监控， 以 PCR 体外药效实验筛选出其中抗 HPV 的有效物质， 有效单体结合核磁进行 结构鉴定。
具体流程见图 5。
1 硅胶柱层析
柱层析分离技术是现代的一种物理化学分离手段， 硅胶层析法的分离原理是根据 物质在硅胶上的吸附力不同而得到分离， 一般情况下极性较大的物质易被硅胶吸附， 极性 较弱的物质不易被硅胶吸附， 整个层析过程即是吸附、 解吸、 再吸附、 再解吸过程。
1.1 柱层析条件
鸦胆子 (20080410) 广东康美药业股 份有限公司
DK-S24 型电热恒温水浴锅 上海精宏实验设 备有限公司
乙酸乙酯 (20090215) 分析纯 广州化学试剂厂
中 低 压 柱 色 谱 (CODE NO.17979) 45cm×10cm
BOROSILIKAT 3.3
柱层析硅胶 (0090015) 试剂级 青岛海洋化工厂 分厂
二氯甲烷 (200910080) 分析纯 广州化学试剂厂
甲醇 (20091004-2) 分析纯 广州化学试剂厂
洗脱液 ： 二氯甲烷、 甲醇梯度洗脱 ； 流速 ： 8mL/min
1.2 操作方法
取鸦胆子的干燥果实 4kg 破碎， 用纯水加热回流提取， 浓缩后以乙酸乙酯萃取， 萃 取液浓缩得浸膏。
采用湿法装柱 ： 取柱层析硅胶 700g 以二氯甲烷搅拌均匀并排尽气泡后倒入柱中， 以二氯甲烷淋洗待其自然沉降 ； 干法上样 ： 将乙酸乙酯萃取的 40g 浸膏以 100mL 乙酸乙酯 充分溶解后， 加入 100g 硅胶中， 搅拌均匀， 待挥干乙酸乙酯后得到的粉末再小心加到柱子 的顶层 ； 洗脱∶用二氯甲烷 (CH2Cl2)、 二氯甲烷∶甲醇 (Meth)(100 ∶ 1 ～ 1 ∶ 1) 梯度洗 脱， 每 500mL 收集一份， 共收集 113 份。
1.3 监测方法 1.3.1 硅胶薄层层析法
薄层色谱 (Thin Layer Chromatography) 常用 TLC 表示， 又叫薄板层析， 是色谱法 中的一种， 是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术， 属固液吸附色谱， 它 兼备了柱色谱和纸色谱的优点， 一方面适用于少量样品的分离 ； 另一方面在制作薄层板时， 把吸附层加厚加大， 因此， 又可用来精制样品， 此法特别适用于挥发性较小或较高温度易发 生变化而不能用气相色谱分析的物质。此外， 薄层色谱法还可用来跟踪有机反应及进行柱 色谱之前的一种 “预试” 。
硅胶柱层析各组分经薄层层析分析， 合并相同成份的洗脱组分。
1.3.2 高效液相色谱法
1.3.2.1 仪器与试药
高效液相色谱仪 Waters2695 美 国
PDA 检测器 Waters2998 美 国
高速离心机 BACKMAN COULTER
电子天平 美国 Denver
甲醇 (071700) 色谱纯 美国 fisher 公司
甲酸 (960404) 分析纯 广州化学试剂 厂
1.3.2.2 色谱条件
色谱柱 ： waters symmetry 柱 (150mm×3.9mm， 5μm) ； 流动相 ： A， 0.1 ％甲酸 (pH ： 2.9) ； B， 甲醇。梯度洗脱 ： 0 ～ 23min， B( ％ )10 ～ 27 ； 23 ～ 29min， B( ％ )27 ～ 30 ； 29 ～
30min， B(％ )30 ～ 37 ； 30 ～ 50min， B(％ )37 ～ 50。全波长扫描 ； 体积流量 ： 1.0mL/min ； 进 样量 ： 10μL。
1.3.2.3 样品监测
取乙酸乙酯萃取物、 香草酸标准品、 木犀草素 7-0-β-D- 吡喃葡萄糖甙标准品及 硅胶柱层析各组分的药物适量以 70％甲醇充分溶解， 10μL 进样， 记录色谱图见 6-11。
1.3.2.4 结果
HPLC 图谱分析， 选取成分较单一且含量较高的组分， 见图 11 ： 80 ～ 83 份样品以 3.27min(215.6， 271.3nm) 的成分为主 ； 60 ～ 66 份样品以 6.5min(259.5， 293.9nm) 的成分 为主， 40.4min(226， 278.4nm) 的成分次之 ； 45 份样品以 10.31min(254.7nm) 的成分为主， 28.6min(277.3nm) 的成分次之 ； 33 ～ 36 份样品以 40.1min(244， 280.8nm) 的成分为主， 46.4min(278.4nm) 的成分次之 ； 29 份样品以 14.227min(218.1， 260.7， 291.5nm) 的成分为 主 ( 与香草酸同 ) ； 21 ～ 22 份样品以 17.54min(229.9， 278.4， 309.4nm) 的成分为主。
将上述成份较单一且含量较高的组分按照 PCR 体外药效实验的方法进行筛选， 药 物浓度均为 2.5mg/mL， 且以市售治疗尖锐湿疣的外用药 “尤脱欣” 作为阳性对照， 结果见表 2。
表 2 硅胶柱层析成份较单一组分 PCR 检测结果
1.3.2.5 讨论
由药效结果可以看出硅胶柱层析分离的 80 ～ 83 份样品有抗 HPV-DNA 的作用， 可 继续对该组分的药物进行分离及药效追踪 ； 根据硅胶柱层析的分离原理， 一般情况下极性 较大的物质易被硅胶吸附， 而 80 ～ 83 份样品在硅胶柱中的停留时间较长， 则该组分的成分 应为极性较大的物质。
“尤脱欣” 作为目前临床治疗 CA 的常规外用药物， 可抑制 HPV 感染所导致疣状增殖 的上皮细胞的分裂和增生， 使之发生坏死、 脱落， 从而起到治疗 CA 的作用。通过该 PCR 体外 药效实验结果可以看出 “尤脱欣” 并没有直接破坏 HPV-DNA 的作用， 与本实验研究所追踪的 有效物质抗 HPV 的作用机理不同， 这些有效物质则是通过直接作用于 HPV-DNA， 杀灭病毒而 起效。
2 凝胶柱层析
凝胶过滤法 (gel filtration) 也称为排阻层析 (exclusion chromatography)、 凝 胶层析 (gel chromatography) 或分子筛层析 (molecular sieve chromatofraphy)。
凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质， 内部具有网状筛孔， 利用球状凝胶内的 筛孔， 使分子流过填充凝胶的管柱时， 大分子无法进入凝胶筛孔， 而只流经凝胶及管柱间的 孔隙， 很快就可以流出管柱， 较小的分子因为进入凝胶内的筛孔， 故在管柱内的停留时间较 长， 由此区分大小不同的分子。由前面的药效结果分析， 可将硅胶柱分离的 80 ～ 83 份样品
继续进行凝胶柱层析分离及有效物质筛选。
2.1 柱层析条件
玻璃层析柱 (100cm×2cm) 广州玻璃仪器公司
柱 层 析 凝 胶 (10026532) Sephadex LH-20 GE Healthcare Bio-Sciences AB
甲醇 (20091004-2) 分析纯 广州化学试剂厂
2.2 操作方法
取柱层析凝胶 50g 以甲醇搅拌均匀并排尽气泡后倒入柱中， 以甲醇淋洗待其自然 沉降。 再将硅胶柱分得的 80 ～ 83 份样品以少量甲醇充分溶解后， 小心加到柱子的顶层。 以 甲醇等度洗脱， 流速控制在 3 秒 / 滴。每 8mL 收集 1 份， 共收集 65 份， 分离方法的流程工艺 见图 12。
2.3 结果
第 17 ～ 21 份样品中均有黄色析出物， 将凝胶柱分得的各组分经薄层层析， 凝胶第 3 ～ 21 份样品在 360nm 紫外下观察有暗斑， 且凝胶第 3 ～ 9 份样品成份相同， 凝胶第 11 ～ 15 份样品成份相同， 凝胶第 19 ～ 21 份样品成份相同且较单一。选取凝胶第 8、 14、 17、 19、 20、 21 份样进行 HPLC 分析， 见图 13、 14。图谱可以看出凝胶 17、 19、 20、 21 份样品成份单一。 将凝胶柱层析 8、 13、 20 号组分的样品配制浓度均为 2.5mg/mL， 按照 PCR 体外药效 实验进行检测， 结果显示凝胶 20 组分有抗 HPV 的作用， 检测结果见表 3。
表 3 凝胶柱层析的洗脱组分 PCR 检测结果
2.4 讨论
凝胶第 17 ～ 21 份样品中均有黄色结晶物析出， 结合 17、 19、 20、 21 份样经 HPLC 分 析可以看出， 这些组分中所析出的结晶应为同一单体化合物 ； 并通过 PCR 体外药效实验表 明该化合物具有抗 HPV-DNA 的作用， 需要对其进一步纯化以期得到纯度较高的有效单体。
3 有效物质的纯化 (ODS 反向柱层析 )
最常用的 “万能柱” 填料为 “C18” ， 简称 “ODS” 柱， 即十八烷基硅烷键合硅胶填料 (Octadecylsilyl)。 由于 C18 是长链烷基键合相， 则有较高的碳含量和更好的疏水性。 从前 面凝胶柱层析的结果可以看出凝胶第 17 ～ 21 份样为有效组分， 其成份单一， 且极性较大， 可以利用 ODS 柱对其进一步纯化。
3.1 柱层析条件
玻璃层析柱 (100cm×2cm) 广州玻璃仪器公司
ODS-A(AA12S50) Sephadex LH-20 北京慧德易科技有限公 司
甲醇 (20091004-2) 12nm S-50μm 广州化学试剂厂
3.2 操作方法
凝胶第 17 ～ 21 份样为较单一成分， 取凝胶第 19 份样品进行 ODS 反向柱层析， 以 甲醇溶胀 ODS， 70％甲醇过渡到 20％甲醇平衡柱子， 20％甲醇洗脱， 每 50mL 为一份， 共收集 6 份。分离方法的流程工艺见图 15。
3.3 结果
第 3、 4 份组分有白色针状结晶析出， 将此结晶按照 PCR 体外药效实验方法， 与 CA 混悬液分别作用 1、 4、 7 天后进行检测， 其最低有效浓度为 0.5mg/mL。结果见表 4。
表 4 白色针晶的最低有效浓度 PCR 检测结果
根据 “鸦胆子抗人乳头瘤病毒的 PCR 检测方法” 第3点 “HPV-DNA 标本设置图和 HPV-DNA 实时扩增曲线见， 当 HPV-DNA 的扩增结果为阳性 ( 拷贝数的指数≥ 103) 时， 得到标 3 准的 S 型曲线见图 ( 图 3) ； 当表中 HPV-DNA 的扩增结果为阴性 ( 拷贝数的指数＜ 10 时 )， 得 3 到不规则的曲线见 ( 图 4)。当表中 HPV-DNA 的扩增结果为阴性 ( 拷贝数的指数＜ 10 ) 时， 说明药物能抑制 HPV-DNA 扩增 ； HPV-DNA 的扩增结果为阳性 ( 拷贝数的指数≥ 103 但＜ 106) 时， 说明药物对 HPV-DNA 抑制作用与其指数的变化成反比， 当 HPV-DNA 的拷贝数的指数愈大 时， 抑制作用愈小， 即药物作用愈小 ； 当 HPV-DNA 的拷贝数的指数愈小时， 抑制作用愈大， 即 药物作用愈大。 ” 判断表 4 结果。
有效单体的结构鉴定
1HPLC 鉴定 色谱条件
高效液相色谱仪 Waters2695 美国
PDA 检测器 Waters2998 美国
色谱柱 ： waters symmetry 柱 (150mm×3.9mm， 5μm) ； 流动相 ： A， 0.1 ％甲酸 (pH ： 2.9) ； B， 甲醇。梯度洗脱 ： 0 ～ 23min， B( ％ )10 ～ 27 ； 23 ～ 29min， B( ％ )27 ～ 30 ； 29 ～ 30min， B(％ )30 ～ 37 ； 30 ～ 50min， B(％ )37 ～ 50。全波长扫描 ； 体积流量 ： 1.0mL/min ； 进 样量 ： 10μL。
将此针状结晶与对照品没食子酸进行 HPLC 分析， 见图 16、 17。其光谱和色谱行为 一致。2NMR 鉴定将上述分离纯化得到的有效单体编号为 YDZ-1， 并委托浙江大学药学院对 其进行核磁共振分析。具体碳谱、 氢谱见图 18、 19。初步确定该单体为没食子酸。
结语
本实验以苦木科植物鸦胆子 Brucea javanica(L.)Merr 的干燥成熟果实为药材， 利用各种不同极性的溶媒及柱色谱方法对鸦胆子进行提取分离与纯化， 通过 PCR 体外药效 实验追踪到抗 HPV 的有效物质， 同时在分离过程中以高效液相色谱 (HPLC) 进行监控。最后 水溶性部位中得到白色针晶， 经初步鉴定为没食子酸。且 PCR 体外药效实验结果显示其最 低有效浓度为 0.0005g/mL。
本发明中， 没食子酸可以根据需要加入药物可接受的载体制成药物制剂。本发明所述的制剂， 是单位剂量的药物制剂形式， 所述单位剂量形式是指制剂的 单位， 如片剂的每片， 胶囊的每粒胶囊， 口服液的每瓶， 颗粒剂每袋等。
本 发 明 所 述 的 制 剂 其 中 的 没 食 子 酸， 其在制剂中所占重量百分比可以是 0.1-99.9％， 其余为药物可接受的载体。
本发明所述的制剂， 通过将没食子酸和药物可接受的载体混合制备得到。
本发明没食子酸， 其药物制剂形式可以是任何可药用的剂型， 这些剂型包括 ： 片 剂、 糖衣片剂、 薄膜衣片剂、 肠溶衣片剂、 胶囊剂、 硬胶囊剂、 软胶囊剂、 口服液、 口含剂、 颗粒 剂、 冲剂、 丸剂、 散剂、 膏剂、 丹剂、 混悬剂、 粉剂、 溶液剂、 注射剂、 栓剂、 软膏剂、 硬膏剂、 霜 剂、 喷雾剂、 滴剂、 贴剂。本发明的制剂， 优选的是注射剂， 更优选的是冻干粉针。
本发明没食子酸， 其口服给药的制剂可含有常用的赋形剂， 诸如粘合剂、 填充剂、 稀释剂、 压片剂、 润滑剂、 崩解剂、 着色剂、 调味剂和湿润剂， 必要时可对片剂进行包衣。
适用的填充剂包括纤维素、 甘露糖醇、 乳糖和其它类似的填充剂。 适宜的崩解剂包 括淀粉、 聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物， 例如羟基乙酸淀粉钠。适宜的润滑剂包括， 例如硬 脂酸镁。适宜的药物可接受的湿润剂包括十二烷基硫酸钠。
可通过混合， 填充， 压片等常用的方法制备固体口服组合物。 进行反复混合可使活 性物质分布在整个使用大量填充剂的那些组合物中。 口服液体制剂的形式例如可以是水性或油性悬浮液、 溶液、 乳剂、 糖浆剂或酏剂， 或者可以是一种在使用前可用水或其它适宜的载体复配的干燥产品。这种液体制剂可含 有常规的添加剂， 诸如悬浮剂， 例如山梨醇、 糖浆、 甲基纤维素、 明胶、 羟乙基纤维素、 羧甲基 纤维素、 硬脂酸铝凝胶或氢化食用脂肪， 乳化剂， 例如卵磷脂、 脱水山梨醇一油酸酯或阿拉 伯胶 ； 非水性载体 ( 它们可以包括食用油 )， 例如杏仁油、 分馏椰子油、 诸如甘油的酯的油性 酯、 丙二醇或乙醇 ； 防腐剂， 例如对羟基苯甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸， 并且如果需 要， 可含有常规的香味剂或着色剂。
对于注射剂， 制备的液体单位剂型含有本发明的活性物质和无菌载体。根据载体 和浓度， 可以将此化合物悬浮或者溶解。溶液的制备通常是通过将活性物质溶解在一种载 体中， 在将其装入一种适宜的小瓶或安瓿前过滤消毒， 然后密封。辅料例如一种局部麻醉 剂、 防腐剂和缓冲剂也可以溶解在这种载体中。 为了提高其稳定性， 可在装入小瓶以后将这 种组合物冰冻， 并在真空下将水除去。
本发明中的没食子酸， 在制备成药剂时可选择性的加入适合的药物可接受的载 体， 所述药物可接受的载体选自 ： 葡甲胺、 甘露醇、 山梨醇、 焦亚硫酸钠、 亚硫酸氢钠、 硫代硫 酸钠、 盐酸半胱氨酸、 巯基乙酸、 蛋氨酸、 维生素 C、 EDTA 二钠、 EDTA 钙钠， 一价碱金属的碳 酸盐、 醋酸盐、 磷酸盐或其水溶液、 盐酸、 醋酸、 硫酸、 磷酸、 氨基酸、 氯化钠、 氯化钾、 乳酸钠、 木糖醇、 麦芽糖、 葡萄糖、 果糖、 右旋糖苷、 甘氨酸、 淀粉、 蔗糖、 乳糖、 甘露糖醇、 硅衍生物、 纤 维素及其衍生物、 藻酸盐、 明胶、 聚乙烯吡咯烷酮、 甘油、 土温 80、 琼脂、 碳酸钙、 碳酸氢钙、 表 面活性剂、 聚乙二醇、 环糊精、 β- 环糊精、 磷脂类材料、 高岭土、 滑石粉、 硬脂酸钙、 硬脂酸镁 等。
本发明的组合物在使用时根据病人的情况确定用法用量。
附图说明 图 1 药理学 PCR 实验工艺流程图
图 2HPV-DNA 定量回归直线
图 3HPV-DNA 扩增阳性标本结果图
图 4HPV-DNA 扩增阴性标本结果图
图 5 鸦胆子水提液有效物质追踪流程图
图 6 鸦胆子水提液乙酸乙酯萃取物、 香草酸标准品及木犀草素 7-0-β-D- 吡喃葡 萄糖甙标准品 HPLC 图谱
1 代表木犀草素 7-0-β-D- 吡喃葡萄糖甙标准品 HPLC 图谱， 2 代表香草酸标准品 HPLC 图谱， 3 代表鸦胆子水提液乙酸乙酯萃取物 HPLC 图谱
图 7 硅胶柱层析 75-90 组分 HPLC 图谱
1 代表硅胶柱层析 88-90 组分 HPLC 图谱， 2 代表硅胶柱层析 84-87 组分 HPLC 图谱， 3 代表硅胶柱层析 80-83 组分 HPLC 图谱， 4 代表硅胶柱层析 75-79 组分 HPLC 图谱
图 8 硅胶柱层析 57-74 组分 HPLC 图谱
1 代表硅胶柱层析 70-74 组分 HPLC 图谱， 2 代表硅胶柱层析 67-69 组分 HPLC 图谱， 3 代表硅胶柱层析 60-66 组分 HPLC 图谱， 4 代表硅胶柱层析 57-59 组分 HPLC 图谱
图 9 硅胶柱层析 37-56 组分 HPLC 图谱
1 代表硅胶柱层析 54-56 组分 HPLC 图谱， 2 代表硅胶柱层析 48-53 组分 HPLC 图谱， 3 代表硅胶柱层析 46-47 组分 HPLC 图谱， 4 代表硅胶柱层析 45 组分 HPLC 图谱， 5 代表硅胶 柱层析 44 组分 HPLC 图谱， 6 代表硅胶柱层析 37-43 组分 HPLC 图谱
图 10 硅胶柱层析 23-36 组分 HPLC 图谱
1 代表硅胶柱层析 33-36 组分 HPLC 图谱， 2 代表硅胶柱层析 31-32 组分 HPLC 图谱， 3 代表硅胶柱层析 29-30 组分 HPLC 图谱， 4 代表硅胶柱层析 29 组分 HPLC 图谱， 5 代表硅胶 柱层析 23-28 组分 HPLC 图谱，
图 11 硅胶柱层析成分较单一组分 HPLC 图谱
1 代表硅胶柱层析 80-83 组分 HPLC 图谱， 2 代表硅胶柱层析 60-66 组分 HPLC 图谱， 3 代表硅胶柱层析 45 组分 HPLC 图谱， 4 代表硅胶柱层析 33-36 组分 HPLC 图谱， 5 代表硅胶 柱层析 29 组分 HPLC 图谱， 6 代表硅胶柱层析 21-22 组分 HPLC 图谱
图 12 凝胶柱层析分离流程图
图 13 凝胶柱层析 8、 14 组分 HPLC 图谱
1 代表凝胶柱层析组分 8 的 HPLC 图谱， 2 代表凝胶柱层析组分 14 的 HPLC 图谱，
图 14 凝胶柱层析 17、 19、 20 及 21 组分 HPLC 图谱
1 代表凝胶柱层析组分 17 的 HPLC 图谱， 2 代表凝胶柱层析组分 19 的 HPLC 图谱， 3 代表凝胶柱层析组分 20 的 HPLC 图谱， 4 代表凝胶柱层析组分 21 的 HPLC 图谱
图 15ODS 反向柱的分离流程图
图 16 没食子酸对照品与提取物的光谱图
图 17 没食子酸对照品与提取物的色谱图
1 代表 GA 对照品， 2 代表 YDZ-1
图 18 化合物 I 的核磁共振碳谱图
图 19 化合物 I 的核磁共振氢谱图具体实施方式
以下实施例是为了对本发明进行进一步阐释， 而不会以任何方式限制本发明。
实施例 1
冻干制剂的制备 ：
(1) 将实施例 1 的没食子酸， 加入葡甲胺 ； 100℃加热 1 小时， 冷藏过夜， 加入甘露 醇， 过滤， 定容 ；
(2) 活性炭脱色 ；
(3) 补水 ；
(4) 除菌过滤 ；
(5) 灌装 ；
(6) 冻干。
实施例 2
取实施例 1 的没食子酸及聚乙二醇 -6000， 水浴溶化， 化匀后， 加入降香挥发油， 混 匀， 移至滴丸机中， 制成 1000 粒滴丸。
实施例 3
取实施例 1 的没食子酸、 蔗糖和糊精按重量比 1 ∶ 3 ∶ 1 的比例， 按照常规方法制 成片剂 200 片。
实施例 4
取实施例 1 的没食子酸、 蔗糖和糊精按 1 ∶ 3 ∶ 1 的比例， 按照常规方法制成颗粒 剂 125 袋。
实施例 5
取实施例 1 的没食子酸、 蔗糖和糊精按 1 ∶ 3 ∶ 1 的比例， 按照常规方法制成颗粒， 按照常规方法灌制胶囊。