基于五株益生菌混合发酵培养物的营养组合物.pdf

本发明涉及多株益生菌混合发酵培养制得的营养组合物，特别是涉及以三种植物性原料为发酵底物，经五株益生菌混合发酵得到的培养物和其制备方法、由所说的发酵培养物与一种或多种医药上可接受的添加剂组成的营养组合物，以及所说的营养组合物在生产用于预防或治疗便秘并调节人体的肠道菌群的药物或保健食品中的应用。

1、  五株益生菌混合发酵培养物，特征在于所说的益生菌发酵培养物是使用经过浸泡生芽、蒸煮并用淀粉酶水解的玉米和燕麦以及经过浸泡生芽、蒸煮并用蛋白酶水解的大豆作为原料，接种预培养的各约0.4％(体积/体积)的两歧双歧杆菌和短双歧杆菌菌液，培养约2～6小时后再次接种各约0.4％(体积/体积)的嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌干酪亚种和德氏乳杆菌保加利亚亚种菌液，继续发酵约20～22小时，当发酵液的pH值降低至3.0～4.0时结束发酵，得到五株益生菌混合发酵培养物。

2、  根据权利要求1的混合发酵培养物，特征在于所说的益生菌是两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌干酪亚种和德氏乳杆菌保加利亚亚种。

3、  由权利要求1的混合发酵培养物与一种或多种医药上可接受的添加剂组成的营养组合物。

4、  根据权利要求3营养组合物，其中所说的一种或多种医药上可接受的添加剂是具有内源性益生菌生长促进活性的益生元类物质，以及选自常规赋形剂、香味剂、甜味剂、防腐剂的一种或多种其他添加剂。

5、  根据权利要求2的营养组合物在生产用于调节人体的肠道菌群失调、预防和治疗便秘的药物中的应用。

6、  根据权利要求2的营养组合物在生产用于调节人体的肠道菌群失调、预防和治疗便秘的保健食品中的应用。

基于五株益生菌混合发酵培养物的营养组合物
技术领域
本发明涉及多株益生菌混合发酵培养制得的营养组合物，特别是涉及以三种植物性原料为发酵底物，经五株益生菌混合发酵得到的培养物和其制备方法、由所说的发酵培养物与一种或多种医药上可接受的添加剂组成的营养组合物，以及所说的营养组合物在生产用于预防或治疗便秘并调节人体的肠道菌群的药物或保健食品中的应用。
技术背景
微生物是一类具有现实和潜在用途的生物资源，广泛应用于农业、工业、医药、食品及环保等各个领域。人类对微生物的利用经历过天然混合培养到纯种培养两个阶段，纯培养技术使得研究者摆脱了多种微生物共存的复杂局面，能够不受干扰地对单一目的菌株进行研究，从而丰富了我们对微生物形态结构、生理和遗传特性的认识。但是，在长期的实验和生产实践中，人们不断地发现很多重要生化过程是单株微生物不能完成或只能微弱地进行的，必须依靠两种或多种微生物共同培养完成。微生物混合培养或混合发酵已越来越被人们所重视。科学家们对混合培养微生物资源进行了多方面的研究，不仅具有深远的理论意义，更具有重大的应用价值。
微生物发酵的生产水平不仅取决于菌种本身的性能，而且要在合适的环境条件下才能使生产能力充分表达。对混合发酵中较重要的几个影响主要因素包括(1)混合系统中各微生物之间的相互关系及接种量比例：混合发酵区别于一般微生物发酵的主要不同之处在于该体系由两种或多种微生物组成，其中一种微生物为另一微生物提供营养来源或相互提供营养，有的情况下后者还可以通过利用这些产物为前者解除了降解物造成的抑制，从而组成一个使体系中的各微生物和谐共生的微环境，这对于微生物在利用一些比较难于利用的底物时尤其有利；(2)酸碱度和(3)温度。
混合发酵的特点包括(1)多株菌混合发酵可实现共生酶系的互补：现代研究试验证明，不同的微生物有不同的代谢途径，代谢产物各不相同。多种微生物协同作用能优势互补、相辅相成，因而能起到单一菌株发酵难以起到的作用。(2)生长速度快，在混合培养中，第一类微生物可以产生有利于第二类微生物生长、发酵所需的基本物质(如碳源、氮源)和营养素(朔影等，双歧杆菌混合培养初步研究，《中国食品添加剂试验研究》，2006(2)：63-73)。(3)混合培养能产生多种酶，因此可作用于许多种类的化合物，并能较好地消除和改变底物中的抑制物，提高原料的利用率(邹镜铭.多菌种混合制曲提高酱油质量.调味品.2005(4)33-34)。(4)多级转化混合培养发酵可以完成一整套完整的多级转化，这在单一菌种培养发酵几乎是不可能做到的。以及(5)多种转化可同时发生在混合发酵过程中，底物中可以同时进行多种转化，而这对于单一种微生物的发酵过程来说根本不可能。
人体肠道中的益生菌群是由不同的微生物群组成的，它们定植在肠道的不同部位，各自发挥着不同的生理效应。因此，利用多株益生菌进行发酵，制备和使用调节人体微生态稳定与平衡的营养组合物，将更符合人体的生理环境和需求。而且，多菌株混合发酵可以协调和弥补单菌株代谢产物的不足。特别是，选用燕麦、玉米、大豆等三种植物性原料作为发酵底物，不仅可以降低混合发酵培养物的成本，这些原料还可为益生菌生长提供必要的碳源、氮源，为组合物服用者提供更多的可溶性膳食纤维、大豆异黄酮、植物蛋白等有益的营养成分。
为此，本发明人试图在以前三株菌发酵的基础上，进一步选用五株益生菌混合发酵，并使用植物性原料作为发酵底物，制备出生产成本更低，作用更加明显，使用价值更加突出的多株益生菌混合发酵产品。
发明内容
本发明涉及多株益生菌混合培养营养组合物，特别是涉及包括以三种植物性原料为发酵底物，经五株益生菌混合发酵得到的培养物和其制备方法，由所说的发酵培养物与一种或多种医药上可接受的添加剂组成的组合物，以及所说的组合物在生产用于预防或治疗便秘并调节人体的肠道菌群的药物或保健食品中的应用。
本发明的一个目的是提供一种五株益生菌混合发酵产生的组合物，特征在于所说的益生菌是两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌干酪亚种和德氏乳杆菌保加利亚亚种。
本发明的另一个目的是提供生产上述营养组合物的方法，该方法包括使用经过浸泡生芽、蒸煮并用淀粉酶水解的玉米和燕麦以及经过浸泡生芽、蒸煮并用蛋白酶水解的大豆作为原料，接种预培养的各约0.4％(体积/体积)的两歧双歧杆菌和短双歧杆菌菌液，常规培养约2～6小时后再次接种各约0.4％(体积/体积)的嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌干酪亚种和德氏乳杆菌保加利亚亚种菌液，继续发酵约20-22小时，当发酵液的pH值降低至3.0～4.0时结束发酵，得到五株益生菌混合发酵培养物，然后再在所得到的培养物中加入一种或多种医药上可接受的添加剂，即得到本发明的营养组合物。
根据本发明的一个优选实施方案，所说的一种或多种医药上可接受的添加剂是具有内源性益生菌生长促进活性的益生元类物质，以及选自常规赋形剂、香味剂、甜味剂、防腐剂的其他常规添加剂。所说的具有内源性益生菌生长促进活性的益生元类物质包括但不只限于低聚寡糖，例如大豆低聚糖、水苏糖、低聚半乳糖、低聚异麦芽糖和低聚木糖。
为了制备五株益生菌混合发酵培养物，可以使用经过浸泡生芽、蒸煮并用淀粉酶水解的玉米和燕麦，以及浸泡生芽、蒸煮并用蛋白酶水解的大豆作为发酵生产本发明五株益生菌混合发酵培养物的原料。一般说来，每100ml培养物中含燕麦5克、玉米4克，以及大豆10克。
为了制备燕麦和玉米的提取物，可按物料配比称取燕麦、玉米，漂洗干净后，水浸泡2～6小时(可根据不同季节选择不同的浸泡时间)，然后在22～27℃环境中培育64～72小时。此其间，用水不断冲洗，保持燕麦和玉米籽粒生芽后的重量为原籽粒干重的大约两倍。应保持胚芽无异味、不发粘。按照待制备的培养物体积的大约50％加水混合、粉碎并磨浆。然后121℃蒸煮15分钟，并冷却至约80℃。然后按照20～25u/g原料的量加入耐高温α-淀粉酶，搅拌下80℃酶解约3～6小时。酶解完成后，升温至大约100℃，保持10～15分钟。过滤后定容至待制备培养物体积的50％即为燕麦、玉米提取液。
可按照下述方法制备大豆提取液。按物料配比称取大豆并漂洗干净后浸泡2～6小时，22～27℃环境中培育64～72小时，其间不断用水冲洗，要求豆胚芽的量为大豆籽粒干重的3倍左右，同时保持胚芽无须根、无异味、不发粘。按所制备的培养物体积的大约45％加水。121℃蒸煮15分钟并过滤，滤液温度降至约45℃时，加入碳酸钠(约为大豆重量的0.5％(重量/重量))，使溶液的pH值为大约8.0。然后，按大豆重量的0.8％(体积/重量)加入胰蛋白酶液，45℃酶解2～4小时。然后再按60-100μ/g物料重量加入中性蛋白酶继续酶解2～4小时左右。酶解完成后，100℃煮沸10分钟，过滤后，定容至制备培养物体积的50％，即为所需的大豆提取液。
将以上预制备的燕麦和玉米混合提取液与大豆提取液按照大约1∶1的体积比混合后，再加入葡萄糖1.5％(重量/体积)、蔗糖5.0％(重量/体积)；酵母粉0.3％(重量/体积)、无机盐(硫酸亚铁·7H₂O 1.0mg/100ml、硫酸锌·7H₂O 4.4mg/100ml、亚硒酸钠·5H₂O 0.024mg/100ml、硫酸镁·7H₂O 70mg/100ml、硫酸锰·H₂O0.5mg/100ml、氯化钠1.0mg/100ml、磷酸二氢钾100mg/100ml、磷酸氢二钾·3H₂O100mg/100ml)，混匀，100℃煮沸10分钟，过滤、定容至原始培养基体积，调整pH7.0左右并115℃灭菌40分钟后，即得到继后用于益生菌发酵的特定营养培养基。
当按上述方法制备的用于益生菌发酵的特定营养培养基的温度降至39℃左右时，接种预培养的两歧双歧杆菌和短双歧杆菌菌液，常规培养2～6小时后再依次分别接入嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌干酪亚种和德氏乳杆菌保加利亚亚种菌液。五个菌种的接种量均为0.4％(体积/体积)。继续发酵大约20～22小时。当发酵培养物的pH降至3.0～4.0左右时结束发酵。
发酵完成后，向培养物中加入用于促进内源性益生菌生长的益生元类物质，例如水苏糖，添加量为1～4g/100ml发酵培养物，或低聚木糖，添加量为0.3～0.8g/100ml发酵培养物。然后70℃下保持4小时，以使发酵菌充分灭活。这里所说的益生元(Prebiotics)是指一类不被宿主消化吸收的、但能选择性地促进体内益生菌的代谢和增殖进而改善宿主健康的有机物质，有时也被称为双歧因子。
用于本发明的益生菌(两歧双歧杆菌AS 1.852、短双歧杆菌AS 1.2213、嗜酸乳杆菌AS 1.1854、干酪乳杆菌干酪亚种AS 1.29和德氏乳杆菌保加利亚亚种AS1.1480)均可由中国科学院微生物研究所购得，并在常规培养基中进行常规预培养。
本发明进一步提供由五株益生菌混合发酵产生的培养物与一种或多种医药上可接受的添加剂组成的营养组合物。根据本发明的一个优选实施方案，所说的一种或多种医药上可接受的添加剂是具有内源性益生菌生长促进活性的益生元类物质，以及选自常规赋形剂、香味剂、甜味剂、防腐剂的其他常规添加剂。所说的具有内源性益生菌生长促进活性的益生元类物质包括但不只限于低聚寡糖，例如大豆低聚糖、水苏糖、低聚半乳糖、低聚异麦芽糖和低聚木糖。
发明的再一个目的是提供本发明的组合物在调节人或哺乳动物的肠道微生态平衡，改善肠道功能及在生产用于预防和治疗便秘的药物或保健食品中的应用。
我们使用常规平皿培养实验进行的研究发现，本发明选用的五株益生菌相互间的生长均未见明显的抑制作用(参见实施例2)。
为检测本发明五株益生菌混合发酵培养物在抑制和杀灭致病细菌，保护胃肠道内微生态平衡中的生物学活性和作用，并与单菌株培养物的抑杀活性进行比较，我们使用常规平皿培养法实验了的本发明的五株益生菌混合培养物对致病菌的体外杀伤活性。结果发现，本发明的益生菌培养物对肠道致病菌大肠杆菌25922、金黄色葡萄球菌6538均有抑制和杀伤作用，其中以对金黄色葡萄球菌的抑制和杀伤作用最强，并且，本发明的五株益生菌混合培养物抑杀活性高于单菌株的培养物的抑杀活性(参见实施例3)。
该培养物作为营养口服液的可适用性，我们检测本发明的五株菌发酵产生的风味物质双乙酰含量高于单菌株发酵(参见实施例4)。
我们的实验研究进一步证实，本发明的益生菌混合培养营养组合物能够有效的维持人肠道的微生态菌群平衡，并可有效地预防和治疗便秘，具有润肠通便和调节人体的肠道菌群的作用(参见实施例5-7)。经口投用本发明的益生菌混合发酵培养营养组合物10天。结果显示，实验组小鼠平均小肠推进率显著高于模型对照组(P＜0.01)，实验组小鼠平均首次排便时间较模型对照组明显缩短(P＜0.01)，其6小时排便粒数和粪便重量明显增加(P＜0.01)。本发明的五株益生菌混合发酵培养营养组合物表现有明显的润肠通便的作用。同时，通过小鼠和人体试食试验，本发明的益生菌混合培养营养组合物对受试者肠道益生菌菌群乳酸杆菌和双歧杆菌的数量增加明显。
当本发明基于五株益生菌混合发酵培养物的营养组合物被使用者摄入后，其中的益生菌菌体进入机体并粘附于肠道的不同部位，发挥它们的生物屏障作用并抑制致病菌的粘附。另外，多种益生菌酸性代谢物可有效地促进肠蠕动。本发明所使用的原料也为服用者提供充分的可溶性膳食纤维、大豆异黄酮、植物蛋白等有效营养成分。再者，该营养组合物中添加的低聚寡糖益生元也有利于肠道内益生菌的生长。因此，本发明基于五株益生菌混合发酵制备的营养组合物，更符合人体的微生态环境，具有较高的生物学活性和营养价值。
可以按照保健食品制备的常规方法，在本发明的五株益生菌培养物中加入医药上可接受的一种或多种赋形剂或其他添加剂，制成营养组合物。例如，可以在如上制备的益生菌培养物中加水或生理盐水，以及适当量的选自调味剂、甜味剂和防腐剂等的添加剂，制成适于口服使用的营养组合物。也可以将本发明的益生菌培养物冷冻干燥，并加入选自乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇和甲基纤维素等的赋形剂；选自淀粉、海藻酸钠、羧甲基纤维素钙和结晶纤维素等的崩解剂；选自硬脂酸镁和滑石等的润滑剂；选自明胶、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素和羟丙基纤维素等的黏结剂，和选自蔗糖脂肪酸酯、山梨醇脂肪酸酯等的表面活性剂，以及着色剂、甜味剂、香料、分散剂等辅助成分，按常规方法将本发明的益生菌培养物制备成粉末剂、胶囊剂或片剂。
实施例
实施例1；本发明基于五株益生菌混合发酵培养物的营养组合物的制备方法
简单地说，为了制备本发明基于五株益生菌混合发酵培养物的营养组合物，可以使用经过浸泡生芽、蒸煮并用淀粉酶水解的玉米和燕麦以及用蛋白酶水解的大豆作为原料，接种预培养的各约0.4％(体积/体积)两歧双歧杆菌和短双歧杆菌菌液，常规培养约2～6小时后再次接种预培养的各约0.4％(体积/体积)的嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌干酪亚种和德氏乳杆菌保加利亚亚种菌液。继续发酵约20～22小时后，当发酵液的pH值降低至3.0～4.0时结束发酵，即得到本发明的五株益生菌混合发酵培养物。然后，在发酵液内加入适当比例的一种或多种医药上可接受的如低聚寡糖添加剂，便得到本发明的营养组合物。
以下按步骤具体描述该方法。
(1)发酵培养基的制备
可使用经过浸泡生芽、蒸煮并用淀粉酶水解的玉米和燕麦和用蛋白酶水解大豆作为生产本发明五株菌混合发酵培养物的原料。一般说来，每100ml发酵培养物中约含燕麦5克、玉米4克，以及大豆10克。为制备燕麦和玉米的提取物，可按物料配比称取燕麦、玉米，漂洗干净后，水浸泡6小时(根据季节选择不同的时间)，然后在25℃环境中培育72小时，其间用水不断冲洗，要求生芽后的重量为原籽粒干重的两倍左右。胚芽应无异味，不发粘。按照要制备培养物体积的50％左右加入水，粉碎并磨浆。121℃蒸煮15分钟后，冷至80℃时。然后按照25u/g原料的量加入耐高温α-淀粉酶，搅拌下80℃酶解约4小时。酶解完成后，升温至大约100℃，保持10分钟，过滤后定容至所需培养基体积的50％，即为燕麦、玉米提取液。为制备大豆提取物，可按照下述方法制备大豆提取液。按物料配比称取大豆并漂洗干净后浸泡6小时，25℃环境中培育72小时，其间不断用水冲洗，要求豆胚芽的量为大豆籽粒干重的3倍左右，胚芽无须根，无异味，不发粘。按所制备培养物体积的大约45％加水，121℃蒸煮15分钟并过滤，滤液温度降至约45℃时，加入碳酸钠(约为大豆重量的0.5％重量/重量)，使溶液的pH值为大约8.0。然后，按大豆重量的0.8％(体积/重量)加入胰蛋白酶液，45℃酶解3小时后，再按100μ/g物料重量加入中性蛋白酶，继续酶解3小时左右。酶解完成后，100℃煮沸10分钟，过滤后定容至所需培养基体积的50％即为大豆提取液。将如上预制备的燕麦、玉米提取液和大豆提取液按照大约1∶1的体积比混合后，再加入葡萄糖1.5％(重量/体积)、蔗糖5.0％(重量/体积)、酵母粉0.3％(重量/体积)、无机盐(硫酸亚铁·7H₂O 1.0mg/100ml、硫酸锌·7H₂O 4.4mg/100ml、亚硒酸钠·5H₂O 0.024mg/100ml、硫酸镁·7H₂O 70mg/100ml、硫酸锰·H₂O0.5mg/100ml、氯化钠1.0mg/100ml、磷酸二氢钾100mg/100ml、磷酸氢二钾·3H₂O100mg/100ml)，混匀，100℃煮沸10分钟，过滤、定容至原始培养基体积，调整pH7.0左右，并115℃灭菌40分钟后，即得到继后用于益生菌发酵的特定营养培养基。
(2)五株益生菌的接种和混合发酵
当如上制备的混合发酵营养培养基的温度降低至39℃左右时，向其中接种预培养的两歧双歧杆菌和短双歧杆菌菌液，38℃培养2小时后再依次分别接入嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌干酪亚种和德氏乳杆菌保加利亚亚种菌液。五个菌种的接种量均为0.4％(体积/体积)。38℃继续发酵约22小时，当培养物(发酵液)的pH降至4.0左右时结束发酵得到所说的五株益生菌混合发酵培养物。
(3)本发明营养组合物的制备
发酵完成后加入灭菌的低聚寡糖(为促进内源性益生菌生长的物质)(例如低聚木糖：添加量0.7g/100ml发酵培养物)。然后，70℃下保持4小时，以使发酵菌灭活。同时，再在如上制备的五株益生菌混合发酵培养物中，按适当的或常规的比例，加入一种或多种医药上可接受的其他添加剂，例如常规赋形剂、香味剂、甜味剂、防腐剂等，即得到本发明的不同剂型的营养组合物。
实施例2：本发明所选五株益生菌菌株间相互间拮抗和生长抑制作用的观察
按照实施例1所述的方法制备用于五株益生菌混合发酵的营养培养基，分成5等份，灭菌后，分别单独接种预培养的两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、德氏乳杆菌、干酪乳杆菌菌液(各菌接种量均为2.0％(体积/体积))。常规培养24小时，分别以所得培养物作为各株菌的待检样品。
采用培养平皿管碟法(中华人民共和国药典，2005版，附录XI抗生素微生物检定法)检测五株菌之间的相互作用。
结果如下列表1所示。
表1：本发明选用的各菌株培养物对其它益生菌的生长的影响

从表1所示结果可以看出，所选用的五株益生菌相互间的生长均未见明显的抑制作用
实施例3：本发明的益生菌混合发酵培养物对某些肠道致病菌的抑杀作用，并与单菌株发酵培养物的抑杀活性的比较
本试验采用本领域已知的常规管碟法检测本发明的益生菌混合发酵培养物对肠道致病菌大肠杆菌25922、金黄色葡萄球菌6538(购自山东省疾控中心)的抑杀作用，并观察五株菌混合发酵培养物和单一益生菌发酵培养物对致病菌抑杀作用的不同。
按照前述方法制备培养基并分成六等份，灭菌后接种预培养的两歧双歧杆菌和短双歧杆菌菌液。38℃发酵2小时后，再接种德氏乳杆菌保加利亚亚种，嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌菌液，接种量均为0.4％(体积/体积)，38℃继续培养22小时，作为混合发酵样品。其它培养基分别单独接种预培养的两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、德氏乳杆菌、干酪乳杆菌菌液，各接种均为2.0％(体积/体积)并培养24小时。分别作为各益生菌的单独发酵培养物样品。
用PBS洗下在营养琼脂培养基斜面上培养15小时的致病菌，用细菌标准比浊管(中国药品生物制品检定所)标定后，将菌悬液稀释至107个细菌/ml。采用本领域已知的常规培养平皿管碟法检测本发明五株益生菌混合发酵培养物对致病菌的抑杀作用。结果如下列图2所示。
表2：本发明五株益生菌混合发酵培养物与单菌株发酵培养物对致病菌的抑菌作用的比较

由表2可见，本发明益生菌混合发酵培养物中的所用发酵菌种及其代谢产物，无论是单独发酵和混合发酵的，对致病菌大肠杆菌25922、金黄色葡萄球菌6538均具有抑制和杀伤作用。并且，在测试条件下，以本发明的五株益生菌混合发酵培养物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑杀作用为最强。
实施例4：本发明五株益生菌混合发酵培养物与单菌株发酵培养物样品中风味物质双乙酰的含量比较
乳酸菌在代谢过程中，能够产生一些风味物质，赋予产品特殊的口感，本试验是采用分光光度法测定本发明的益生菌混合发酵培养物以及各株益生菌单独发酵的代谢产物中双乙酰的含量。
将实施例3制备的6个样品各取10ml，按照“啤酒双乙酰的试验方法”(见GB/T4928-1991中华人民共和国国家标准)进行检测。
检测结果如下列表3所示。
表3 本发明五株益生菌混合发酵培养物样品与单菌株发酵培养物产物中双乙酰含量比较

从表中可以看出，五株菌分级接种、混合发酵和每一株菌单独发酵后，用分光光度法测定发酵培养物中的双乙酰含量，混合发酵样品双乙酰含量明显高于其它样品，表明多菌株混合发酵可以比单株菌发酵产生更多的风味物质。
实施例5：本发明的基于五株益生菌混合发酵培养物的营养组合物对小鼠的润肠通便作用
本实施例旨在借助对小鼠的小肠推进试验和排便试验观察和评价实施例1制备的基于五株益生菌混合发酵培养物的营养组合物的润肠通便作用。
试验动物：三级昆明种雄性小鼠，由中国药品生物制品检定所试验动物中心提供(许可证编号：2000第017号)。试验包括小肠推进试验排便试验两部分，每个试验均分5组(按体重随机分成5组)，其中三个剂量组，一个阴性对照组和一个便秘模型对照组，三个剂量组分别相当于人体推荐量(90ml/人/日)的10、20、30倍即15、30、45ml/kg.bw/d.(即15、30、45ml/公斤体重/天，下同)。
1.本发明的基于五株益生菌混合发酵培养物的营养组合物对小鼠小肠推进能力的影响
小肠推进试验：以灌胃方式给样，连续10天，阴性对照组与模型对照组同样方式给水。10天后，各组小鼠禁食12小时(期间自由饮水)。模型对照组与三个剂量组灌胃给予复方地芬诺酯(50mg/kg.bw)，阴性对照组给水。0.5小时后，各剂量组分别给予含受试物的墨汁(5％)，对照组仅给墨汁；20分钟后，颈椎脱臼处死动物，完整取出胃喷门至直肠末端段，置于木板上，将小肠自然摆成直线，分别测量从幽门到回盲部和到墨汁前沿的距离，计算小肠推进率。
小肠推进率(％)＝(幽门至墨汁前沿距离/幽门到回盲部距离)×100
与阴性对照组比较，模型对照组小鼠平均小肠推进率显著低于阴性对照(P＜0.01)。与模型对照组比较，各剂量组小鼠平均小肠推进率显著增加(P＜0.01)，见表4。
表4 本发明的营养组合物对小鼠肠推进能力的影响(X±SD)

注：**表示与阴性对照组比较，P＜0.01，△△表示与模型对照组比较，P＜0.01
2.本发明的基于五株益生菌混合发酵培养物的营养组合物对小鼠排便的影响
排便试验：动物分组、给样方式和时间均同小肠推进试验。10天后，各动物禁食12小时，(期间自由饮水)，模型对照组和三个剂量组灌胃给予复方地芬诺酯(50mg/kg.bw)，阴性对照组给水；0.5小时后，各剂量组分别给予含受试物的墨汁(5％)，对照组仅给墨汁；随即动物单笼饲养，正常饮水进食，记录每只动物首次排黑便时间、6小时排黑便粒数及重量。
与阴性对照组比较，模型对照组小鼠平均首次排便时间明显延长(P＜0.01)，6小时排便粒数和6小时粪便重量明显减少(P＜0.01)。
与模型对照组比较，低剂量组首次排便时间明显缩短(P＜0.01)，6小时排便粒数和6小时粪便重量明显增加(P＜0.01)其余剂量组无显著性差异(P＞0.05)，见表5。
表5 本发明的营养组合物对小鼠排便的影响(X±SD)

注：**表示与阴性对照组比较，(P＜0.01)，
△△表示与模型对照组比较，(P＜0.01)，△(P＜0.05)
分别按人体推荐量(90ml/人/日)的10、20、30倍(即15、30、45ml/kg.bw/d)，经口投用本发明的益生菌混合发酵培养营养组合物10天。结果显示，三个剂量组小鼠平均小肠推进率显著高于模型对照组(P＜0.01)；15ml/kg.bw/d剂量组小鼠平均首次排便时间较模型对照组明显缩短(P＜0.01)，其6小时排便粒数和粪便重量明显增加(P＜0.01)。由此可以推测，本发明的五株益生菌混合发酵培养营养组合物表现有明显的润肠通便的作用。
实施例6  本发明的基于五株益生菌混合发酵培养物的营养组合物对小鼠肠道菌群的调节作用
实验动物为体重18-22克的雌性Balb/c小鼠(华西医科大学实验动物中心提供)。基础饲料喂饲3天后，按随机分组原则分15ml/kg.组、30ml/kg.组和45ml/kg.组，(分别相当于成人日服用建议量的10倍、20倍、和30倍)及对照组。实验组以相应剂量的营养组合物灌胃，对照组以蒸馏水灌胃。灌胃14天后，无菌采集小鼠粪便0.1～0.4克，10倍梯度系列稀释后，选择合适的稀释度，分别进行接种并培养。实验方法按照《保健食品检验与评价技术规范》(中华人民共和国卫生部，2003年版)进行。
五株益生菌混合发酵培养物的营养组合物对小鼠体内益生菌双歧杆菌和乳酸杆菌的数量的影响如下列表6至表9所示。
表6.本发明的营养组合物对小鼠肠道乳酸杆菌数量的影响(前后比较)

表7.本发明的营养组合物对小鼠肠道乳酸杆菌数量的影响(组间比较)

表8.本发明的营养组合物对小鼠肠道双歧杆菌数量的影响(前后比较)

表9.本发明的营养组合物对小鼠肠道双歧杆菌数量的影响(组间比较)

由上列表6-表9所示的数据可以看出，本发明的营养组合物可增加小鼠肠道双歧杆菌、乳酸杆菌的数量，具有调节小鼠肠道菌群的作用。
实施例7  本发明的基于五株益生菌混合发酵培养物的营养组合物对正常人肠道益生菌和各种生理指标的影响
受试对象筛选16-70岁年龄段、体检指标基本正常的志愿者43名(男20，女23)，实验采用自身对照。受试者每日早饭后投服益生菌混合发酵培养营养组合物90ml，连续服用14天。第15天无菌采集受试者粪便进行10倍系列稀释，选择合适的稀释度，分别接种在适当的培养基上，实验方法按照《保健食品检验与评价技术规范》(中华人民共和国卫生部，2003年版)进行。
本发明的营养组合物对人体肠道菌群数量的影响结果如下列表10和11所示。
表10.本发明的营养组合物对人体肠道菌群数量的影响

表11.本发明的营养组合物对正常受试人群各种体检指标的影响

结果可见，服用本发明的营养组合物14天后，受试者肠道内肠杆菌、肠球菌、产气荚膜梭菌及拟杆菌数量与服用前相比，差别无显著性；而人体益生菌乳酸杆菌和双歧杆菌的数量有显著性增加。另外，受试人群服用多菌株混合发酵营养组合物14天后，血常规、肝功能、肾功能指标与服用前相比差别均无显著性(P＞0.05)。
因此，本发明的基于五株益生菌混合发酵培养物的营养组合物有可能制备成一种营养组合物产品，可安全有效地调节人和哺乳动物的肠道菌群、改善微生态平衡和预防/治疗便秘。