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1、10申请公布号CN101982177A43申请公布日20110302CN101982177ACN101982177A21申请号201010536082322申请日20101109A61K33/36200601A61K9/127200601A61P35/00200601A61P15/00200601A61J3/0020060171申请人程艳香地址430060湖北省武汉市武昌区复兴路23号紫湖新村紫湖花园602B申请人王晶72发明人程艳香王晶陈滢陈干涛胡敏74专利代理机构武汉宇晨专利事务所42001代理人王敏锋54发明名称一种柔性纳米雄黄脂质体及其制备方法和用途57摘要本发明公开了一种柔性纳米雄黄。
2、脂质体及其制备方法和用途，解决了现有技术中治疗宫颈癌药物中存在的药力不持久，靶向性弱等问题，本发明的柔性纳米雄黄脂质体含有主药雄黄和去氧胆酸钠、天然大豆磷脂、胆固醇、维生素E等辅料，本发明方法采用纳米中药技术处理雄黄，将雄黄制成膜形柔性纳米雄黄脂质体。本发明的优点在于柔性纳米脂质体是种高度自身形变的靶向药物载体，具有可高效地穿过比其自身小数倍的皮肤孔道和亲脂亲水、高效渗透、高度柔韧和包容性等特点，在靶向给药治疗宫颈癌领域极具潜力。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书7页CN101982179A1/2页21一种柔性纳米雄黄脂质体，它含有下述重量份的成。
3、分成分重量份雄黄02510，去氧胆酸钠100500，天然大豆磷脂1005000，胆固醇100500，维生素E1001000，明胶150。2如权利要求1所述的一种柔性纳米雄黄脂质体，它含有下述重量份的成分成分重量份雄黄02510，去氧胆酸钠100，天然大豆磷脂500，胆固醇100，维生素E200，明胶30。3如权利要求1所述的一种柔性纳米雄黄脂质体，它含有下述重量份的成分成分重量份雄黄025，去氧胆酸钠100，天然大豆磷脂500，胆固醇100，维生素E200，明胶30。4如权利要求1所述的一种柔性纳米雄黄脂质体，它含有下述重量份的成分成分重量份雄黄05，去氧胆酸钠100，天然大豆磷脂500，胆固。
4、醇100，维生素E200，明胶30。5如权利要求1所述的一种柔性纳米雄黄脂质体，它含有下述重量份的成分成分重量份雄黄10，去氧胆酸钠100，天然大豆磷脂500，胆固醇100，维生素E200，权利要求书CN101982177ACN101982179A2/2页3明胶30。6权利要求15中任一所述的柔性纳米雄黄脂质体的制备方法，步骤如下A、纳米雄黄的制备将经过球磨机粉碎的雄黄原料粉，过500目筛，称取雄黄样品，以雄黄蒸馏水为1G100ML的比例加入蒸馏水，搅拌后，加入微射流制粒机，10个循环，其中，前9个循环转速为30000RPM，最后一个循环的转速为5000RPM，然后超声震荡，再过022M微孔滤。
5、器除菌，得纳米雄黄混悬液，密封避光4保存；B、柔性纳米雄黄脂质体的制备A、将天然大豆磷脂、胆固醇和维生素E的混合物置于圆底烧瓶中，加入无水乙醇使混合物刚好完全溶解，超声后置于旋转蒸发器中蒸发至乙醇完全挥发，在瓶壁形成一层薄膜；取步骤A制备的纳米雄黄悬液以体积比11的比例溶于PH72的001M磷酸盐缓冲液，然后加入明胶，超声处理5MIN后，再和去氧胆酸钠一起加入到上述圆底烧瓶中，高速搅拌致薄膜完全脱落，向烧瓶中加入与原料雄黄的体积质量比为05ML1MG的甘油并混匀后置20冰箱，2H后取出37冻融，超声10S后继续置20冰箱，2H后取出37冻融，再超声处理10S，再在高压均质机中均质处理3次后，4。
6、下避光保存；B、将步骤A所得最终产物在冰水浴条件下超声处理2MIN，然后压膜，即可得到柔性纳米雄黄脂质体膜，密封避光4保存。7如权利要求16中任一所述的柔性纳米雄黄脂质体在制备治疗宫颈癌的药物中的应用。权利要求书CN101982177ACN101982179A1/7页4一种柔性纳米雄黄脂质体及其制备方法和用途技术领域0001本发明涉及一种药物及其制备方法和用途的技术领域，具体涉及一种柔性纳米雄黄脂质体及其制备方法和用途，该产品适用于宫颈等能经透皮或粘膜给药的实体恶性肿瘤。背景技术0002宫颈癌的发病率居女性生殖道恶性肿瘤的首位。最近的全球资料显示，在全世界妇女中，每年的新发病例数为46000，。
7、其中80的病例发生在发展中国家。我国每年新发病例1315万，约占世界宫颈癌新发病例的288。经过几十年广泛开展的妇科普查，宫颈癌的发病率及致死率降低了近68，但宫颈癌的患病率仍居我国妇女恶性肿瘤第一位，且宫颈癌的发病正呈现一种年轻化的趋势。0003目前宫颈癌的综合治疗已取得了一定成绩，但许多患者不能耐受放化疗的不良反应；部分宫颈癌生长迅速、易远处转移、可能失去最佳手术时机或对放化疗不敏感，使部分晚期或复发患者预后差，且放射治疗后女性内分泌功能受到损害导致年轻患者治疗后生活质量严重下降，因此急需寻求补充或替代治疗手段。目前由于大多数基因治疗方案仍处于初期的临床试验阶段，其有效性和安全性尚存在很大。
8、问题。目前，宫颈癌的基因治疗虽然取得了一定进展，但仅停留在动物模型阶段，还未广泛用于临床，因此传统中药仍被寄予了极大期望。且现阶段国内整体医疗资源紧张、昂贵的宫颈癌治疗费用给尚弱的国民经济带来了沉重负担，因此利用丰富的雄黄矿产资源，制备柔性纳米雄黄脂质体靶向治疗宫颈癌，将其作为宫颈癌的补充治疗或替代治疗方式有很强的实用性和经济学意义。0004雄黄的主要成分是硫化砷AS4S4，即AS2状态、还含有少量的AA2O3氧化砷，即AS3状态。雄黄发挥抗瘤作用的主要分子机制为AS进入机体后作用于酶系统，可抑制酶蛋白的巯基，干扰巯基酶类的活性，影响细胞生物代谢活动、应激修复、癌基因表达以及阻抑癌细胞周期进程。
9、等胡清娜，岳传哲，王东明，等三氧化二砷的医学价值及其作用机制J中国误诊学杂志，2005，51324182419。但这种作用可以抑制巯基酶的正常功能，阻止细胞氧化和呼吸，严重者干扰组织代谢，会导致全身各系统功能受损甚至衰竭；长期暴露于低剂量的砷环境中可以导致多种恶性肿瘤安艳砷致癌作用机制研究进展J中国地方病防治杂志，2006，214221224。外源无机砷进入机体内，在特定酶作用下甲基化，这种甲基化的有机砷毒性远远小于外源无机砷，因此可以视砷甲基化为砷的解毒李冰甲基亚砷酸一一种毒性更强的无柳砷代谢中间产物J中国地方病学杂志，2001。203219221。但是砷甲基化过程中许多代谢产物或中间代谢产。
10、物能导致生物体疾病、DNA损伤，具有更强毒性孙贵范砷代谢研究在解析砷毒性作用机制中的意义J中国地方病学杂志，2008，28112。因此雄黄恰如一把双刃剑治瘤致瘤，解毒制毒，从而导致雄黄在临床上的应用难以开展。大部分学者认为雄黄中有抗瘤作用的是AS4S4，而AS2O3与雄黄的毒性作用有关。但目前没有研究跟踪标记雄黄体内外抗瘤的分子成分；雄黄对温度和光敏感、性状不稳定、极易转化成砒霜即由AS4S4转变为AS2O3；AS4S4和说明书CN101982177ACN101982179A2/7页5AS2O3抗瘤以及毒性机制一致，为AS结合到酶蛋白的巯基、干扰巯基酶类的活性，影响细胞生物代谢活动、应激修复、。
11、癌基因表达而诱导癌细胞凋亡、阻抑癌细胞周期进程等；AS2极难溶于水，胃肠道吸收差，生物利用度低，难以达到抗瘤效果；AS2O3较AS4S4有更强的毒性，这是砷制剂以小剂量和短期作用方式抑制生命力旺盛的癌细胞的必要基础。0005雄黄在机体内发挥抗瘤和毒性的活性成分均为AS2O3，其对肿瘤细胞毒治疗作用和其对机体毒副作用一致。这样，使用雄黄的关键在于提高生物利用度和靶向性，使其细胞毒目标集中在瘤细胞。0006利用宫颈与外界相通，能通过表皮吸收药物的有利条件，借助透皮给药模式TRANSDERMALDRUGDELIVERY，TDD达到在宫颈癌变局部靶向使用雄黄、减少雄黄在宫颈癌瘤体外组织中的含量、降低毒。
12、副作用。但雄黄溶解度低、难以吸收、生物利用度低，因此为了保证其药效性，发明人将纳米技术应用于雄黄的炮制和包装，制造出粒径小于100NM的纳米雄黄，结合柔性纳米脂质体FLEXIBLENANOLIPOSOMES，FNL的高度自身形变、可高效地穿过比自身小数倍的皮肤孔道，并且具有亲脂亲水、高效渗透、高度柔韧和包容性等特点，将其作为天然靶向透皮给药载体可实现纳米雄黄的靶向治疗。发明内容0007针对现有技术中存在的不足，本发明的一个目的在于提供了一种柔性纳米雄黄脂质体，该目的通过如下技术方案来实现0008一种柔性纳米雄黄脂质体，它含有下述重量份的主药和辅料0009成分重量份雄黄主药02510去氧胆酸钠辅。
13、料100500天然大豆磷脂辅料1005000胆固醇辅料100500维生素E辅料1001000明胶辅料1500010所述原料中的雄黄购自湖北省药材公司，产地湖南石门县，雄黄中AS4S4的含量在97以上，AS2O3的含量在05以下；天然大豆卵磷脂BR，98纯度；明胶250PS8温州罗赛洛明胶有限公司；去氧胆酸钠99纯度；维生素EBR，96纯度和胆固醇BR，98纯度。0011本发明的另一个目的在于提供了一种上述柔性纳米雄黄脂质体的制备方法，该目的通过如下措施来实现，操作步骤如下0012A、纳米雄黄的制备说明书CN101982177ACN101982179A3/7页60013按文献方法，制备纳米雄黄混。
14、悬液刘嵘，濮德敏，赵立波，等纳米雄黄混悬液诱导SIHA细胞凋亡及对HPV16E6/E7表达的影响J中国中药杂志，2008，3315458，将经过球磨机粉碎的雄黄原料粉，过500目筛，称取雄黄样品，以雄黄蒸馏水为1G100ML的比例加入蒸馏水，磁力搅拌30MIN后，加入M110EH型微射流制粒机，10个循环，其中，前9个循环转速为30000RPM，最后一个循环的转速为5000RPM，然后超声震荡30MIN，再过022M微孔滤器除菌，得纳米雄黄混悬液，密封避光4保存。0014B、柔性纳米雄黄脂质体的制备0015A、将天然大豆磷脂、胆固醇和维生素E的混合物置于圆底烧瓶中，加入无水乙醇使混合物刚好完全。
15、溶解，超声2MIN后置于旋转蒸发器中减压蒸发至乙醇完全挥发，在瓶壁形成一层薄膜。0016取步骤A制备的纳米雄黄悬液以体积比11的比例溶于磷酸盐缓冲液为北京博奥森生物技术有限公司生产的磷酸盐缓冲液干粉包PBS001MOL/LPH72，产品的网站HTTP/WWWBIOONCOMCN/REAGENT/SHOW_PRODUCTASPID216192，然后加入明胶，超声处理5MIN后，再和去氧胆酸钠一起加入到圆底烧瓶中，高速搅拌致薄膜完全脱落后，再向烧瓶中加入与原料雄黄体积质量比为05ML1MG的甘油后置20冰箱，2H后取出37冻融，超声10S后继续置20冰箱，再重复此操作一次后，在高压均质机中70MP。
16、A压力下均质处理3次后，4下避光保存。0017B、将步骤A所得最终产物在冰水浴条件下超声处理2MIN，压膜，即可得到柔性纳米雄黄脂质体膜，密封避光4保存。0018所用溶剂甘油、无水乙醇均为分析纯。0019本发明还有一个目的在于提供了一种柔性纳米雄黄脂质体的用途，该目的通过如下措施来实现将本发明所制备的柔性纳米雄黄脂质体作用于宫颈癌等能经透皮或粘膜给药治疗的实体恶性肿瘤生长部位，能起到抑制肿瘤生长的作用，同时减少化疗的副作用及患者的经济负担。0020与现有技术相比，本发明的优点和有益效果如下0021柔性纳米脂质体的结构类似于生物膜，是一种多功能定向药物载体，能使更多的药物保留在皮肤中，减少进入血。
17、循环的药物的量，在表皮和真皮内形成药物贮库，形成一个缓释模型，使药物持久地对病变局部起治疗作用。用纳米中药技术处理雄黄，结合“透皮给药”理念，充分发挥宫颈外通器官的有利条件，将柔性纳米雄黄脂质体直接作用于宫颈癌，具有以下优点00221经济实用本发明所用主药为雄黄，利用丰富的雄黄矿产资源，有效缓解现阶段国内整体医疗资源紧张、宫颈癌化疗药物昂贵的现状，制备柔性纳米雄黄脂质体靶向治疗宫颈癌，将其作为宫颈癌的补充或替代治疗方式有很强的实用性和经济学意义；00232柔性纳米脂质体的形变能力比普通脂质体大5个数量级，具有高度自身形变、可高效地穿过比其自身小数倍的皮肤孔道。研究表明，平均粒径在500NM的柔。
18、性纳米脂质体混悬液能穿过直径为其1/5的小孔；00243高度亲脂亲水其穿透皮肤主要受向内的水化压力与自发脱水压力差的驱动，此驱动力与柔性纳米脂质体的数目及单体的亲水性成正比，当柔性纳米脂质体涂于皮肤表面时，水分的蒸发导致部分失水，囊泡为了不完全失水而顺水化梯度移动，发生变形进说明书CN101982177ACN101982179A4/7页7入皮肤；00254高效渗透在受到足够大的应力时，可发生高效渗透，自如地穿过比其自身小数倍的孔道，且透过量和透过速度与纯水相当；00265高度稳定性柔性纳米脂质体包封相关药物后是作为一个整体在体内分布和处置的，并靶向分布于效应器官；00276靶向性本发明主要用于。
19、经皮给药治疗宫颈癌，达到了在宫颈癌变局部靶向使用雄黄、减少雄黄在宫颈癌瘤体外组织中的含量、降低毒副作用的效果。具体实施方式0028下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细阐述。0029实施例1160030一种柔性纳米雄黄脂质体，它含有下述重量份的主药和辅料0031实施例雄黄去氧胆酸钠天然大豆磷脂胆固醇维生素E明胶1025100500100200302030500100100100130351502001507005404017530020030010504520040022545015605010050010020030705525075025040020806027510002755002。
20、590653001500300600301007035020003256753511075375250035075037120804003000375800401308542537504009004214090450450047595047说明书CN101982177ACN101982179A5/7页81509550050005001000501610100500100200300032制备方法如下0033将粉碎并且过500目筛后的原料雄黄，以雄黄蒸馏水为1G100ML的比例加入蒸馏水，磁力搅拌30MIN后，加入M110EH型微射流制粒机，30000RPM，10个循环，其中，最后一个循环的转速。
21、为5000RPM，前9个循环转速为30000RPM，然后超声震荡30MIN，再过022M微孔滤器除菌，得纳米雄黄混悬液，密封避光4保存，得纳米雄黄混悬液；0034将天然大豆磷脂、胆固醇和维生素E的混合物置于圆底烧瓶中，加入无水乙醇使混合物刚好完全溶解，超声2MIN后置于旋转蒸发器中减压蒸发至乙醇完全挥发，在瓶壁形成一薄膜。0035取前面制备好的纳米雄黄悬液以体积比11的比例溶于001M磷酸盐缓冲液PBS，PH72，然后加入明胶，超声处理5MIN后，再和去氧胆酸钠一起加入到圆底烧瓶中，高速搅拌致薄膜完全脱落，再向烧瓶中加入与原料雄黄的体积质量比为05ML1MG的甘油后置20冰箱，2H后取出37冻。
22、融，超声10S后继续置20冰箱，再重复此操作一次后，在高压均质机中70MPA压力下均质处理3次后，将得到的纳米雄黄脂质体混悬液于4条件避光下保存。0036将前步所得纳米雄黄脂质体混悬液在冰水浴条件下超声处理2MIN，压膜，即得到柔性纳米雄黄脂质体膜，密封避光4保存。0037实施例170038一种柔性纳米雄黄脂质体，其制备方法如下将经过球磨机粉碎的原料雄黄粉，过500目筛后称取25MG，加2500ML蒸馏水，磁力搅拌30MIN后加入微射流制粒机，10个循环，其中最后一个循环的转速为5000RPM，前9个循环转速为30000RPM，然后超声震荡30MIM，再过022M微孔滤器除菌，密封避光4保存，。
23、得纳米雄黄混悬液；0039将50G天然大豆磷脂、10G胆固醇和20G维生素E置于圆底烧瓶中，加入无水乙醇至以上混合物刚好完全溶解，超声2MIN，置于23水浴中旋转蒸发器减压蒸发至有机溶剂完全挥发，在瓶壁形成一薄膜。取前面制备的纳米雄黄混悬液以体积比11的比例溶于001M磷酸盐缓冲液PBS，PH72中，并称取3G明胶，加入其中，超声处理5MIN后，和10G去氧胆酸钠一起加入到圆底烧瓶中，高速搅拌致薄膜完全脱落。然后向圆底烧瓶中加入125ML甘油后置于20冰箱，2H后取出37冻融，超声10S后继续置20，再重复此步骤一次后，在高压均质机70MPA压力下均质处理3次，将得到的纳米雄黄脂质体混悬液于4。
24、条件避光下保存。0040将所得纳米雄黄脂质体混悬液在冰水浴条件下超声处理2MIN，压膜，即得到柔性纳米雄黄脂质体膜，密封避光4保存，即得含主药雄黄25MG的柔性纳米雄黄脂质体膜。0041实施例180042雄黄50MG和蒸馏水5000ML代替实施例17的主药用量及过筛后加入雄黄中的蒸馏水的量，其余成分的量和制备方法均同实施例17，得含主药雄黄50MG的柔性纳米雄黄脂质体膜。说明书CN101982177ACN101982179A6/7页90043实施例190044雄黄100MG蒸馏水10L代替实施例17的主药用量及过筛后加入雄黄中的蒸馏水的量，其余成分的量和制备方法均同实施例17，得含主药雄黄10。
25、0MG的柔性纳米雄黄脂质体膜。0045实施例200046在宫颈癌动物模型上验证本发明制得的柔性纳米雄黄脂质体的治疗作用及靶向性0047A、裸鼠饲养过程选用鼠龄34周，鼠重1218G，雌性的BALB/C裸鼠。在2527无菌恒温、恒湿4550的半屏障系统环境下饲养，所有饲料、饮用水及垫料经高压灭菌处理，每3天更换饲料、饮用水及垫料；0048B、裸鼠动物模型的建立取处于对数生长期的SIHA细胞用025胰蛋白酶含002EDTA消化制成2106个/ML单细胞悬液台盼蓝拒染法计数活细胞数占95以上，于每只裸鼠背部皮下注射约02ML，饲养约2周，将肿块直径超过10MM的荷瘤裸鼠作为本实验的动物模型；0049。
26、C、实验分组及处理方法取同等体重和瘤体大小相同的裸鼠各分为七组分别为对照组、25MG/KG脂质体组、50MG/KG脂质体组、100MG/KG脂质体组、25MG/KG混悬液组、50MG/KG混悬液组及100MG/KG混悬液组，每组5只。对照组不作特殊处理；25MG/KG脂质体组、50MG/KG脂质体组、100MG/KG脂质体组分别将含主药为25MG、50MG、100MG雄黄的膜形柔性纳米雄黄脂质体按用量要求制成相应大小的贴膜配方见实施例17、18、19贴在小鼠瘤体皮肤表面，使每组每次给予的药量为25MG/KG、50MG/KG、100MG/KG体重，每日一次，每次持续贴紧直至次日换药；25MG/K。
27、G混悬液组、50MG/KG混悬液组及100MG/KG混悬液组每日分别给予由实施例1719中制得的纳米雄黄混悬液，使它们每日获药量为25MG/KG、50MG/KG、100MG/KG体重，1天/次。以上实验小鼠分组后均连续培养10D。0050计算抑瘤率停药次日处死动物，剥离皮下瘤块，称瘤重，计算各组瘤体平均重量及抑瘤率。依据肿瘤重量计算抑瘤率抑瘤率1治疗组平均瘤重/空白组平均瘤重100。表1显示了各实验组抑制肿瘤生长的情况；0051在停药次日，处死裸鼠之前抽裸鼠血浆后处死裸鼠，无菌条件下取血浆、肿瘤组织，以及裸鼠肝、肾、脾器官，匀浆实体组织，检测血浆、瘤体、肝、肾、脾器官中的砷含量。将样品消化、定。
28、容。消化液由硝酸和次高氯酸按13的体积比例配制而成。样品被置于80恒温电热板上消化。按文献方法UTHUSEO，COLLINGSME，CORNZATZERWE，ETALDETERMINATIONOFTOTALARSENICINBIOLOGICALSAMPLESBYAMINEGENERATIONANDATOMICABSORPTIONSPECTROMETRYJANALCHEM，1981，531422212224用石墨炉原子吸收光谱法测定组织及肿瘤样品的吸收度，采用一点法计算样品砷浓度。样品砷浓度样品吸收度标准品吸收度02GM1V/GV为样品定容的体积，G为组织的重量。0052实验结果如下0053表1。
29、本发明的膜形柔性纳米雄黄脂质体对小鼠宫颈癌生长的影响N5说明书CN101982177ACN101982179A7/7页1000540055柔性纳米雄黄脂质体25MG/KG、50MG/KG、100MG/KG体重剂量组和对照组比，P均005。柔性纳米雄黄脂质体25MG/KG、50MG/KG、100MG/KG体重剂量组的抑瘤率显著高于同剂量灌胃给予纳米雄黄混悬液组P005。0056表2实验小鼠正常组织和肿瘤组织中砷的浓度N5，00570058柔性纳米雄黄脂质体25MG/KG、50MG/KG、100MG/KG体重剂量组的血浆、肝脏、肾脏、脾脏中的砷浓度显著低于同剂量灌胃给予纳米雄黄混悬液组P005；柔性纳米雄黄脂质体25MG/KG、50MG/KG、100MG/KG体重剂量组的肿瘤组织中的砷浓度显著高于同剂量灌胃给予纳米雄黄混悬液组P005。0059以上动物实验数据表明本发明的纳米雄黄脂质体具有显著的抗肿瘤特性，且具有良好的靶向性，其透皮给药方式明显的减少了给药剂量，减缓了雄黄的毒副作用，因此柔性纳米雄黄脂质体向临床推广具有非常广泛的前景。说明书CN101982177A。