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本发明公开了一种对HB-EGF具有中和活性的单克隆抗体。优选地，本发明的单克隆抗体是不能结合位于表达HB-EGF的细胞的表面上的HB-EGF蛋白的抗体。本发明还提供了一种包含本发明的抗体作为活性成分的癌症治疗剂和细胞增殖抑制剂，以及治疗癌症的方法，该方法包括施用本发明的单克隆抗体。可以用本发明的癌症治疗剂治疗的癌症包括胰癌、肝癌、食道癌、黑素瘤、结直肠癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌和脑瘤。

1.  一种对HB-EGF具有中和活性的单克隆抗体。

2.  一种选自以下(1)-(29)的抗体：
(1)包含具有作为CDR1的SEQ ID NO：2的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：4的氨基酸序列和作为CDR3的SEQ ID NO：6的氨基酸序列的重链可变区的抗体；
(2)包含如(1)所述的重链可变区的抗体，其具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列作为CH；
(3)包含如(1)所述的重链可变区的抗体，其具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列作为CH；
(4)包含具有作为CDR1的SEQ ID NO：12的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：14的氨基酸序列和作为CDR3的SEQ ID NO：16的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；
(5)包含如(4)所述的轻链可变区的抗体，其具有SEQ ID NO：18的氨基酸序列作为CL；
(6)包含如(4)所述的轻链可变区的抗体，其具有SEQ ID NO：20的氨基酸序列作为CL；
(7)包含如(1)所述的重链和如(4)所述的轻链的抗体；
(8)包含如(2)所述的重链和如(5)所述的轻链的抗体；
(9)包含如(3)所述的重链和如(6)所述的轻链的抗体；
(10)包含具有作为CDR1的SEQ ID NO：22的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：24的氨基酸序列和作为CDR3的SEQ ID NO：26的氨基酸序列的重链可变区的抗体；
(11)包含如(10)所述的重链可变区的抗体，其具有SEQ ID NO：28的氨基酸序列作为CH；
(12)包含如(10)所述的重链可变区的抗体，其具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列作为CH；
(13)包含具有作为CDR1的SEQ ID NO：30的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：32的氨基酸序列和作为CDR3的SEQ ID NO：34的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；
(14)包含如(13)所述的轻链可变区的抗体，其具有SEQ ID NO：18的氨基酸序列作为CL；
(15)包含如(13)所述的轻链可变区的抗体，其具有SEQ ID NO：20的氨基酸序列作为CL；
(16)包含如(10)所述的重链和如(13)所述的轻链的抗体；
(17)包含如(11)所述的重链和如(14)所述的轻链的抗体；
(18)包含如(12)所述的重链和如(15)所述的轻链的抗体；
(19)包含具有作为CDR1的SEQ ID NO：36的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：38的氨基酸序列和作为CDR3的SEQ ID NO：40的氨基酸序列的重链可变区的抗体；
(20)包含如(19)所述的重链可变区的抗体，其具有SEQ ID NO：28的氨基酸序列作为CH；
(21)包含如(19)所述的重链可变区的抗体，其具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列作为CH；
(22)包含具有作为CDR1的SEQ ID NO：42的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：44的氨基酸序列和作为CDR3的SEQ ID NO：46的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；
(23)包含如(22)所述的轻链可变区的抗体，其具有SEQ ID NO：18的氨基酸序列作为CL；
(24)包含如(22)所述的轻链可变区的抗体，其具有SEQ ID NO：20的氨基酸序列作为CL；
(25)包含如(19)所述的重链和如(22)所述的轻链的抗体；
(26)包含如(20)所述的重链和如(23)所述的轻链的抗体；
(27)包含如(21)所述的重链和如(24)所述的轻链的抗体；
(28)通过在(1)-(27)中任一项所述的抗体中置换一个或多个氨基酸、删除一个或多个氨基酸、添加一个或多个氨基酸和/或插入一个或多个氨基酸而获得的、与(1)-(27)中任一项所述的抗体活性相当的抗体；和
(29)与(1)-(27)中任一项所述的抗体结合相同的HB-EGF蛋白表位的抗体。

3.  如权利要求1或2所述的单克隆抗体，其不结合表达具有SEQID NO：59的HB-EGF的细胞之细胞表面上的HB-EGF蛋白。

4.  如权利要求3所述的单克隆抗体，其中所述表达具有SEQ IDNO：59的HB-EGF的细胞选自RMG-1和重组表达具有SEQ ID NO：59的HB-EGF的Ba/F3、DG44和SKOV-3。

5.  如权利要求1-4中任一项所述的单克隆抗体，其中该抗体是低分子量抗体。

6.  一种含有如权利要求1-5中任一项所述的单克隆抗体作为活性成分的癌症治疗剂。

7.  如权利要求6所述的癌症治疗剂，其中所述癌症是胰癌、肝癌、食道癌、黑素瘤、结直肠癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌或脑瘤。

8.  一种含有如权利要求1-5中任一项所述的单克隆抗体作为活性成分的细胞增殖抑制剂。

9.  如权利要求8所述的细胞增殖抑制剂，其中所述细胞是胰癌细胞、肝癌细胞、食道癌细胞、黑素瘤细胞、结直肠癌细胞、胃癌细胞、卵巢癌细胞、膀胱癌细胞或脑瘤细胞。

包含抗HB-EGF抗体作为活性成分的癌症治疗剂
技术领域
本发明涉及治疗癌症的方法和抗癌剂。
发明背景
可结合肝素的表皮生长因子样生长因子，或HB-EGF，是属于EGF配体家族的一种生长因子。HB-EGF基因敲除小鼠显示非常有害的表型，如心脏功能衰竭伴心脏肥大和出生后快速死亡(非专利文献1)。这表明HB-EGF对于妊娠期间心脏的形成做出了极大的贡献。另一方面，在成年人中，其表达分布在较广范围的组织中，如肺、心脏、脑和骨骼肌中(非专利文献2)，HB-EGF不仅在妊娠期间，而且在维持成年人的生物功能方面，都具有非常重要的作用(非专利文献3)。
HB-EGF在体内以两种不同的结构存在：在表达HB-EGF的细胞的细胞表面表达的膜结合HB-EGF(下文称为proHB-EGF)和不含细胞的分泌型HB-EGF(下文称为sHB-EGF或活性型HB-EGF)。图1示意性地显示了proHB-EGF和sHB-EGF的结构。proHB-EGF前体蛋白由208个氨基酸组成，从N-末端开始，由信号肽、前肽、肝素结合域、EGF样结构域、近膜结构域、跨膜结构域和胞质域组成。信号肽从proHB-EGF前体蛋白上裂解下来导致proHB-EGF表达为1型跨膜蛋白质。随后，proHB-EGF受到蛋白酶的消化，这被称为胞外域脱落，由73-87个氨基酸残基组成的sHB-EGF被释放到胞外环境中。这种sHB-EGF仅由肝素结合域和EGF样结构域这两个结构域组成，并作为活性配体结合EGF受体(Her1)和EGF受体4(Her4)。这导致通过下游的ERK/MAPK信号路径，在例如NIH3T3细胞、平滑肌细胞、上皮细胞、角化细胞、肾小管细胞等多种细胞中诱导增殖(非专利文献4)。由于将突变引入参与胞外域脱落的区域内，只表达proHB-EGF的细胞发生增殖能力实质性减少。另外，只表达proHB-EGF的转基因小鼠具有与HB-EGF敲除小鼠同样的表型。基于这些发现，HB-EGF作为生长因子的功能被认为主要由分泌型HB-EGF承担(非专利文献5和6)。
另一方面，也知道proHB-EGF在体内具有不同于sHB-EGF的独特功能。即，起初已知proHB-EGF作为白喉毒素(DT)的受体发挥功能(非专利文献7和8)。但是，随后的研究证明proHB-EGF在细胞表面与诸如DRAP27/CD9的分子以及整联蛋白α₃β₁和硫酸肝素形成复合物，并参与细胞粘附和迁移。也已表明通过EGF受体(下文称为EGFR)经近分泌机制作用，proHB-EGF抑制邻近细胞的生长并诱导邻近细胞的死亡。因此，关于HB-EGF作为EGFR配体的作用方面，已知膜结合proHB-EGF和分泌型sHB-EGF传送完全相反的信号(非专利文献5和8)。
HB-EGF对例如癌细胞的多种细胞株的细胞增殖、细胞运动和浸润具有强烈的促进活性。另外，已报道广泛范围的癌症类型(例如，胰癌、肝癌、食道癌、黑素瘤、结直肠癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌和脑瘤)比正常组织中的HB-EGF表达增加，提示HB-EGF深入地参与了癌增生或恶性转化(非专利文献4和10)。
因此，基于这些发现，继续研究了通过抑制HB-EGF活性抑制癌细胞生长。对于使用抗HB-EGF中和抗体抑制HB-EGF作用的努力，尤其报道了以下效应：对3T3细胞中的DNA合成的抑制(非专利文献11)，对角化细胞生长的抑制(非专利文献12)、对神经胶质瘤细胞生长的抑制(非专利文献13)和对骨髓瘤细胞中的DNA合成的抑制(非专利文献14)。
也已继续研究了特异性结合HB-EGF的减毒白喉毒素(CRM197)作为HB-EGF抑制剂的应用。事实上，在小鼠异种移植模型(移植有卵巢癌细胞株)上的有效性测试中，接受CRM197的组呈现出较好的肿瘤缩小效应(非专利文献15)。另外，也使用CRM197在癌症患者中进行了临床试验(非专利文献6)。
因此，HB-EGF显然可用作抗癌剂的靶分子，迄今为止实际上也已检测了HB-EGF抑制剂分子如CRM197的效力。但是，CRM197是非天然存在于人体中的一种毒素，因此认为不只是由于其毒性而且由于其抗原性产生的非常实质性的问题阻碍了CRM197的临床应用。
另外，尽管如上所述可以抑制HB-EGF活性的中和抗体实际上已经存在了一定的时间，但是所有这些都是从山羊抗血清中纯化的多克隆抗体，因此不能在临床上使用。因此，在医疗领域需要可以显示高中和活性并且可以实现临床应用所需的人源化和高产生水平的HB-EGF中和单克隆抗体。
但是，当涉及抗HB-EGF中和抗体的临床应用时，由抗体和效应细胞介导的毒性，如抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(以下缩写为ADCC活性)，和补体依赖的细胞毒性(以下缩写为CDC)，是一种危险，这是由于以下事实：如上所述，HB-EGF也在宽范围的正常组织中以proHB-EGF的形式体内表达，proHB-EGF是表达HB-EGF的细胞的细胞表面上的HB-EGF蛋白。必须要解决的其它问题是肿瘤组织处的抗体积累效率的降低和正常组织摄取抗体引起的血液浓度的降低。
本说明书中引用的参考文献在下面列出。本文完整引用这些文献的内容作为参考。没有承认这些文献作为本发明的现有技术：
非专利文献1：Iwamoto R，Yamazaki S，Asakura M等人，Heparin-binding EGF-like growth factor and ErbB signaling is essentialfor heart function.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2003；100：3221-6.
非专利文献2：Abraham JA，Damm D，Bajardi A，Miller J，Klagsbrun M，Ezekowitz RA.Heparin-binding EGF-like growth factor：characterization of rat and mouse cDNA clones，protein domainconservation across species，and transcript expression in tissues.Biochem Biophys Res Commun，1993；190：125-33.
非专利文献3：Karen M.，Frontiers in Bioscience，3，288-299，1998.
非专利文献4：Raab G，Klagsbrun M.Heparin-binding EGF-likegrowth factor.Biochim Biophys Acta，1997；1333：F179-99.
非专利文献5：Yamazaki S，Iwamoto R，Saeki K等人，Mice withdefects in HB-EGF ectodomain shedding show severe developmentalabnormalities.J Cell Biol，2003；163：469-75.
非专利文献6：Ongusaha P.，Cancer Res，(2004)64，5283-5290.
非专利文献7：Iwamoto R.，Higashiyama S.，EMBO J.13，2322-2330(1994).
非专利文献8：Naglich JG.，Metherall JE.，Cell，69，1051-1061(1992).
非专利文献9：Iwamoto R，Handa K，Mekada E.Contact-dependentgrowth inhibition and apoptosis of epidermal growth factor(EGF)receptor-expressing cells by the membrane-anchored form ofheparin-binding  EGF-like  growth factor.J.Biol.Chem.1999；274：25906-12.
非专利文献10：Miyamoto S，Cancer Sci.97，341-347(2006).
非专利文献11：Blotnick S.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，(1994)91，2890-2894.
非专利文献12：Hashimoto K.，J.Biol.Chem.(1994)269，20060-20066.
非专利文献13：Mishima K.，Act Neuropathol.(1998)96，322-328.
非专利文献14：Wang YD.Oncogene，(2002)21，2584-2592.
非专利文献15：Miyamoto S.，Cancer Res.(2004)64，5720-
非专利文献16：Buzzi S.，Cancer Immunol Immunother，(2004)53，1041-1048.
发明内容
本发明的一个目的是提供抗HB-EGF抗体及其应用。一个更具体的目的是提供一种使用抗HB-EGF抗体、包含抗HB-EGF抗体的新型细胞增殖抑制剂、包含抗HB-EGF抗体的新型抗癌剂以及新型抗HB-EGF抗体治疗癌症的新方法。
本发明人已发现对癌细胞中强表达的HB-EGF显示中和活性的抗体可以明显地抑制癌细胞的生长能力。他们还发现具有中和活性的抗体不结合表达HB-EGF的细胞之细胞表面上的HB-EGF蛋白。基于这一发现，本发明人已进一步发现抗HB-EGF抗体对于治疗HB-EGF表达上调的癌症(最明显的例子是卵巢癌)有效。基于这些发现实现了本发明。
本发明人用HB-EGF蛋白免疫小鼠，获得了单克隆抗体，它抑制HB-EGF介导的细胞生长诱导，迄今为止尚未有这样的报道。而且，本发明人确定获得的中和抗体不结合proHB-EGF(它是表达HB-EGF的细胞之细胞表面上的HB-EGF蛋白)，而具有只结合分泌型HB-EGF(sHB-EGF)(其不含表达HB-EGF的细胞)的能力。本发明的抗体的特殊性质解决了有待解决的现有问题，即，抗体介导的毒性，例如，ADCC活性和CDC活性，以及血中浓度和肿瘤聚积率的降低。
因此，本申请提供了选自下面的(1)-(29)的单克隆抗体和低分子量抗体衍生物：
(1)包含具有作为CDR1的SEQ ID NO：2的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：4的氨基酸序列和作为CDR3的SEQ ID NO：6的氨基酸序列的重链可变区的抗体；
(2)包含如(1)所述的重链可变区的抗体，其具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列作为CH；
(3)包含如(1)所述的重链可变区的抗体，其具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列作为CH；
(4)包含具有作为CDR1的SEQ ID NO：12的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：14的氨基酸序列和作为CDR3的SEQ ID NO：16的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；
(5)包含如(4)所述的轻链可变区的抗体，其具有SEQ ID NO：18的氨基酸序列作为CL；
(6)包含如(4)所述的轻链可变区的抗体，其具有SEQ ID NO：20的氨基酸序列作为CL；
(7)包含如(1)所述的重链和如(4)所述的轻链的抗体；
(8)包含如(2)所述的重链和如(5)所述的轻链的抗体；
(9)包含如(3)所述的重链和如(6)所述的轻链的抗体；
(10)包含具有作为CDR1的SEQ ID NO：22的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：24的氨基酸序列和作为CDR3的SEQ ID NO：26的氨基酸序列的重链可变区的抗体；
(11)包含如(10)所述的重链可变区的抗体，其具有SEQ ID NO：28的氨基酸序列作为CH；
(12)包含如(10)所述的重链可变区的抗体，其具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列作为CH；
(13)包含具有作为CDR1的SEQ ID NO：30的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：32的氨基酸序列和作为CDR3的SEQ ID NO：34的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；
(14)包含如(13)所述的轻链可变区的抗体，其具有SEQ ID NO：18的氨基酸序列作为CL；
(15)包含如(13)所述的轻链可变区的抗体，其具有SEQ ID NO：20的氨基酸序列作为CL；
(16)包含如(10)所述的重链和如(13)所述的轻链的抗体；
(17)包含如(11)所述的重链和如(14)所述的轻链的抗体；
(18)包含如(12)所述的重链和如(15)所述的轻链的抗体；
(19)包含具有作为CDR1的SEQ ID NO：36的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：38的氨基酸序列和作为CDR3的SEQ ID NO：40的氨基酸序列的重链可变区的抗体；
(20)包含如(19)所述的重链可变区的抗体，其具有SEQ ID NO：28的氨基酸序列作为CH；
(21)包含如(19)所述的重链可变区的抗体，其具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列作为CH；
(22)包含具有作为CDR1的SEQ ID NO：42的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：44的氨基酸序列和作为CDR3的SEQ ID NO：46的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；
(23)包含如(22)所述的轻链可变区的抗体，具有SEQ ID NO：18的氨基酸序列作为CL；
(24)包含如(22)所述的轻链可变区的抗体，具有SEQ ID NO：20的氨基酸序列作为CL；
(25)包含如(19)所述的重链和如(22)所述的轻链的抗体；
(26)包含如(20)所述的重链和如(23)所述的轻链的抗体；
(27)包含如(21)所述的重链和如(24)所述的轻链的抗体；
(28)通过在(1)-(27)中任一项所述的抗体中置换一个或多个氨基酸、删除一个或多个氨基酸、添加一个或多个氨基酸和/或插入一个或多个氨基酸而获得的、与(1)-(27)中任一项所述的抗体活性相当的抗体；和
(29)与(1)-(27)中任一项所述的抗体结合相同的HB-EGF蛋白表位的抗体。
本发明另外还提供如以上(1)-(29)所述的单克隆抗体，该抗体不结合表达具有SEQ ID NO：59的HB-EGF的细胞之细胞表面上的HB-EGF蛋白。更具体地，本发明提供如以上(1)-(29)所述的单克隆抗体，其中该抗体不结合表达具有SEQ ID NO：59的HB-EGF的细胞，所述细胞选自RMG-1和重组表达具有SEQ ID NO：59的HB-EGF的Ba/F3、DG44或SKOV-3中的任一种。
本发明进一步提供含有可结合HB-EGF蛋白的抗体作为活性成分的抗癌剂。可结合HB-EGF蛋白的抗体优选地是显示中和活性的抗体。该中和抗体更优选地是不结合表达HB-EGF的细胞的抗体。癌症优选地是胰癌、肝癌、食道癌、黑素瘤、结直肠癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌或脑瘤。卵巢癌是特别优选的。
另一方面，本发明提供通过使表达HB-EGF的细胞接触可结合HB-EGF蛋白的抗体而抑制表达HB-EGF蛋白的细胞增殖的方法。可结合HB-EGF蛋白的抗体优选地是显示中和活性的抗体。表达HB-EGF蛋白的细胞优选地是癌细胞。
本发明的HB-EGF蛋白特异性抗体可以作为细胞毒性剂或细胞增殖抑制剂，不仅用于表达HB-EGF蛋白的卵巢癌，而且用于多种表达HB-EGF蛋白的癌细胞，如胰癌细胞、肝癌细胞、食道癌细胞、黑素瘤细胞、结直肠癌细胞、胃癌细胞、膀胱癌细胞和脑瘤细胞。
本发明的细胞毒性抗HB-EGF抗体也可以用作对抗多种癌症的治疗剂，例如卵巢癌、胰癌、肝癌、食道癌、黑素瘤、结直肠癌、胃癌、膀胱癌和脑瘤。
可以使用编码本发明的抗体的基因和由这种基因转化的重组细胞产生实现上述效果或甚至更好的效果的重组抗体。

附图简述
图1是示意性地描述用作免疫原的proHB-EGF、sHB-EGF和HB-EGF_Fc的结构的图；
图2a是示意性地描述HB-EGF与EGFR_Ba/F3细胞结合的影响的图；
图2b是显示EGFR_Ba/F3细胞增殖对HB-EGF浓度的依赖性的曲线图；
图3a是显示HB-EGF抗体(HA-1、HA-3、HA-9、HA-10和HA-20)对EGFR_Ba/F3细胞的HB-EGF依赖性生长的中和活性的曲线图；
图3b是显示HB-EGF抗体(HB-10、HB-13、HB-20、HB-22和HC-74)对EGFR_Ba/F3细胞的HB-EGF依赖性生长的中和活性的曲线图；
图3c是显示HB-EGF抗体(HC-15、HC-19、HC-26和HC-42)对EGFR_Ba/F3细胞的HB-EGF依赖性生长的中和活性的曲线图；
图4是HB-EGF中和抗体的可变区序列的比较；
图5是显示抗体HA-20、HB-20和HC-15对活性型HB-EGF的结合活性的曲线图；
图6是显示抗体HA-20、HB-20和HC-15对proHB-EGF的结合活性的图；
图7是显示HB-EGF抗体抑制固相上HB-EGF与EGFR之间的结合的示意图；
图8是显示对于EGFR/HB-EGF结合模式的基于ELISA的分析模型的示意图；
图9是显示在对于EGFR/HB-EGF结合模式的基于ELISA的分析模型中检测到的HB-EGF浓度曲线的图；
图10是显示抗体HA-20、HB-20和HC-15抑制HB-EGF与EGFR结合的图；
图11是比较抗体HA-20、HB-20和HC-15抑制EGFR_Ba/F3细胞的生长的曲线图；
图12a是显示在含有8％FCS的培养基中，抗体HA-20、HB-20和HC-15抑制卵巢癌细胞株RMG-1的生长的图；
图12b是显示在含有2％FCS的培养基中，抗体HA-20、HB-20和HC-15抑制卵巢癌细胞株RMG-1的生长的图。
发明优选的实施方式
HB-EGF的分子形式
HB-EGF是属于EGF配体家族的一种生长因子；编码人HB-EGF的基因的序列以GenBank登记号NM_001945(SEQ ID NO：59)公开，HB-EGF的氨基酸序列以GenBank登记号NP_001936(SEQ IDNO：60)公开。在本发明的范围内，“HB-EGF蛋白”是包括全长蛋白质及其片段的术语。在本发明的范围内，“片段”指包含HB-EGF蛋白质的任何区域的多肽，其中，该片段可能不显示天然存在的HB-EGF蛋白的功能。在本文中用作片段的特定实施方式的sHB-EGF是由73-87个氨基酸残基组成的分子，当在表达HB-EGF的细胞的细胞表面上表达的proHB-EGF在被称为胞外域脱落的过程中被蛋白酶裂解时，在体内产生。
已知多种sHB-EGF分子；这些sHB-EGF分子具有下面的结构：其中，羧基末端是位于proHB-EGF分子的第149位点的脯氨酸残基(proHB-EGF分子由SEQ ID NO：60所示的208个氨基酸组成)，而氨基末端是位于proHB-EGF分子的第63位点的天冬酰胺残基、位于proHB-EGF分子的第73位点的精氨酸残基、位于proHB-EGF分子的第74位点的缬氨酸残基或位于proHB-EGF分子的第77位点的丝氨酸残基。
抗HB-EGF抗体的产生
本发明的抗HB-EGF抗体是特异性结合HB-EGF蛋白的单克隆抗体，但对其来源、类型或构型没有限制。具体地说，可以使用非人来源的单克隆抗体(例如小鼠抗体、大鼠抗体、骆驼抗体)，也可以使用通过基因工程技术获得的人抗体、嵌合抗体和人源化抗体。
可以使用已知方法获得本发明的单克隆抗HB-EGF抗体。本发明的抗HB-EGF抗体尤其优选哺乳动物来源的单克隆抗体。哺乳动物来源的单克隆抗体尤其包括由杂交瘤产生的单克隆抗体和由已经通过基因工程技术用包含该抗体基因的表达载体转化的宿主产生的单克隆抗体。
基本上可以通过使用已知技术制备产生单克隆抗体的杂交瘤，其生产可以如下进行。首先根据通常的免疫方法，使用HB-EGF蛋白作为致敏抗原免疫动物。通过通常的细胞融合技术将从免疫动物获得的免疫细胞与已知的伴侣细胞融合以获得杂交瘤。使用通常的筛选技术，通过筛选产生需要的抗体的细胞，选择这些杂交瘤中的产生抗HB-EGF抗体的杂交瘤。
具体地说，例如可以如下进行单克隆抗体的产生。首先，通过HB-EGF基因的表达可以获得作为用于获得抗体的致敏抗原的HB-EGF蛋白。例如，作为GenBank登记号NM 001945(SEQ ID NO：59)公开了人HB-EGF基因的碱基序列。因此，将编码HB-EGF的基因序列插入已知的表达载体中，然后用表达载体转化合适的宿主细胞；随后从宿主细胞内或从培养上清液中纯化需要的人HB-EGF蛋白。也可以以同样的方式使用纯化的天然HB-EGF蛋白。可以使用一种通常的色谱技术或其组合纯化蛋白质，例如，离子色谱、亲和色谱等，采用一个运行或多个运行。用于本发明的免疫原也可以是通过将一种来自HB-EGF蛋白的需要的部分多肽与一种不同的多肽融合获得的融合蛋白。例如，来自抗体的肽标签或Fc片段可以用来产生将要用作免疫原的融合蛋白。可以通过将编码需要的两种或多种多肽片段的基因符合读框地融合并将融合基因插入上述表达载体中来制备表达融合蛋白的载体。在Molecular Cloning第2版(Sambrook，J.等人，Molecular Cloning第2版，9.47-9.58，Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中描述了产生融合蛋白的方法。
以所述方式纯化的HB-EGF蛋白可以用作用来免疫哺乳动物的致敏性抗原。来自HB-EGF的部分肽也可以用作致敏性抗原。例如，下面的肽可以用作致敏性抗原：通过化学合成由人HB-EGF的氨基酸序列获得的肽；通过将人HB-EGF基因的一部分并入表达载体内并表达该部分而获得的肽；和通过用蛋白降解酶降解人HB-EGF蛋白获得的肽。
对于用作部分肽的HB-EGF区域或部分肽的大小没有限制。优选的区域可以选自构成HB-EGF的胞外域的氨基酸序列(SEQ ID NO：60的氨基酸序列中的位点22-149)。构成将要用作致敏性抗原的肽的氨基酸的数目优选为至少3个，例如至少5个或至少6个。更具体地说，8-50个残基、优选10-30个残基的肽可以用作致敏性抗原。
对于可以用上述的致敏性抗原免疫的哺乳动物没有特别的限制。为了通过细胞融合技术获得单克隆抗体，优选地考虑与将要在细胞融合中使用的伴侣细胞的相容性选择免疫动物。一般优选啮齿类作为免疫动物。特别地，小鼠、大鼠、仓鼠或兔可以用作免疫动物。猴也可以用作免疫动物。
可以根据已知方法用致敏性抗原免疫上述动物。例如，作为一般的方法，可以通过皮下或腹膜内注射致敏性抗原免疫哺乳动物。具体地说，可以以4-21天的时间表多次向哺乳动物施用致敏性抗原。例如，用磷酸盐缓冲液(PBS)或生理盐水将致敏性抗原稀释至适当的稀释倍数。也可以与佐剂组合施用致敏性抗原。例如，可以通过与弗氏完全佐剂混合并乳化来制备致敏性抗原。合适的载体也可以用于致敏性抗原免疫。尤其是在使用低分子量的部分肽作为致敏性抗原的情况中，理想地用与诸如白蛋白、匙孔血蓝蛋白等蛋白质载体结合的致敏性肽抗原实现免疫。
以所述的方式免疫动物并观察到预期的血清抗体效价升高之后，从哺乳动物收集免疫细胞，并进行细胞融合。脾细胞是尤其优选的免疫细胞。
使用哺乳动物骨髓瘤细胞作为与上述免疫细胞融合的细胞。骨髓瘤细胞优选地具有合适的选择标记以支持筛选。选择标记指在特定培养条件下可以出现(或不出现)的性状。已知的选择标记包括次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖基转移酶缺陷(下文缩写为HGPRT缺陷)和胸苷激酶缺陷(下文缩写为KT缺陷)。HGPRT缺陷或TK缺陷的细胞显示次黄嘌呤-氨嘌呤-胸腺嘧啶敏感性(下文缩写为HAT敏感性)。HAT敏感的细胞不能在HAT选择培养基上进行DNA合成并死亡；但是，当与正常细胞融合时，DNA合成能够使用正常细胞的补救途径而继续，也能在HAT选择培养基上发生生长。
可以在含有6-硫代鸟嘌呤或8-氮鸟嘌呤(8AG)的培养基上选择HGPRT缺陷的细胞，而可以在含有5′-溴脱氧尿苷的培养基上选择TK缺陷的细胞。正常细胞将这些嘧啶类似物掺入其DNA内并死亡，而这些酶缺陷的细胞不会掺入这些嘧啶类似物于是能够在选择培养基上存活下来。称为G418抗性的另一种选择标记基于新霉素抗性基因提供对2-脱氧链霉胺型抗生素(庆大霉素类似物)的抗性。适于细胞融合的各种骨髓瘤细胞是已知的。例如，可以使用以下骨髓瘤细胞来产生本发明的单克隆抗体：
P3(P3x63Ag8.653)(J.Immunol.(1979)123，1548-1550)、
P3x63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology(1978)81，1-7)、
NS-1(Kohler，G.和Milstein，C.Eur.J.Immunol.(1976)6，511-519)、
MPC-11(Margulies，D.H.等人，Cell(1976)8，405-415)、
SP2/0(Shulman，M.等人，Nature(1978)276，269-270)、
FO(de St.Groth，S.F.等人，J.Immunol.Methods(1980)35，1-21)、
S194(Trowbridge，I.S.J.Exp.Med.(1978)148，313-323)和
R210(Galfre，G.等人，Nature(1979)277，131-133)。
可以根据已知方法，例如，根据Kohler和Milstein的方法(Kohler，G.和Milstein，C.，Methods Enzymol.(1981)73，3-46)，进行上述免疫细胞与骨髓瘤细胞之间的细胞融合。
更具体地，例如可以在细胞融合促进剂的存在下，在通常的营养培养液体中进行细胞融合。例如，聚乙二醇(PEG)或仙台病毒(HVJ)可以用作融合促进剂。需要的话，为了提高融合效率，可以加入如二甲亚砜的辅剂。
可以自由选择免疫细胞与骨髓瘤细胞的比例。例如，优选地相对于骨髓瘤细胞以1-10倍使用免疫细胞。例如，用于细胞融合的培养液可以是RPMI1640培养基或MEM培养基，它们非常适于上述骨髓瘤细胞株的生长，或者可以是用于这种类型的细胞培养的常用的培养基。也可以向培养基中加入如胎牛血清(FCS)的血清补充物。
通过在上述培养液中充分混合规定量的免疫细胞和骨髓瘤细胞并混合已预加热至大约37℃的PEG溶液，通过细胞融合形成需要的融合细胞(杂交瘤)。例如，可以以一般为30-60％(w/v)的浓度将具有1000-6000的平均分子量的PEG加入到细胞融合过程中。然后，通过重复加入上述的合适的培养液、离心及除去上清液的过程除去杂交瘤生长不需要的细胞融合剂等。
可通过使用适合用于细胞融合的骨髓瘤所显示的选择标记的选择性培养基来选择以所述方式获得的杂交瘤。例如，可通过在HAT培养基(含有次黄嘌呤、氨嘌呤和胸腺嘧啶的培养基)上培养来选择HGPRT缺陷或TK缺陷的细胞。因此，当HAT敏感的骨髓瘤细胞用于细胞融合时，由与正常细胞的细胞融合产生的细胞能够在HAT培养基上选择性地生长。在HAT培养基上的培养持续足以使除了需要的杂交瘤之外的细胞(未融合的细胞)死亡的一段时间。具体地说，一般可通过几天至几周的培养来选择需要的杂交瘤。通常的有限稀释法可以用来筛选并单克隆产生需要的抗体的杂交瘤。或者，也可以通过WO 03/104453中所述的方法产生识别HB-EGF的抗体。
可以通过基于已知的抗原-抗体反应的筛选程序适当地进行需要的抗体的筛选和单克隆。例如，抗原可以与载体(例如，如聚苯乙烯的珠或可商购的96孔微量滴定板)结合，然后与杂交瘤培养上清液反应。接着，在洗涤载体后，细胞与(例如)酶标记的第二抗体反应。如果培养上清液中存在需要的致敏性抗原反应性抗体，那么第二抗体将通过抗体结合到载体上。最终可通过检测结合到载体上的第二抗体确定培养上清液中需要的抗体的存在/不存在。例如，通过有限稀释法可以克隆产生需要的抗原结合性抗体的杂交瘤。在本文中，适当地使用基本上相同的HB-EGF蛋白作为抗原，最重要的是用于免疫的HB-EGF蛋白。例如，包含HB-EGF的胞外域或包含来自该区域的部分氨基酸序列的寡肽可以用作抗原。
除了上述通过用抗原免疫非人类动物产生杂交瘤的方法，也可以通过人类淋巴细胞的抗原致敏获得需要的抗体。具体地说，首先在体内用HB-EGF蛋白致敏人类淋巴细胞。然后将免疫致敏的淋巴细胞与合适的融合伴侣融合。例如，具有永久细胞分裂能力的人源骨髓瘤细胞可以用作融合伴侣(参考日本专利公开第Hei 1-59878号)。通过该方法获得的抗HB-EGF抗体是具有结合HB-EGF蛋白的活性的人抗体。
也可以通过向具有完整的人抗体基因所有组成成分(repertoire)的转基因动物施用作为抗原的HB-EGF蛋白获得人抗HB-EGF抗体。可以通过与合适的融合伴侣进行细胞融合或者通过如用EB病毒感染处理使来自免疫动物的抗体生产细胞无限增殖化。可以从产生的无限增殖化细胞中分离针对HB-EGF蛋白的人抗体(参考WO94/25585、WO 93/12227、WO 92/03918和WO 94/02602)。而且，也可以通过克隆无限增殖化细胞来克隆产生具有希望的反应特异性的抗体的细胞。当采用转基因动物作为免疫动物时，动物的免疫系统将人HB-EGF识别为外源性的。这使得能够容易地获得针对人HB-EGF的人抗体。以所述方式构建的产生单克隆抗体的杂交瘤可以在通常的培养基中传代培养。杂交瘤也可以在液氮中长期保存。
可以根据通常的方法培养上述杂交瘤，且可以从产生的培养上清液中获得需要的单克隆抗体。或者，可以将杂交瘤注射到与该细胞相容的哺乳动物中，且可以从哺乳动物的腹水中获得单克隆抗体。前述方法很好地适于产生高纯度的抗体。
本发明也可以使用由从抗体生产细胞克隆的抗体基因编码的抗体。可以通过将克隆的抗体基因掺入合适的载体中接着通过转染宿主来实现抗体的表达。已经建立了分离抗体基因并将其插入载体内和转化宿主细胞的方法(参考，例如，Vandamme，A.M.等人，Eur.J.Biochem.(1990)192，767-775)。
例如，可以从产生抗HB-EGF抗体的杂交瘤细胞获得编码抗HB-EGF抗体的可变区(V区)的cDNA。一般首先从杂交瘤中提取总RNA。例如，可以使用以下方法从细胞中提取mRNA：胍超离心法(Chirgwin，J.M.等人，Biochemistry(1979)18，5294-5299)和AGPC法(Chomczynski，P.等人，Anal.Biochem.(1987)162，156-159)。
可以使用例如mRNA纯化试剂盒(GE Healthcare Biosciences)纯化提取的mRNA。或者，用于从细胞中直接提取mRNA的试剂盒也是可商购的，如QuickPrep mRNA纯化试剂盒(GE HealthcareBiosciences)。如这些的试剂盒也可以用来从杂交瘤中获得总mRNA。可以使用逆转录酶由获得的mRNA合成编码抗体V区的cDNA。例如，可以使用AMV逆转录酶第一链cDNA合成试剂盒(SeikagakuCorporation)合成cDNA。另外，5′-Ampli FINDER RACE试剂盒(Clontech)和基于PCR的5′-RACE法(Frohman，M.A.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85，8998-9002；Belyavsky，A.，等人，Nucleic Acids Res.(1989)17，2919-2932)也可以用来合成和扩增cDNA。而且，在这样的cDNA合成方法中可以将以下合适的限制性酶切位点引入cDNA的两端。
从获得的PCR产物中纯化靶cDNA片段，然后与载体DNA连接；将以这种方式制备的重组体载体转染到(例如)大肠杆菌内，并选择菌落；可以由显示菌落形成的大肠杆菌制备需要的重组载体。另外，如二脱氧核苷酸链终止法的已知方法可以用来确认重组载体是否具有靶cDNA的碱基序列。
为了获得编码可变区的基因，也可以采用使用可变区基因扩增引物的PCR。首先，为了获得cDNA文库，使用提取的mRNA作为模板合成cDNA。可以方便地使用可商购的试剂盒来合成cDNA文库。实际上，从只是少量的细胞获得的mRNA的量非常少，因而直接纯化具有低收率。因此，一般在加入明显不包含抗体基因的载体RNA之后进行纯化。或者，在那些可以提取一定量的RNA的情况下，甚至可以只用来自抗体生产细胞的RNA实现有效的提取。例如，在某些情况下，不是必须向从至少10个或至少30个、优选至少50个抗体生产细胞的RNA提取中加入载体RNA。
使用获得的cDNA文库作为模板，通过PCR可以扩增抗体基因。用于基于PCR扩增抗体基因的引物是已知的。例如，可以根据文献中的信息(例如，J.Mol.Biol.(1991)222，581-597)设计用于扩增人抗体基因的引物。这些引物具有随免疫球蛋白亚类变化的碱基序列。因此，当采用未知亚类的cDNA文库作为模板时，考虑所有的可能性进行PCR。
具体地说，例如，当目标是获得编码人IgG的基因时，可以使用具有扩增编码重链的γ1-γ5和轻链的κ链和λ链的基因的能力的引物。为了扩增IgG可变区基因，对于3′-侧引物，通常使用与对应于铰链区的区域退火的引物。另一方面，对于5′-侧引物，可以使用适于每个亚类的引物。
基于用于每种重链和轻链亚类的基因扩增引物制备PCR产物，作为各自独立的文库。使用这样合成的文库，可以重建包含重链加轻链组合的免疫球蛋白。可以使用重建的免疫球蛋白对HB-EGF的结合活性作为指标，筛选需要的抗体。
本发明的抗体与HB-EGF的结合更优选地是特异性结合。例如，通过以下步骤可以进行对于结合HB-EGF的抗体的筛选：
(1)将HB-EGF与包含由从杂交瘤获得的cDNA编码的V区的抗体接触；
(2)检测HB-EGF与该抗体的结合；和
(3)选择结合HB-EGF的抗体。
检测抗体与HB-EGF结合的方法是已知的。具体地说，测试抗体可与固定在载体上的HB-EGF反应，然后与识别该抗体的标记抗体反应。在洗涤后，可以检测载体上的标记抗体，作为测试抗体与HB-EGF结合的指示。如FITC的荧光物质或如过氧化物酶的酶蛋白质或β-半乳糖苷可以用作标记。固定形式的表达HB-EGF的细胞也可以用来评价抗体的结合活性。
也可以采用使用噬菌体载体的淘选(Panning)作为使用结合活性作为指示的抗体筛选方法。当如上所述获得抗体基因作为重链亚类和轻链亚类文库时，使用噬菌体载体的筛选是有利的。通过与适当的连接体序列连接可以将编码重链和轻链可变区的基因制成单链Fv(scFv)。可以将编码scFv的基因插入噬菌体载体内，以获得在其表面上表达scFv的噬菌体。将噬菌体与靶抗原接触，回收结合抗原的噬菌体能够回收编码具有需要的结合活性的scFv的DNA。需要时，可通过重复这一过程富集具有需要的结合活性的scFv。
在本发明中，编码抗体的多核苷酸可以编码抗体的全长或可以编码抗体的一部分。所述的抗体的部分可以是抗体分子的任一部分。抗体片段是以下在某些情况中用于表示抗体的一部分的术语。本发明中优选的抗体片段包含互补决定区(CDR)。本发明中更优选的抗体片段包含构成可变区的全部3个CDR。
一旦获得编码目标抗HB-EGF抗体的V区的cDNA，就通过识别已被插入cDNA的两个末端的限制性酶切位点的限制性内切酶消化cDNA。优选的限制性内切酶识别并消化在构成抗体基因的碱基序列中出现可能性较低的碱基序列。为了在载体中以正确的方向插入1个拷贝的消化片段，优选产生粘性末端的限制性内切酶。可以通过将如前所述消化的编码抗HB-EGF抗体V区的cDNA插入合适的表达载体内，获得抗体表达载体。在这点上，通过将编码抗体恒定区(C区)的基因与前述的编码V区的基因符合读框地融合，可获得嵌合抗体。本文中，嵌合抗体指恒定区和可变区具有不同的来源的产物。因此，在本发明的范围中，“嵌合抗体”除了如小鼠-人的异种嵌合抗体(heterochimeric antibodies)外也包括人-人同种嵌合抗体(allochimeric antibodies)。也可以通过将前述V区基因插入已携带恒定区的表达载体内构建嵌合抗体表达载体。
具体地说，例如，用于消化前述V区基因的限制性内切酶的限制性内切酶识别序列可以预先设置于携带编码需要的抗体恒定区(C区)的DNA的表达载体的5′侧。将二者用同样的限制性内切酶组合消化并符合读框地融合，导致嵌合抗体表达载体的构建。
为了产生本发明的抗HB-EGF抗体，可以以一定的方式将抗体基因掺入表达载体内，使得表达在表达控制区的控制之下发生。抗体表达的表达控制区包括，例如，增强子和启动子。然后可以通过用所述表达载体转化合适的宿主细胞获得表达编码抗HB-EGF抗体的DNA的重组细胞。
为了表达抗体基因，可以将编码抗体重链(H链)的DNA和编码抗体轻链(L链)的DNA掺入单独的表达载体中。通过用掺有H链的载体和掺有L链的载体同时转化(共转染)同一宿主细胞，可以表达具有H链和L链的抗体分子。或者，可以将编码H链和L链的DNA掺入一个表达载体中，然后转化宿主细胞(WO 94/11523)。
对于通过分离抗体基因并转染合适的宿主来产生抗体，已知许多宿主/表达载体组合。这些表达系统中的任一种可以应用于本发明中。当真核细胞用作宿主时，可以使用动物细胞、植物细胞或真菌细胞。可用于本发明的动物细胞的具体例子如下：
(1)哺乳动物细胞(例如，CHO、COS、骨髓瘤、幼仓鼠肾(BHK)、Hela、Vero等)，
(2)两栖动物细胞(例如，非洲爪蟾(Xenopus laevis)卵母细胞等)，和
(3)昆虫细胞(例如，sf9、sf21、Tn5等)。
对于植物细胞，已知基于来自烟草属如烟草(Nicotiana tabacum)等的细胞的抗体基因表达系统。愈伤组织培养的细胞可以用于植物细胞转化。
例如以下这些可以作为真菌细胞使用：酵母，例如，酵母属(Saccharomyces)如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，毕赤酵母属(Pichia)如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)等，和丝状真菌：例如，曲霉属(Aspergillus)如黑曲霉(Aspergillus niger)。
使用原核细胞的抗体基因表达系统也是已知的。以细菌为例，如大肠杆菌、枯草杆菌等细菌可以用于本发明。
当使用哺乳动物细胞时，可以通过功能性地连接一种有效的、常用的启动子、待表达的抗体基因和位于该抗体基因3′-末端下游的polyA信号来构建表达载体。启动子/增强子的一个例子是人巨细胞病毒直接早期启动子/增强子。
可以用来表达本发明的抗体的其它启动子/增强子有，例如，病毒启动子/增强子和来源于哺乳动物细胞的启动子/增强子，如人延伸因子1α(HEF1α)。能够提供可用的启动子/增强子的具体例子有逆转录病毒、多瘤病毒、腺病毒和猿猴病毒40(SV40)。
可以根据Mulligan等人(Nature(1979)277，108)的方法使用SV40启动子/增强子。另外，可以根据Mizushima等人(Nucleic AcidsRes.(1990)18，5322)的方法容易地利用HEF1α启动子/增强子进行希望的基因表达。
对于大肠杆菌，可以通过功能性地连接一种有效的、常用的启动子、用于抗体分泌的信号序列和待表达的抗体基因来实现所研究的基因的表达。例如，启动子可以是lacZ启动子或araB启动子。可以根据Ward等人(Nature(1989)341，544-546；FASEBJ.(1992)6，2422-2427)的方法使用lacZ启动子。或者，可以根据Better等人(Science(1988)240，1041-1043)的方法使用araB启动子进行希望的基因表达。
关于用于抗体分泌的信号序列，pelB信号序列(Lei，S.P.等人，J.Bacteriol.(1987)169，4379)可以在大肠杆菌周质中生产的情况中使用。在已分离出周质中产生的抗体之后，可以通过使用如盐酸胍和尿素的蛋白质变性剂来改造(重折叠)抗体结构，使其显示需要的结合活性。
例如，插入表达载体内的复制起点可以是来源于SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳头瘤病毒(BPV)等的复制起点。另外，为了扩增宿主细胞系统中的基因拷贝数，可以将选择标记插入表达载体中。具体地说，可用的选择标记尤其如下：
氨基糖苷转移酶(APH)基因，
胸苷激酶(TK)基因，
大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Ecogpt)基因，和
二氢叶酸还原酶(dhfr)基因。
可以通过将所研究的表达载体转染到宿主细胞内并在体外或体内培养转化的宿主细胞来产生靶抗体。可以根据已知方法进行宿主细胞培养。例如，可以使用DMEM、MEM、RPMI1640或IMDM作为培养基；也可以加入如胎牛血清(FCS)的血清补充物。
可以通过已知用于蛋白质纯化的常用方法来纯化如上所述表达和产生的抗体；可以使用一种这样的方法或使用这些方法的适当的组合。可以使用以下方法的合适的选择和组合来分离和纯化抗体：例如，亲和柱(例如，蛋白A柱)、柱色谱、过滤、超滤、盐析、透析等(Antibodies：A Laboratory Manual.Ed Harlow and David Lane，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)。
除了前述的宿主细胞以外，转基因动物也可以用来产生重组抗体。即，可以从已向其中引入编码靶抗体的基因的动物获得所研究的抗体。例如，可以通过在编码乳汁中天然产生的蛋白质的基因中符合读框地插入抗体基因来制备融合的基因。例如，山羊β-酪蛋白可用作分泌到乳汁中的蛋白质。可以将包含掺入抗体基因的融合基因的DNA片段注射到山羊胚胎内，并且可以将注射过的胚胎引入雌山羊中。可以作为与乳汁蛋白质的融合蛋白获得需要的抗体，所述乳汁蛋白质来自由植入胚胎的山羊生出的转基因山羊(或其后代)所产生的乳汁。另外，为了增加转基因山羊产生的包含所需抗体的乳汁的量，可以对转基因山羊适当地使用激素(Ebert，K.M.等人，Bio/Technology(1994)12，699-702)。来源于动物抗体的C区可以用作本发明的重组抗体的C区。可以使用命名为Cγ1、Cγ2a、Cγ2b、Cγ3、Cμ、Cδ、Cα1、Cα2和Cε的小鼠抗体H链C区，还可以使用命名为Cκ和Cλ的L链C区。除了小鼠抗体，来自例如大鼠、兔、山羊、绵羊、骆驼、猴子等的动物抗体也可以用作动物抗体。这些序列是已知的。为了改进抗体或提高其产生的稳定性，可以修饰C区。当抗体将要向人施用时，在本发明中可以制备人工改造的基因重组抗体，目的是例如降低在人体中的外来抗原性。这样的基因重组抗体包括，例如，嵌合抗体和人源化抗体。可以使用已知方法产生这些工程抗体。嵌合抗体指这样的抗体，其中，可变区与具有与可变区不同来源的恒定区连接。例如，一种具有来自小鼠抗体的重链可变区和轻链可变区和来自人抗体的重链恒定区和轻链恒定区的抗体是小鼠-人-异种嵌合抗体。可以通过将编码小鼠抗体可变区的DNA与编码人抗体恒定区的DNA连接并将其掺入表达载体中来构建表达嵌合抗体的重组载体。然后培养被载体转化的重组细胞，以使掺入的DNA表达，然后可以回收培养基中的产生的嵌合抗体。人抗体的C区用于嵌合抗体和人源化抗体的C区。对于H链，例如，Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cμ、Cδ、Cα1、Cα2和Cε可以用于C区。对于L链，Cκ和Cλ可以用于C区。这些C区的氨基酸序列是已知的，编码这些氨基酸序列的碱基序列也是已知的。另外，为了改善抗体本身或提高抗体生产的稳定性，可以修饰人抗体的C区。
嵌合抗体通常由非人类动物来源的抗体的V区和人源抗体的C区构建。相反地，人源化抗体由非人类动物来源的抗体的互补决定区(CDR)、动物来源的抗体的框架区(FR)和人源抗体的C区构成。为了降低在人体中的抗原性，人源化抗体可用作本发明的治疗剂中的活性成分。
例如，本发明中优选的单克隆抗体是通过将构成人恒定区的氨基酸序列与基于本发明构建的HA-20、HB-20或HC15抗HB-EGF抗体小鼠单克隆抗体的可变区连接获得的小鼠-人嵌合抗体。本发明因此提供包含具有以下氨基酸序列的H链和L链的小鼠-人嵌合单克隆抗体。
H链：SEQ ID NO：10的氨基酸序列中从位点1到330的氨基酸序列
L链：SEQ ID NO：20的氨基酸序列中从位点1到107的氨基酸序列。
抗体的可变区典型地由夹在4个FR之间的3个CDR构成。CDR是实质上确定抗体的结合特异性的区域。CDR的氨基酸序列具有丰富的多样性。另一方面，构成FR的氨基酸序列通常显示高度的同源性，甚至在具有不同的结合特异性的抗体之间。由于此原因，某种抗体的结合特异性能够典型地通过CDR移植而转移给另一种抗体。
人源化抗体也被称为重构人抗体。具体地说，例如，已知来自如小鼠抗体的非人类动物抗体的CDR已被移植到人抗体中的人源化抗体。也已知一般的用于获得人源化抗体的基因重组技术。
具体地说，例如，已知重叠延伸PCR是一种将小鼠抗体CDR移植到人FR内的方法。在重叠延伸PCR中，将编码待移植的小鼠抗体CDR的碱基序列添加到用于合成人抗体FR的引物中。为4种FR中的每一种制备引物。选择显示与小鼠FR高度同源性的人FR一般有利于在向人FR上移植小鼠CDR中保持CDR功能。因此，一般优选使用这样的人FR，其氨基酸序列显示与邻近待移植的小鼠CDR的FR的氨基酸序列具有高度同源性。
另外，设计将要连接的碱基序列，使其能够彼此符合读框地连接。分别使用各自的引物合成人FR。以这种方式，获得其中编码小鼠CDR的DNA附着在每个FR上的产物。设计编码每种产物中小鼠CDR的碱基序列，使其彼此重叠。然后，以人抗体基因作为模板合成的产物的重叠CDR区彼此退火，并进行互补链合成反应。该反应导致人FR经小鼠CDR序列连接。
最后，将包含与3个CDR连接的4个FR的可变区基因通过使已添加合适的限制性酶识别序列的引物在其5′末端和3′末端退火，进行全长扩增。通过将如上所述获得的DNA和编码人抗体C区的DNA插入表达载体中，使它们符合读框地融合，以此构建人型抗体的表达载体。将这样制成的载体插入到宿主中并建立重组细胞；培养该重组细胞以表达编码人源化抗体的DNA；由此在培养细胞的培养基中产生人源化抗体(参考EP 239,400和WO 96/02576)。
可以通过定性和定量地测定和评价如前所述构建的人源化抗体对抗原的结合活性来适当地选择当跨过CDR连接时能够使CDR形成高质量的抗原结合位点的人抗体FR。必要时也可以在FR上进行氨基酸置换，以使重构人抗体的CDR能够形成良好适应的抗原结合位点。例如，可以使用用于将小鼠CDR移植到人FR上的PCR方法，将氨基酸序列中的突变引入FR中。具体地说，可以将部分碱基序列突变引入到将与FR退火的引物中。然后将碱基序列突变引入到使用这些引物合成的FR中。通过用上述方法测定和评价突变的、氨基酸取代的抗体的抗原结合活性，可以选择具有需要的性质的突变FR序列(Sato，K.等人，Cancer Res.，1993，53，851-856)。
也已知获得人抗体的方法。例如，可以在体外用需要的抗原或表达需要的抗原的细胞致敏人淋巴细胞。然后可以通过将致敏的淋巴细胞与人骨髓瘤细胞融合获得需要的能够结合抗原的人抗体(参考日本专利公开第H1-59878号)。例如，U266可以用于用作融合伴侣的人骨髓瘤细胞。
也可以通过用需要的抗原免疫具有完整人抗体基因全部组成成分(repertoire)的转基因动物获得需要的人抗体(参考国际公开WO93/12227、WO 92/03918、WO 94/02602、WO 94/25585、WO 96/34096和WO 96/33735)。也已知使用人抗体文库通过淘选获得人抗体的技术。例如，通过噬菌体展示方法可以在噬菌体表面上表达作为单链抗体(scFv)的人抗体V区，并可以选择结合抗原的噬菌体。然后可以通过分析选择的噬菌体的基因确定编码结合抗原的人抗体的V区的DNA序列。一旦确定了结合抗原的scFv的DNA序列，就可以将V区序列与需要的人抗体C区的序列符合读框地融合，这之后通过将其插入合适的表达载体中构建表达载体。可以将表达载体转染到如上所述的合适的表达细胞中，并可以通过编码人抗体的基因的表达获得人抗体。这些方法是已知的(国际公开92/01047、WO92/20791、WO 93/06213、WO 93/11236、WO 93/19172、WO 95/01438和WO 95/15388)。
在与HB-EGF蛋白发生结合的范围内，本发明的抗体不仅包括由IgG代表的二价抗体，还包括由IgM代表的多价抗体和单价抗体。本发明的多价抗体包括其中所有抗原结合位点相同的多价抗体，和其中某些或所有抗原结合位点不同的多价抗体。本发明的抗体不限于全长抗体分子，也包括低分子量抗体及其修饰，只要它们能够结合HB-EGF蛋白。
低分子量抗体包括通过删除完整抗体(例如，完整的IgG)的一部分产生的抗体片段。抗体分子的部分删除是允许的，只要存在结合HB-EGF抗原的能力。用于本发明的抗体片段优选地包含重链可变区(VH)或轻链可变区(VL)或这两者。VH或VL的氨基酸序列可以包括取代、添加和/或插入。而且，只要仍然存在结合HB-EGF抗原的能力，也可以删除VH或VL的一部分或这两者的一部分。也可以将可变区嵌合或人源化。抗体片段的具体例子是Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv。低分子量抗体的具体例子是Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、scFv(单链Fv)、双抗体和sc(Fv)2(单链(Fv)2)。本发明的低分子量抗体也包括这些抗体的多聚体(例如，二聚体、三聚体、四聚体、多聚体)。
也可以通过酶处理抗体产生抗体片段来获得抗体片段。例如，已知木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、纤维蛋白溶酶等为产生抗体片段的酶。或者，可以构建编码这样的抗体片段的基因，并将其插入表达载体中，接着由合适的宿主细胞表达(参考，例如，Co，M.S.等人，J.Immunol.(1994)152，2968-2976；Better，M.&Horwitz，A.H.Methodsin Enzymology(1989)178，476-496；Plueckthun，A.&Skerra，A.Methods in Enzymology(1989)178，476-496；Lamoyi，E.Methods inEnzymology(1989)121，652-663；Rousseaux，J.等人，Methods inEnzymology(1989)121，663-669；和Bird，R.E.等人，TIBTECH(1991)9，132-137)。
消化酶切割特定的抗体片段位点以产生具有如下所述的特定结构的抗体片段。当对这些酶促产生的抗体片段应用基因工程技术时，可以删除抗体的任意部分。
木瓜蛋白酶消化：F(ab)2或Fab
胃蛋白酶消化：F(ab′)2或Fab′
纤维蛋白溶酶消化：Facb
双抗体表示通过基因融合构建的二价抗体片段(Holliger，P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90，6444-6448(1993)、EP 404,097、WO93/11161等)。双抗体是由两个多肽链构成的二聚体。一般地，构成双抗体的每个多肽链是通过连接体连接为一个相同链的VL和VH。用于双抗体的连接体一般足够短而使得VL和VH不能彼此结合。具体地说，例如，大约5个氨基酸残基组成连接体。由于此原因，在同一多肽链上编码的VL和VH不能形成单链可变区片段，与单独的单链可变区片段形成二聚体。因此，双抗体具有两个抗原结合位点。
通过将抗体的H链V区与L链V区连接获得scFv。scFv中的H链V区与L链V区通过连接体且优选地通过肽连接体彼此连接(Huston，J.S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，5879-5883(1988))。scFv中的H链V区和L链V区可以来源于本文所述的任何抗体。对于连接V区的肽连接体没有特别的限制。例如，可以使用任何具有大约3-25个残基的单肽链作为连接体。具体地说，例如，可以使用以下所述的肽连接体。
例如，可以使用前述的PCR技术连接V区。为了通过PCR连接V区，首先使用编码来自以下DNA的氨基酸序列的全部或所需部分的DNA作为模板：
编码抗体的H链或H链V区的DNA序列，和
编码抗体的L链或L链V区的DNA序列。
使用具有对应于待扩增DNA的两个末端处序列的序列的引物对，通过PCR分别扩增编码H链V区的DNA和编码L链V区的DNA。然后制备编码肽连接体区域的DNA。也可以使用PCR合成编码肽连接体的DNA。在所用的引物的5′侧之前，加入能够与分别合成的每种V区扩增产物连接的碱基序列。然后使用装配PCR引物和用于[H链V区DNA]-[肽连接体DNA]-[L链V区DNA]的每种DNA进行PCR反应。装配PCR引物是与[H链V区DNA]的5′侧退火的引物和与[L链V区DNA]的3′侧退火的引物的组合。即，装配PCR引物形成能扩增编码待合成的scFv全长序列的DNA的引物集。另一方面，向[肽连接体DNA]上添加可与每个V区DNA连接的碱基序列。结果，这些DNA连接在一起，而且，最终通过装配PCR引物产生全长scFv作为扩增产物。一旦已产生编码scFv的DNA，就可以通过通常的方法获得含有该DNA的表达载体以及由该表达载体转化的重组细胞。另外，可以培养这样获得的重组细胞，并可以通过编码scFv的DNA的表达获得scFv。
sc(Fv)2是一种低分子量抗体，其中，两个VH和两个VL通过(例如)连接体连接成单链(Hudson等人，J.Immunol.Methods，231，177-189(1999))。例如，可以通过用连接体连接scFv制备sc(Fv)2。
优选特征性地具有在序列中排列的两个VH和两个VL的抗体，从单链多肽的N-末端侧起，为VH、VL、VH、VL([VH]连接体-[VL]连接体-[VH]连接体-[VL])。
两个VH和两个VL的序列不特别限于上述的排列，它们可以排列成任一序列。可以提供下面的序列作为例子。
[VL]连接体-[VH]连接体-[VH]连接体-[VL]
[VH]连接体-[VL]连接体-[VL]连接体-[VH]
[VH]连接体-[VH]连接体-[VL]连接体-[VL]
[VL]连接体-[VL]连接体-[VH]连接体-[VH]
[VL]连接体-[VH]连接体-[VL]连接体-[VH]
连接抗体的可变区的连接体可以是，例如，可以通过基因工程插入的肽连接体或合成的化合物连接体，例如，如Protein Engineering，9(3)，299-305(1996)中所公开的。在本发明中，优选肽连接体。肽连接体的长度没有特别限制，可以由本领域的技术人员考虑到预期应用适当地选择。一般地，肽连接体中有1-100个氨基酸残基，优选3-50个氨基酸残基，更优选5-30个氨基酸残基，尤其优选12-18个氨基酸残基(例如，15个氨基酸残基)。
肽连接体的氨基酸序列可以是不削弱scFv的结合作用的任何序列。例如，以下氨基酸序列可以用于肽连接体：
Ser
Gly-Ser
Gly-Gly-Ser
Ser-Gly-Gly
Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：61)
Ser-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO：62)
Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：63)
Ser-Gly-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO：64)
Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：65)
Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO：66)
Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：67)
Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO：68)
(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：63))n
(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO：64))n
[n是数值至少为1的整数]
肽连接体的氨基酸序列可以由本领域技术人员根据预期的用途适当地选择。例如，设置上述肽连接体的长度的n通常为1-5，优选1-3，更优选1或2。
例如，下面的sc(Fv)2是本发明中sc(Fv)2的特别优选的实施方式。[VH]肽连接体(15个氨基酸)[VL]肽连接体(15个氨基酸)[VH]肽连接体(15个氨基酸)[VL]。
或者，也可以使用合成的化学连接体(化学交联剂)连接V区。本发明中可以使用那些典型地用于交联诸如肽化合物的交联剂。例如，诸如以下的交联剂是已知的。这些交联剂可以商购获得：
N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，
辛二酸二琥珀酰亚胺酯(DSS)，
双磺基琥珀酰亚胺辛二酸酯(BS3)，
二硫代双琥珀酰亚胺丙酸酯(DSP)，
二硫代双磺基琥珀酰亚胺丙酸酯(DTSSP)，
乙二醇双琥珀酰亚胺琥珀酸酯(EGS)，
乙二醇双磺基琥珀酰亚胺琥珀酸酯(磺基-EGS)，
二琥珀酰亚胺酒石酸酯(DST)，
二磺基琥珀酰亚胺酒石酸酯(磺基-DST)，
二[2-(琥珀酰亚胺氧羰基氧基)乙基]砜(BSOCOES)，
二[2-(磺基琥珀酰亚胺氧羰基氧基)乙基](磺基-BSOCOES)等。
当连接4个抗体可变区时，通常需要3个连接体。这些连接体可以是彼此相同的，或者可以使用不同的连接体。双抗体和sc(Fv)2是本发明优选的低分子量抗体。为了获得这样的低分子量抗体，可以用酶(例如，木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等)处理抗体以产生抗体片段，或者可以构建编码这些抗体片段的DNA并插入表达载体中，接着在合适的宿主细胞中表达(参考，例如，Co，M.S.等人，J.Immunol.(1994)152，2968-2976；Better，M.和Horwitz，A.H.Methods Enzymol.(1989)178，476-496；Plueckthun，A.和Skerra，A.Methods Enzymol.(1989)178，497-515；Lamoyi，E.Methods Enzymol.(1986)121，652-663；Rousseaux，J.等人，Methods Enzymol.(1986)121，663-669；与Bird，R.E.和Walker，B.W.Trends Biotechnol.(1991)9，132-137)。
任何识别HB-EGF的抗体都可以用作本发明的抗体。如以下(1)-(29)所述的抗体是优选抗体的实例。这些抗体可以是，例如，全长抗体、低分子量抗体、动物抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体等。
(1)包含具有作为CDR1的SEQ ID NO：2的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：4的氨基酸序列和作为CDR3的SEQ ID NO：6的氨基酸序列的重链可变区的抗体；
(2)包含如(1)所述的重链可变区的抗体，其具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列作为CH；
(3)包含如(1)所述的重链可变区的抗体，其具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列作为CH；
(4)包含具有作为CDR1的SEQ ID NO：12的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：14的氨基酸序列和作为CDR3的SEQ ID NO：16的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；
(5)包含如(4)所述的轻链可变区的抗体，其具有SEQ ID NO：18的氨基酸序列作为CL；
(6)包含如(4)所述的轻链可变区的抗体，其具有SEQ ID NO：20的氨基酸序列作为CL；
(7)包含如(1)所述的重链和如(4)所述的轻链的抗体；
(8)包含如(2)所述的重链和如(5)所述的轻链的抗体；
(9)包含如(3)所述的重链和如(6)所述的轻链的抗体；
(10)包含具有作为CDR1的SEQ ID NO：22的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：24的氨基酸序列和作为CDR3的SEQ ID NO：26的氨基酸序列的重链可变区的抗体；
(11)包含如(10)所述的重链可变区的抗体，其具有SEQ ID NO：28的氨基酸序列作为CH；
(12)包含如(10)所述的重链可变区的抗体，其具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列作为CH；
(13)包含具有作为CDR1的SEQ ID NO：30的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：32的氨基酸序列和作为CDR3的SEQ ID NO：34的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；
(14)包含如(13)所述的轻链可变区的抗体，其具有SEQ ID NO：18的氨基酸序列作为CL；
(15)包含如(13)所述的轻链可变区的抗体，其具有SEQ ID NO：20的氨基酸序列作为CL；
(16)包含如(10)所述的重链和如(13)所述的轻链的抗体；
(17)包含如(11)所述的重链和如(14)所述的轻链的抗体；
(18)包含如(12)所述的重链和如(15)所述的轻链的抗体；
(19)包含具有作为CDR1的SEQ ID NO：36的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：38的氨基酸序列和作为CDR3的SEQ ID NO：40的氨基酸序列的重链可变区的抗体；
(20)包含如(19)所述的重链可变区的抗体，其具有SEQ ID NO：28的氨基酸序列作为CH；
(21)包含如(19)所述的重链可变区的抗体，其具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列作为CH；
(22)包含具有作为CDR1的SEQ ID NO：42的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：44的氨基酸序列和作为CDR3的SEQ ID NO：46的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；
(23)包含如(22)所述的轻链可变区的抗体，其具有SEQ ID NO：18的氨基酸序列作为CL；
(24)包含如(22)所述的轻链可变区的抗体，其具有SEQ ID NO：20的氨基酸序列作为CL；
(25)包含如(19)所述的重链和如(22)所述的轻链的抗体；
(26)包含如(20)所述的重链和如(23)所述的轻链的抗体；
(27)包含如(21)所述的重链和如(24)所述的轻链的抗体；
(28)通过在(1)-(27)中任一项所述的抗体中置换一个或多个氨基酸、删除一个或多个氨基酸、添加一个或多个氨基酸和/或插入一个或多个氨基酸而获得的、与(1)-(27)中任一项所述的抗体活性相当的抗体；和
(29)与(1)-(27)中任一项所述的抗体结合相同的HB-EGF蛋白表位的抗体。
具有SEQ ID NO：48的氨基酸序列的VH是如以上(1)所述的“具有作为CDR1的SEQ ID NO：2的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ IDNO：4的氨基酸序列和作为CDR3的SEQ ID NO：6的氨基酸序列的重链”中的VH的实例。
具有SEQ ID NO：50的氨基酸序列的VL是如以上(4)所述的“具有作为CDR1的SEQ ID NO：12的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ IDNO：14的氨基酸序列和作为CDR3的SEQ ID NO：16的氨基酸序列的轻链”中的VL的实例。
具有SEQ ID NO：52的氨基酸序列的VH是如以上(12)所述的“具有作为CDR1的SEQ ID NO：22的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：24的氨基酸序列和作为CDR3的SEQ ID NO：26的氨基酸序列的重链”中的VH的实例。
具有SEQ ID NO：54的氨基酸序列的VL是如以上(15)所述的“具有作为CDR1的SEQ ID NO：30的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ IDNO：32的氨基酸序列和作为CDR3的SEQ ID NO：34的氨基酸序列的轻链”中的VL的实例。
具有SEQ ID NO：56的氨基酸序列的VH是如以上(23)所述的“具有作为CDR1的SEQ ID NO：36的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：38的氨基酸序列和作为CDR3的SEQ ID NO：38的氨基酸序列的重链”中的VH的实例。
具有SEQ ID NO：58的氨基酸序列的VL是如以上(26)所述的“具有作为CDR1的SEQ ID NO：42的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ IDNO：44的氨基酸序列和作为CDR3的SEQ ID NO：46的氨基酸序列的轻链”中的VL的实例。
对于如以上(28)所述的抗体，“活性相当”是指当以50μg/mL的浓度添加抗体时，至少对于EGFR Ba/F3细胞的HB-EGF依赖性生长的抑制效应，EC₅₀值为50nM或更低，以及至少80％地抑制HB-EGF与EGFR之间的结合。如以上(28)所述的抗体的一个优选实施方式是在除CDR以外的区域中被修饰或改造的抗体。作为一个实例，(28)中“通过在如(1)所述的抗体中置换一个或多个氨基酸、删除一个或多个氨基酸、添加一个或多个氨基酸和/或插入一个或多个氨基酸而获得的、与如(1)所述的抗体活性相当的抗体”所涵盖的抗体的一个优选实施方式是“包含具有作为CDR1的SEQ ID NO：2的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：4的氨基酸序列和作为CDR3的SEQ ID NO：6的氨基酸序列的重链的抗体，包括通过在如(1)所述的抗体中置换一个或多个氨基酸、删除一个或多个氨基酸、添加一个或多个氨基酸和/或插入一个或多个氨基酸而获得的、与如(1)所述的抗体活性相当的抗体”。如(28)所述抗体包括的其它抗体的优选实施方式可以以相同方式阐述。
向多肽中引入突变是本领域技术人员熟知的一种产生与特定多肽功能相当的多肽的方法。例如，本领域技术人员熟知，可以通过使用位点特异性诱变将合适的突变引入本发明的抗体中，产生显示与本发明的抗体相当的活性的抗体(Hashimoto-Gotoh，T.等人(1995)Gene 152，271-275；Zoller，M.J.和Smith，M.(1983)Methods Enzymol.100，468-500；Kramer，W.等人(1984)Nucleic Acids Res.12，9441-9456；Kramer，W.和Fritz，H.J.(1987)Methods Enzymol.154，350-367；Kunkel，T.A.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82，488-492；和Kunkel T.A.(1988)Methods Enzymol.85，2763-2766)。也可以通过自然突变产生氨基酸突变。本发明的抗体也包括这样的抗体：其具有通过在本发明抗体的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸突变而产生的氨基酸序列，并且显示与本发明抗体的活性相当的活性。关于在这样的突变体中突变的氨基酸的数目，可以考虑一般不超过50个氨基酸，优选不超过30个氨基酸，更优选不超过10个氨基酸(例如，不超过5个氨基酸)。
优选地，氨基酸残基被突变为保留氨基酸侧链的特征的另一种氨基酸残基。例如，已基于氨基酸侧链的特征建立了下面的分类。
疏水性氨基酸(A，I，L，M，F，P，W，Y，V)
亲水性氨基酸(R，D，N，C，E，Q，G，H，K，S，T)
具有脂族侧链的氨基酸(G，A，V，L，I，P)
具有含羟基侧链的氨基酸(S，T，Y)
具有含硫侧链的氨基酸(C，M)
具有含羧基或含酰胺侧链的氨基酸(D，N，E，Q)
具有含碱侧链的氨基酸(R，K，H)
具有含芳基侧链的氨基酸(H，F，Y，W)
(圆括号中给出了氨基酸的单字母符号)
对于一种多肽，其具有通过从特定氨基酸序列中删除和/或向特定氨基酸序列中添加一个或多个氨基酸残基和/或通过用另一种氨基酸替换特定氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基而产生的修饰氨基酸序列，已知这样的多肽能够保持其生物活性(Mark，D.F.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81，5662-5666；Zoller，M.J.和Smith，M.，Nucleic Acids Research(1982)10，6487-6500；Wang，A.等人，Science 224，1431-1433；Dalbadie-McFarland，G.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1982)79，6409-6413)。即，当在特定多肽的氨基酸序列中将一个特定分类中的氨基酸替换为该分类中的其它氨基酸时，保持该特定多肽的活性的可能性较高。以上提供的氨基酸分类中，同一分类中的氨基酸之间的置换在本发明中被称为保守置换。
在上述的(29)中，本发明也提供了与本发明公开的抗HB-EGF抗体结合相同的表位的抗体。因此，本发明涉及识别与抗体HA-20、HB-20和HC-15所识别的表位相同的表位的抗体；本发明也涉及这样的抗体的应用。例如，可以通过以下方法获得这样的抗体。
可以根据测试抗体和特定抗体对于相同表位的竞争来确定两者是否具有相同的表位。例如，可以通过相互阻断分析(reciprocalblocking assay)检测抗体之间的竞争。例如，竞争性ELISA分析是一种优选的相互阻断分析。具体地说，在相互阻断分析中，在微量滴定板的孔上包被HB-EGF蛋白；在存在或不存在候选竞争性抗体的情况下预孵育；然后加入本发明的抗HB-EGF抗体。已经与孔中的HB-EGF蛋白结合的本发明抗HB-EGF抗体的量与竞争结合相同表位的候选竞争性抗体(测试抗体)的结合活性间接相关。即，测试抗体对同样的表位的亲和力越高，与HB-EGF蛋白包被的孔结合的本发明的抗HB-EGF抗体就越少，测试抗体与HB-EGF蛋白包被的孔结合的量就越大。
可以通过提前标记抗体方便地测定与孔结合的抗体的量。例如，可以使用抗生物素蛋白-过氧化物酶偶联物和合适的底物测定生物素标记的抗体。基于如过氧化物酶的酶标记的相互阻断分析作为竞争性ELISA分析尤其是已知的。可以用某些其它可被检测或测定的标记物标记抗体。具体地说，放射性标记和荧光标记也是已知的。
另外，当测试抗体具有来源于与本发明的抗HB-EGF抗体不同的物种的恒定区时，也可以使用识别该抗体恒定区的标记过的第二抗体测定与孔结合的抗体的量。或者，甚至当抗体来源于相同的物种但类别不同时，可以使用能区分各个类别的第二抗体测定与孔结合的抗体的量。
与在不存在候选竞争性抗体的情况下进行的对照测试中获得的结合活性相比，当候选抗体可以阻断至少20％、优选至少20％-50％、甚至更优选至少50％的抗HB-EGF抗体的结合时，这种候选竞争性抗体是与本发明的抗HB-EGF抗体结合基本上相同的表位的抗体或竞争结合相同的表位的抗体。
如以上(29)所述的抗体是与抗HB-EGF抗体结合相同表位的抗体的一个例子，但不限于此。
另外，如上所述，如以上(1)-(29)所述的抗体不仅包括单价抗体，而且包括多价抗体。本发明的多价抗体包括其中所有抗原结合位点都相同的多价抗体和其中一些或全部抗原结合位点不同的多价抗体。
下述抗体是具有不同的抗原结合位点的多价抗体的例子；但是，本发明的抗体不限于这些抗体。
(A)包含如以上(7)所述的H链和L链对(以下称为HL对)和如以上(16)或(25)所述的HL对的抗体，
(B)包含如以上(8)所述的HL对和如以上(17)或(26)所述的HL对的抗体，
(C)包含如以上(9)所述的HL对和如以上(18)或(27)所述的HL对的抗体，
(D)包含如以上(7)所述的HL对和如以上(28)所述的HL对的抗体，
(E)包含如以上(8)所述的HL对和如以上(28)所述的HL对的抗体，
(F)包含如以上(9)所述的HL对和如以上(28)所述的HL对的抗体，
(G)包含如以上(7)所述的HL对和如以上(29)所述的HL对的抗体，
(H)包含如以上(8)所述的HL对和如以上(29)所述的HL对的抗体，
(I)包含如以上(9)所述的HL对和如以上(29)所述的HL对的抗体，
(J)包含如以上(16)所述的HL对和如以上(25)所述的HL对的抗体，
(K)包含如以上(17)所述的HL对和如以上(26)所述的HL对的抗体，
(L)包含如以上(18)所述的HL对和如以上(27)所述的HL对的抗体，
(M)包含如以上(16)所述的HL对和如以上(28)所述的HL对的抗体，
(N)包含如以上(17)所述的HL对和如以上(28)所述的HL对的抗体，
(O)包含如以上(18)所述的HL对和如以上(28)所述的HL对的抗体，
(P)包含如以上(16)所述的HL对和如以上(29)所述的HL对的抗体，
(Q)包含如以上(17)所述的HL对和如以上(29)所述的HL对的抗体，
(R)包含如以上(18)所述的HL对和如以上(29)所述的HL对的抗体。
另外，本发明的抗体也可以以结合有如聚乙二醇(PEG)等各种分子的修饰抗体的形式使用。可以通过对本发明的抗体进行化学修饰获得这些修饰抗体。本领域中已经建立了抗体修饰方法。
本发明的抗体也可以是双特异性抗体。双特异性抗体是在同一抗体分子内具有识别不同表位的可变区的抗体，其中，这些表位可以存在于不同的分子中或者可以存在于一个分子中。因此，在本发明的范围中，双特异性抗体可以具有识别HB-EGF分子上的不同表位的抗原结合位点。使用这样的双特异性抗体，两个抗体分子可以与一个HB-EGF分子结合。因此，可以预期有更强的细胞毒性。本发明的“抗体”也包括这些抗体。
本发明也包括识别除HB-EGF以外的抗原的双特异性抗体。例如，本发明包括识别不同于HB-EGF的抗原的双特异性抗体，其中，该抗原在作为与HB-EGF相同的靶标的癌细胞的细胞表面上特异性地表达。
已知产生双特异性抗体的方法。例如，可以通过连接两个识别不同抗原的抗体产生双特异性抗体。连接的每个抗体可以是具有H链和L链的半分子或可以是只具有H链的四分之一分子。或者，也可以通过融合产生不同单克隆抗体的杂交瘤产生能产生双特异性抗体的融合细胞。另外也可以通过基因工程技术产生双特异性抗体。
抗体的结合活性、抗体的中和活性、和抗体抑制增殖的能力
可以利用已知的方法测定抗体的抗原结合活性(Antibodies：ALaboratory Manual.Ed Harlow and David Lane，Cold Spring HarborLaboratory，1988)。例如，可以使用酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫测定(EIA)、放射性免疫测定(RIA)或免疫荧光法。Antibodies：A Laboratory Manual的第359-420页所述的方法是用于测定抗体对细胞中表达的抗原的结合活性的方法的一个例子。
另外，特别是采用流式细胞仪的方法可以合适地用来测定悬浮于(例如)缓冲液中的细胞表面上表达的抗原与针对该抗原的抗体之间的结合。可用的流式细胞仪的例子如下：FACSCanto(注册商标)II、FACSAria(注册商标)、FACSArray(注册商标)、FACSVantage(注册商标)SE和FACSCalibur(注册商标)(上述装置来自BDBiosciences)和EPIS ALTRA HyPerSort、Cytomics FC 500、EPICSXL-MCL ADC EPIC S XL ADC和Cell Lab Quanta/Cell Lab QuantaSC(上述装置来自Beckman Coulter)。
在一个测定测试HB-EGF抗体对抗原的结合活性的便利方法的例子中，测试抗体与表达HB-EGF的细胞反应，并用识别测试抗体的FITC标记的第二抗体染色。用FACSCalibur(Becton，Dickinson andCompany)测定荧光强度，并用CELL QUEST软件(Becton，Dickinsonand Company)分析。按照该方法，当与表达HB-EGF的细胞上的膜结合HB-EGF结合的测试抗体用识别该测试抗体的FITC-标记的第二抗体染色并用FACSCalibur测定荧光强度时，可以将通过用CELLQUEST软件分析得到的荧光强度而获得的几何平均值(检测几何平均值)与强烈地与膜结合HB-EGF反应的抗体(例如，可商购的抗体，如来自R&D Systems，Inc.的AF-259-NA，或HC-15)的结合活性(对照几何平均值)进行比较，由此确定“不存在与表达HB-EGF的细胞之细胞表面上的HB-EGF蛋白的结合”。因此，当测试几何平均值至少小于对照几何平均值的10％，优选地小于5％，更优选地小于2％时，该测试抗体在本文中被称为显示“不存在与表达HB-EGF的细胞之细胞表面上的HB-EGF蛋白的结合”。计算几何平均值(Geo平均值)的方法在CELL QUEST软件用户指南(BD Biosciences)中有描述。
本发明的抗体优选地是显示中和活性的抗体。中和活性通常是指抑制对细胞显示生物活性的配体(病毒和毒素是这种配体的例子)的生物活性的能力。因此，具有中和活性的物质是指与这样的配体结合或与可结合该配体的受体结合，从而抑制该配体或该受体的结合的物质。由于中和活性而被阻止与配体结合的受体于是不能表现出通过该受体进行的生物活性。显示这样的中和活性的抗体一般被称为中和抗体。可以通过将在配体和测试物质存在下的生物活性与在存在配体而不存在测试物质的情况下的生物活性进行比较，测定特定测试物质的中和活性。
EGF受体被认为是此处所述的HB-EGF的主要受体。在这种情况下，由于配体的结合形成二聚体，因而酪氨酸激酶(它是细胞内的自身结构域)被活化。活化的酪氨酸激酶导致通过自身磷酸化形成磷酸化的含酪氨酸的肽，各种信号转导辅助分子与该肽结合。主要有PLCγ(磷脂酶Cγ)、Shc、Grb2等。在这些辅助分子中，前两者另外还被EGF受体的酪氨酸激酶磷酸化。从EGF受体信号转导的主要路径是磷酸化沿Shc、Grb2、Sos、Ras、Raf/MAPK激酶/MAP激酶的顺序转导的路径。此外还认为存在从PLCγ到PKC的路径，这是第二路径。这种细胞内的信号级联在各种细胞类型中是不同的，因而可以为每种需要的靶细胞确定合适的靶分子，而对于上述的因素没有限制。可以通过测定体内信号活化评价中和活性。可以适当地使用用于测定体内信号活化的可商购的试剂盒(例如，来自GEHealthcare Biosciences的蛋白激酶C活化测定系统)。
也可以通过集中于位于体内信号级联下游的靶基因的转录的诱导来检测体内信号活化。可以使用报道分子测定概念检测靶基因的转录活性的变化。具体地说，报道基因(例如，绿色荧光蛋白(GFP)或萤光素酶)可以位于靶基因的转录因子或启动子区域的下游，且通过测定报道基因活性可以根据报道基因活性测定转录活性的变化。
另外，由于通过EGF受体的信号转导一般沿促进细胞生长的方向作用，可以通过测定靶细胞的生长活性评价中和活性。在下面提供的实例中，通过评价细胞生长活性来评价本发明的中和抗体的中和活性，但是本发明不限于这种方法。中和活性可以用任何适合于特定靶细胞的已知方法评价。
方便地使用以下方法来评价或测定基于抗HB-EGF抗体的中和活性对HB-EGF促进其增殖的细胞的增殖的抑制效应。在一种可以用来在体外评价或测定细胞增殖抑制活性的方法中，测定活细胞对加入培养基中的[³H]标记的胸苷的摄取作为DNA复制能力的指标。更方便的方法包括MTT法和染料排除法，染料排除法使用显微镜检测细胞排斥染料(例如，台盼蓝)的能力。MTT法利用以下事实：活细胞具有将四唑盐MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物)转化为蓝色甲产物的能力。更具体地，向测试细胞的培养液中加入配体和测试抗体，并在经过特定时间之后，向培养液中加入MTT溶液，并通过静置一段特定时间使MTT掺入细胞内。结果，黄色化合物MTT被细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶转化为蓝色化合物。溶解蓝色产物以提供着色，对其吸光度的测定提供活细胞计数的指标。除了MTT，如MTS、XTT、WST-1、WST-8等试剂也是可商购的(Nacalai Tesque，Inc.)并可以适当地使用。在活性测定中，以与抗HB-EGF抗体同样的方式使用对照抗体；对照抗体是与抗HB-EGF抗体具有相同的同种型而没有上述细胞增殖抑制活性的结合抗体。当抗HB-EGF抗体显示比对照抗体更强的细胞增殖抑制活性时，该抗体具有细胞增殖抑制活性。
此处提供的实例使用其增殖被HB-EGF促进的以下细胞进行活性评价：RMG-1细胞株，它是一种卵巢癌细胞株，以及用载体转化的小鼠Ba/F3细胞，该载体具有可操作连接的编码hEGFR/mG-CSFR(SEQ ID NO：86)的基因，hEGFR/mG-CSFR是通过将人EGFR的胞外域(其多肽序列由SEQ ID NO：78显示)与小鼠GCSF受体的胞内域(其多肽序列由SEQ ID NO：84显示)符合读框地融合而获得的融合蛋白。但是，用于评价活性的细胞不限于以上所述，其增殖被HB-EGF促进的任何细胞都可以适当地使用。
携带肿瘤的小鼠模型也可以用作评价或测定体内细胞增殖抑制活性的方法。例如，可以将其生长受HB-EGF促进的癌细胞皮下或皮内地移植到非人类测试动物内，之后可以在移植当天或第二天开始每天或以多天的间隔静脉内或腹内施用测试抗体。可以通过测量随时间变化的肿瘤大小来评价细胞增殖抑制活性。如同体外评价一样，施用具有相同同种型的对照抗体，且当接受抗HB-EGF抗体的组的肿瘤大小明显小于接受对照抗体的组的肿瘤大小时，该抗体具有细胞增殖抑制活性。当使用小鼠作为非人类测试动物时，适当地使用裸(nu/nu)鼠；由于胸腺的遗传缺失，裸(nu/nu)鼠缺乏T-淋巴细胞功能。使用这种类型的小鼠可以在评价或测定由于施用的抗体导致的细胞增殖抑制活性时，排除测试动物中的T-淋巴细胞的贡献。
本发明中使用的抗体的一个更优选的实施方式是缺乏效应活性如ADCC活性和/或CDC活性的抗体。效应活性的抑制可能是由于抗体同种型和/或亚型而发生的抑制，并且当抗体是嵌合抗体或人源化抗体时，可能是由于使用的Fc区的来源而发生的抑制。对于人抗体，IgM抗体是缺乏ADCC活性的抗体同种型，而IgG4抗体是缺乏ADCC活性的抗体亚型(Clinical Aspects of Immunology，第5版，1799-1830，1993)。例如，适当地使用IgG4抗体作为缺乏CDC活性的抗体亚型。一种更合适的抗体是ADCC活性和CDC活性都缺乏的IgG4抗体。
对于小鼠抗体和大鼠抗体，可以使用IgG1抗体作为ADCC活性和CDC活性都缺乏的抗体。
另外，当利用基因工程技术通过上述方法构建嵌合抗体或人源化抗体时，可以使用抗体基因适当地构建可以调节其中的效应活性的抗体，该抗体基因编码来源于上述抗体同种型或亚型的Fc区，作为在所构建的嵌合抗体或人源化抗体中使用的Fc区。
细胞增殖抑制剂
本发明提供了抑制其增殖被HB-EGF促进的细胞的增殖的方法，包括使该细胞与可结合HB-EGF蛋白的抗体接触。存在于本发明的细胞增殖抑制剂中的可结合HB-EGF蛋白的抗体是如上所述的可结合HB-EGF蛋白的抗体。除了这些细胞需表达HB-EGF以外，对于可以与抗HB-EGF抗体接触的细胞没有特别的限制，但优选胰癌、肝癌、食道癌、黑素瘤、结直肠癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌和脑瘤。
可以通过将抗体添加到在体外培养的表达HB-EGF的细胞的培养基中进行本发明的“接触”。对于其中加入抗体的状态，例如，可以适当地使用通过冷冻干燥获得的固体或溶液。在那些以水溶液形式加入抗体的情况中，可以是只含有纯抗体的水溶液，或者可以是含有诸如表面活性剂、赋形剂、着色剂、香料、防腐剂、稳定剂、缓冲液、悬浮剂、张度剂(tonicity agent)、粘合剂、崩解剂、润滑剂、流动性促进剂、掩味剂等的溶液。对于加入的浓度没有特别的限制，而培养液中的合适的终浓度优选地为1pg/mL-1g/mL，更优选1ng/mL-1mg/mL，甚至更优选1μg/mL-1mg/mL。
在本发明的另一个实施方式中，也可以通过向已植入或移植表达HB-EGF的细胞的非人类动物给药，或通过向携带表达HB-EGF的癌细胞的动物给药，进行“接触”。给药方式可以是口服给药或肠胃外给药。尤其优选肠胃外给药，相应的给药途径可以包括注射、经鼻给药、经肺给药、经皮给药等。关于注射给药的例子，作为细胞增殖抑制剂或抗癌剂的本发明的药物组合物可以通过如静脉内注射、肌肉内注射、腹膜内注射或皮下注射全身施用或局部施用。可以根据受试动物的年龄和症状选择适当的给药方式。在施用水溶液的情况中，该溶液可以是只含有纯抗体的水溶液，或者可以是含有诸如表面活性剂、赋形剂、着色剂、香料、防腐剂、稳定剂、缓冲液、悬浮剂、张度剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、流动性促进剂、掩味剂等的溶液。剂量可以选自例如每次给药0.0001mg-1000mg/kg体重。或者，剂量可以选自例如每位患者0.001-100000mg。但是，本发明的抗体的剂量不限于上述剂量。
可以利用与以上所述测定中和活性相同的试验评价或测定由于接触抗HB-EGF抗体引起的对HB-EGF促进其生长的细胞的增殖的抑制效应。在这种情况中，可以通过比较在存在配体的情况下的活性与在不存在配体的情况下的活性来确定这些细胞是否按照自分泌模式生长。体内细胞增殖抑制活性的评价或测定可以通过利用与以上所述测定体内中和活性相同的试验评价或测定活性来进行。
药物组合物
另一方面，本发明的一个特征是包含可结合HB-EGF蛋白的抗体作为活性成分的药物组合物。本发明的另外一个特征是细胞增殖抑制剂，尤其是抗癌剂，其包含可结合HB-EGF蛋白的抗体作为活性成分。优选向患有癌症的受试者或处于癌症危险的受试者施用本发明的细胞增殖抑制剂和本发明的抗癌剂。
在本发明中，包含可结合HB-EGF蛋白的抗体作为活性成分的细胞增殖抑制剂也涉及包括向受试者施用可结合HB-EGF蛋白的抗体的步骤的抑制细胞增殖的方法，以及可结合HB-EGF蛋白的抗体在生产细胞增殖抑制剂中的应用。
另外，在本发明中，包含可结合HB-EGF蛋白的抗体作为活性成分的抗癌剂涉及包括向受试者施用可结合HB-EGF蛋白的抗体的步骤的预防或治疗癌症的方法，以及可结合HB-EGF蛋白的抗体在生产抗癌剂中的应用。
在本发明中，“包含可结合HB-EGF蛋白的抗体作为活性成分”意思是存在抗HB-EGF抗体作为主要的活性成分，但是对抗HB-EGF抗体的含量没有限制。
除了该抗体需具有结合HB-EGF蛋白的能力以外，对于本发明的药物组合物(例如，细胞增殖抑制剂或抗癌剂；同样适用于下文)中存在的抗体没有特别的限制，且也可以使用此处作为实例提供的任何抗体。
本发明的药物组合物的施用方式可以是口服给药或肠胃外给药。尤其优选肠胃外给药，且相应的给药途径可以包括注射、经鼻给药、经肺给药、经皮给药等。至于注射给药的例子，可以通过如静脉内注射、肌肉内注射、腹膜内注射或皮下注射全身施用或局部施用本发明的药物组合物。可以根据患者的年龄和症状选择适当的给药方式。剂量可以选自例如每次给药0.0001mg-1000mg/kg体重。或者，剂量可以选自每位患者0.001-100000mg。但是，本发明的药物组合物不限于上述剂量。
本发明的药物组合物可以根据通常的方法制备(例如，Remington’s Pharmaceutical Science，最新版本，Mark PublishingCompany，Easton，USA)，且可以包含药学上可接受的载体和药学上可接受的添加剂。例子是表面活性剂、赋形剂、着色剂、香料、防腐剂、稳定剂、缓冲液、悬浮剂、张度剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、流动性促进剂、掩味剂等，但对于前述没有限制，且可以适当地使用其它常用的载体。具体的例子有轻硅酐(light silicicanhydride)、乳糖、微晶纤维素、甘露醇、淀粉、羧甲纤维素钙、羧甲纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯乙缩醛二乙氨基醋酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、中链脂肪酸甘油三酯、聚氧乙烯硬化蓖麻油60、蔗糖、羧甲基纤维素、玉米淀粉、无机盐等。
说明书中明确引用的所有专利和参考文献的内容完整引入本文作为参考。日本专利申请2006-286824(该申请构成本申请引用的优先权的基础)的说明书和附图的内容也完整引入本文作为参考。
实施例
通过下面提供的实施例更详细地描述本发明，但本发明并不限于这些实施例。
免疫
1-1.免疫原的产生
1-1-1.HB-EGF表达载体的构建
为了构建HB-EGF表达载体，首先如下所述克隆HB-EGF基因。使用人类心脏cDNA(human Marathon Ready cDNA，ClontechLaboratories，Inc.)作为模板，使用Pyrobest Taq聚合酶(Takara BioInc.)进行RT-PCR，并克隆全长HB-EGF基因。
EGF-1：ATGAAGCTGCTGCCGTCGGTG(SEQ ID NO：69)
EGF-2：TCAGTGGGAATTAGTCATGCCC(SEQ ID NO：70)
(94℃/30秒，65℃/30秒，72℃/60秒：35个循环)
使用获得的PCR产物作为模板，在下面给出的条件下进行双PCR，获得全长HB-EGF cDNA片段，其中分别在5′和3′末端添加了SalI和NotI酶切序列。
EGF-3：TAAGTCGACCACCATGAAGCTGCTGCCGTCGGTG(SEQ ID NO：71)
EGF-4：TTTGCGGCCGCTCACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCGTGGGAATTAGTCATGCCCAAC(SEQ ID NO：72)
(94℃/30秒，65℃/30秒，72℃/60秒：25个循环)
用SalI和NotI消化该片段，并将该片段插入同样已用SalI和NotI消化的用于动物细胞的表达载体(pMCN)中，从而构建HB-EGF表达载体(pMCN_HB-EGF)。
1-1-2.HB-EGF_Fc融合蛋白表达载体的构建
使用HB-EGF的胞外区与小鼠IgG2a的Fc区的融合蛋白(HB-EGF_Fc)作为获得HB-EGF中和抗体的免疫原。用于免疫的融合蛋白的结构如图1所示。
如下所述构建小鼠Fc区/HB-EGF融合蛋白的表达载体。首先，使用HB-EGF表达载体(pMCN_HB-EGF)作为模板，在下面的条件下使用Pyrobest Taq聚合酶(Takara Bio Inc.)进行PCR。
EGF-5：AAAGAATTCCACCATGAAGCTGCTGCCGTC(SEQ IDNO：73)
EGF-6：TATCGGTCCGCGAGGTTCGAGGCTCAGCCCATGACACCTC(SEQID NO：74)
(94℃/30秒，68℃/30秒，72℃/30秒：25个循环)
然后用EcoRI和CpoI消化获得的PCR产物。将产生的DNA片段插入到含有小鼠IgG2a_Fc的动物细胞表达载体(pMCDN_mIgG2a_Fc)的EcoRI和CpoI之间，以构建HB-EGF-Fc表达载体(pMCDN_HB-EGF-Fc)。
1-1-3.HB-EGF_Fc产生株的产生
通过以1.5kV/25μFD电穿孔(来自Bio-Rad Laboratories，Inc.的基因脉冲器)，将已通过使用pvuI消化而线性化的15μgHB-EGF-Fc表达载体pMCDN_HB-EGF-Fc转染到悬浮于PBS(-)中的DG44细胞(1x10⁷细胞/mL，800μL)内。在用含有青霉素/链霉素(PS)的生长培养基(CHO-S-SFM II，Invitrogen Corporation)稀释到合适的细胞计数之后，将细胞接种到96孔板上，第二天加入500μg/mL G418(遗传霉素，Invitrogen Corporation)。大约2周后，在显微镜下选择具有单克隆的孔，并使用每孔10μL培养上清液进行SDS-PAGE。使用PVDF膜和山羊抗HB-EGF抗体(AF-259-NA，R&DSystems，Inc.)和HRP-抗山羊抗体(ACI3404，BioSource)，通过Western印迹法筛选产生HB-EGF-Fc的细胞株。选择最高产量的细胞株并进行扩大培养。
1-1-4.HB-EGF_Fc蛋白质的纯化
使用Hi Trap Protein G HP 1mL柱(Amersham Biosciences#17-0404-01)从获得的HB-EGF_Fc产生株的培养上清液中纯化HB-EGF_Fc蛋白质。以1mL/分钟的流速吸附培养上清液，接着用20mL 20mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)洗涤，然后用3.5mL 0.1M甘氨酸-HCl(pH 2.7)洗脱。在Eppendorf管中以0.5mL的级分回收洗脱物，其中每管已包含50μL 1M Tris-HCl(pH 9.0)。测定OD_280nm。合并含有靶蛋白质的级分，加入PBS(-)以达到2.5mL的总量，然后使用PD-10柱(Amersham Biosciences#17-0851-01)用PBS(-)替换缓冲液。使纯化的蛋白质通过0.22μm的过滤器(Millipore#SLGV033RS)并在4℃储存。
1-2.免疫
用完全佐剂(DIFCO DF263810)制备HB-EGF_Fc蛋白质的乳剂用于首次免疫，用不完全佐剂(DIFCO DF263910)制备用于第二次和随后的免疫。通过以50μg/鼠的剂量皮下注射(1mL Thermo注射器，26号针头)免疫三只动物[(MRL/lpr，雄性，鼠龄：4周)(balb/c，雌性，鼠龄：6周)，都购自Charles River Japan]。在首次免疫两周后，给予第二次免疫，并且以一周的间隔给予总共4-5次免疫。对于最后一次免疫，将HB-EGF_Fc(50μg)悬浮于100μL PBS中，并注射到尾静脉中；3天后进行细胞融合。
1-3.杂交瘤的产生
如下进行细胞融合。无菌条件下从小鼠中取出脾，并通过在培养基1(RPMI 1640+PS)中研磨制备单细胞悬浮液。使悬浮液通过70μm的尼龙筛(Falcon)以除去脂肪组织等，并对细胞计数。将获得的B细胞与小鼠骨髓瘤细胞(P3U1细胞)以大约2∶1的细胞计数比例混合；加入1mL 50％PEG(Roche，目录号783641)；并进行细胞融合。将融合细胞悬浮于培养基2(RPMI1640+PS，10％FCS，HAT(Sigma，H0262)，5％BM Condimed H1(Roche#1088947))中，以200μL/孔的量分配到适当数目的96孔板(10个板)中；并于37℃培养。一周后，使用培养上清液筛选杂交瘤，并分析杂交瘤。源自两只Balb/c小鼠的杂交瘤分别被命名为HA系列和HB系列，源自一只Mrl/lpr小鼠的杂交瘤被命名为HC系列。
抗HB-EGF中和抗体的筛选
2-1.表达HB-EGF的人细胞株的产生
2-1-1.HB-EGF_DG44株的产生
如下建立表达HB-EGF的DG44细胞株。首先，将如1-1-1所述构建的15μgHB-EGF表达载体pMCN_HB-EGF用pvuI消化，并通过使用与1-1-3中所述相同的程序的电穿孔将其转染到DG44细胞内。然后，挑选出G418抗性株，并用山羊抗HB-EGF抗体(R&DSystems，Inc.)和FITC-标记的抗山羊IgG抗体对细胞染色。用FACSCalibur(Becton，Dickinson and Company)分析在细胞表面上表达的HB-EGF，并选择高表达的克隆。
2-1-2.HB-EGF_Ba/F3株的产生
如下建立在细胞膜上表达HB-EGF的Ba/F3细胞株。用蛋白酶处理在细胞膜上表达的HB-EGF并切下进入培养基中。因此，首先构建在蛋白酶酶切位点处突变的proHB-EGF的表达载体。
使用pMCN-HB-EGF作为模板，使用下面的两组条件和PyrobestTaq聚合酶(Takara Bio Inc.)进行单独的PCR。
PCR反应1
EGF-3：TAAGTCGACCACCATGAAGCTGCTGCCGTCGGTG(SEQ ID NO：71)
EGF-7：CGATTTTCCACTGTGCTGCTCAGCCCATGACACCTCTC(SEQ IDNO：75)
(94℃/30秒，68℃/30秒，72℃/30秒：20个循环)
PCR反应2
EGF-8：TGGGCTGAGCAGCACAGTGGAAAATCGCTTATATACCTA(SEQID NO：76)
EGF-4：TTTGCGGCCGCTCACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCGTGGGAATTAGTCATGCCCAAC(SEQ ID NO：72)
(94℃/30秒，68℃/30秒，72℃/30秒：20个循环)
然后混合通过PCR反应1和2获得的两个DNA片段；使用Pyrobest Taq聚合酶(Takara Bio Inc.)进行重组反应(94℃/30秒，72℃/60秒：5个循环)；接着在以下条件下使用1μL的前述反应溶液作为模板进行PCR。
EGF-3：TAAGTCGACCACCATGAAGCTGCTGCCGTCGGTG(SEQ ID NO：71)
EGF-4：TTTGCGGCCGCTCACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCGTGGGAATTAGTCATGCCCAAC(SEQ ID NO：72)
(94℃/30秒，68℃/30秒，72℃/60秒：22个循环)
用SalI和NotI消化获得的PCR产物，接着将片段插入同样已用SalI和NotI消化的用于动物细胞的表达载体(pMCN)中，以构建proHB-EGF表达载体(pMCN-MHB-EGF)。
然后如下所述产生表达proHB-EGF的Ba/F3细胞株。用pvuI酶切15μg以上构建的proHB-EGF表达载体pMCN-MHB-EGF，然后通过以0.33kV/950μFD电穿孔(来自Bio-Rad Laboratories，Inc.的基因脉冲器)将其转染到悬浮于PBS(-)中的Ba/F3细胞(1x10⁷细胞/mL，800μL)中。然后在96孔板中在含有1ng/mL IL-3和500μg/mLG418的培养基(RPMI 1640，10％FCS，PS)中培养这些细胞，两周后，挑选出G418抗性株。用山羊抗HB-EGF抗体(R&D Systems，Inc.)和FITC-标记的抗小鼠IgG抗体(Beckman Coulter，PN IM0819)对细胞染色，并根据FACS(Becton，Dickinson and Company)选择呈现出高水平表达细胞表面HB-EGF的克隆。
2-2.表达HB-EGF的SKOV-3细胞的产生
如下所述建立表达HB-EGF的SKOV-3细胞株。在含有10％FCS和青霉素/链霉素(P/S)的生长培养基(McCoy 5A培养基，Invitrogen)中培养一种卵巢癌细胞株SKOV-3(购自ATTC)。
用pvuI消化1-1-1中构建的15μg HB-EGF表达载体pMCN_HB-EGF。接着通过以1.5kV/25μF电穿孔(来自Bio-RadLaboratories，Inc.的基因脉冲器)，将其转染到悬浮于PBS(-)中的SKOV-3细胞(1x10⁷细胞/mL，800μL)中。使用上述生长培养基稀释到合适的细胞计数后，将细胞接种到96孔板中。第二天以500μg/mL的量加入G418(遗传霉素，Invitrogen Corporation)。大约2周后，选择G418抗性单克隆并通过Western印迹法筛选表达HB-EGF的细胞株。选择最高产量的细胞株并用于随后的实验中。
2-3.显示HB-EGF-依赖性生长的EGFR_Ba/F3细胞株的产生
2-3-1.pCV-hEGFR/G-CSFR的构建
为了评价本发明的抗体的活性，构建表达由人EGFR的胞外区和小鼠G-CSFR的胞外区组成的嵌合受体(hEGFR/mG-CSFR)的载体。当HB-EGF与表达该嵌合受体的细胞结合时，对该细胞的效应如图2a所示。
为了克隆编码人表皮生长因子受体(EGFR)的胞外区的基因，用人类肝cDNA(Marathon Ready cDNA，Clontech Laboratories，Inc.)作为模板，使用下面列出的引物组进行PCR。SEQ ID NO：77和SEQID NO：78分别显示人EGFR的碱基序列(MN_005228)和氨基酸序列(NP_005219)。
EGFR-1：ATGCGACCCTCCGGGACGGC(SEQ ID NO：79)
EGFR-2：CAGTGGCGATGGACGGGATCT(SEQ ID NO：80)
(94℃/30秒，65℃/30秒，72℃/2分钟：35个循环)
从琼脂糖凝胶上切下扩增的cDNA(大约2kb)，并插入到pCR-TOPO载体(Invitrogen Corporation)中。分析插入该质粒中的片段的碱基序列，并确认获得的EGFR基因具有正确的序列。然后用上述获得的质粒作为模板，使用下面的引物组进行PCR。
EGFR-5：TTGCGGCCGCCACCATGCGACCCTCCGGGACGGC(SEQ ID NO：81)
EGFR-6：ACCAGATCTCCAGGAAAATGTTTAAGTCAGATGGATCGGACGGGATCTTAGGCCCATTCGT(SEQ ID NO：82)
(94℃/30秒，68℃/30秒，72℃/2分钟：25个循环)
获得编码EGFR胞外区并具有5′NotI位点和3′BglII位点的基因片段。用NotI-BglII消化该片段，并将其插入pCV_mG-CSFR中的NotI-BamHI之间。
通过用来自人G-CSF的poly(A)添加信号替换pCOS1(WO98/13388)的poly(A)添加信号来构建表达质粒载体pCV。用EcoRI和XbaI消化pEF-BOS(Mizushima S.等人，Nucleic Acids Res.18，5322(1990))以获得源自人G-CSF的poly(A)添加信号片段。将此片段插入pBacPAK8(Clontech Laboratories，Inc.)的EcoRI/XbaI位点处。用EcoRI消化之后，平端处理并用BamHI消化两个末端，从而产生在5′末端添加有BamHI位点和具有平端化的3′末端的含有来源于人G-CSF的poly(A)添加信号的片段。该片段在BamHI/EcoRV位点与pCOS1的poly(A)添加信号交换，产生被命名为pCV的表达质粒载体。
pCV_mG-CSFR在pCV中包含从位点623处的天冬酰胺残基到C末端的小鼠G-CSF受体，其是胞内区域。在SEQ ID NO：83中显示小鼠G-CSF受体的碱基序列(M58288)，在SEQ ID NO：84中显示小鼠G-CSF受体的氨基酸序列(AAA37673)。但是，由于在pCV_mG-CSFR的插入序列的N-末端区的编码cDNA序列中产生了BamHI位点(限制性酶切位点)，SEQ ID NO：84中位点632处的甘氨酸残基被谷氨酸残基替换。
通过证实插入pCV_mG-CSFR中的基因片断的碱基序列，完成了表达由人EGFR的胞外区和小鼠G-CSFR的胞内区组成的嵌合受体(hEGFR/mG-CSFR)的载体(pCV_hEGFR/mG-CSFR)的构建。
在SEQ ID NO：85和SEQ ID NO：86中分别显示由表达载体表达的蛋白质(即，人EGFR/小鼠G-CSFR嵌合受体)的碱基序列和氨基酸序列。
2-3-2.HB-EGF依赖性细胞株的产生
通过以0.33kV/950μFD电穿孔(基因脉冲器，Bio-RadLaboratories，Inc.)，将通过用pvuI消化而线性化的15μg(hEGFR/mG-CSFR)嵌合受体表达载体(pCV_hEGFR/mG-CSFR)转染到Ba/F3细胞内。在含有10ng/mL HB-EGF和500μg/mL G418的培养基(RPMI 1640，10％FCS，PS)中培养这些细胞2周，并挑选出出现的集落。
然后在下面的实验中确定获得的细胞株是否显示出依赖于HB-EGF浓度的生长。在0-100ng/mL HB-EGF(R&D Systems，Inc.，259-HE)的存在下，以1x10³细胞/孔的密度向96孔板上接种EGFR_Ba/F3细胞，接着培养3天。然后根据说明书使用WST-8试剂(细胞计数试剂盒-8，Dojindo Laboratories)确定细胞计数。
结果表明，以依赖于HB-EGF浓度的方式促进建立的EGFR_Ba/F3细胞株的生长(图2b)。
2-4.杂交瘤筛选
2-4-1.对结合HB-EGF的抗体的筛选(初步筛选)
为了获得抗HB-EGF中和抗体，首先筛选结合HB-EGF的抗体。使用ELISA和FACS来筛选结合抗体。
2-4-1-1.ELISA
杂交瘤培养上清液通过在1μg/mL HB-EGF蛋白(R&D Systems，Inc.，259-HE)包被的ELISA板(NUNC)中孵育1小时发生反应。接着与碱性磷酸酯酶(AP)标记的抗小鼠IgG(Zymed Laboratories，Inc.，#62-6622)反应1小时，之后通过加入1mg/mL底物(Sigma，S0942-50TAB)显色。用读板器(Bio-Rad Laboratories，Inc.)测定OD₄₀₅，并选择ELISA阳性孔。
2-4-1-2.FACS
向HB-EGF_Ba/F3细胞(大约1x10⁵细胞)加入杂交瘤培养上清液，并在4℃孵育1小时。然后加入FITC标记的抗小鼠IgG抗体(Beckman Coulter，PN IM0819)，并在4℃孵育30分钟。然后通过FACS(Becton，Dickinson and Company)分析每一种杂交瘤培养上清液对细胞表面HB-EGF的结合活性。
2-4-1-3.有限稀释
为了将根据ELISA或FACS分析显示HB-EGF结合活性的克隆分为单克隆，进行有限稀释(LD)。测定阳性孔中的细胞计数，并向96孔板上接种以提供3个细胞/孔。在培养大约10天后，再次通过对已经出现集落的孔中的培养上清液进行ELISA或FACS分析结合活性。使用这一系列步骤，在HA系列中获得5个显示HB-EGF结合活性的单克隆，在HB系列中获得4个显示HB-EGF结合活性的单克隆，在HC系列中获得5个显示HB-EGF结合活性的单克隆。
2-4-1-4.亚型确定
使用IsoStrips(Roche#1,493,027)确定抗体亚型。用PBS(-)稀释10倍的杂交瘤培养上清液用于亚型确定。
表1分离的抗体的特征

2-4-2.抗体纯化
使用HiTrap Protein G HP 1mL柱(Amersham Biosciences#17-0404-01)，从获得的单克隆杂交瘤的80mL培养上清液中纯化抗体。以1mL/min的流速吸附杂交瘤上清液，接着用20mL 20mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)洗涤，然后用3.5mL 0.1M甘氨酸-HCl(pH2.7)洗脱。在Eppendorf管中以0.5mL的级分回收洗脱物，其中每个管已包含50μL 1M Tris-HCl(pH 9.0)。测定OD_280nm。合并含有抗体的级分，加入PBS(-)以达到2.5mL的总量，然后使用PD-10柱(Amersham Biosciences#17-0851-01)用PBS(-)替换缓冲液。使纯化的抗体通过0.22μm的过滤器(Millipore#SLGV033RS)，并如下详细研究各个纯化的抗体的性质。
2-4-3.在EGFR_Ba/F3细胞中的生长中和活性的分析(第二筛选)
分析每种纯化的抗体对EGFR_Ba/F3的HB-EGF依赖性生长的中和活性。在HB-EGF(80ng/mL)的存在下，以2x10⁴细胞/孔的密度向96孔板上接种EGFR_Ba/F3细胞，并以0-200ng/mL的量加入特定的纯化抗体。培养3天后，使用WST-8(细胞计数试剂盒-8)测定细胞计数。
结果表明，HA系列中的HA-20、HB系列中的HB-20和HC系列中的HC-20显示强中和活性(图3a-3c)。
HB-EGF中和抗体(HA-20、HB-20、HC-15)的性质的分析
3-1.HA-20、HB-20和HC-15的可变区的克隆和氨基酸序列的测定
使用Trizol(#15596-018，Life Technologies)从大约5x10⁶个杂交瘤中纯化总RNA。使用SMART RACE cDNA扩增试剂盒(ClontechLaboratories，Inc.，#PT3269-1)，根据试剂盒提供的手册，由1μg获得的总RNA进行全长cDNA合成。对于每种抗体，使用获得的cDNA作为模板和使用Advantage 2PCR Enzyme System(ClontechLaboratories，Inc.#PT3281-1)，扩增编码重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的基因。
轻链可变区的克隆引物
UPM-k(VL-k)
UPM：试剂盒提供
VL-k：GCT CAC TGG ATG GTG GGA AGA TG(SEQ ID NO：91)
重链可变区的克隆引物
HA-20：UPM-VH-G1
HB-20，HC-15：UPM-VH-2a
UPM：试剂盒提供
VH-G1：GGG CCA GTG GAT AGA CAG ATG(SEQ ID NO：92)
VH-2a：CAG GGG CCA GTG GAT AGA CCG ATG(SEQ ID NO：93)
94℃/5秒，72℃/2分钟，5个循环
94℃/5秒，70℃/10秒，72℃/2分钟5个循环
94℃/5秒，68℃/10秒，72℃/2分钟，27个循环
将在前述步骤中扩增的基因片段TA-克隆到pCRII-TOPO(Invitrogen TOPO TA-克隆试剂盒，#45-0640)内，并测定每个插入片段的碱基序列。测定的可变区序列如图4所示。
3-2.活性型HB-EGF的结合活性的分析
为了比较这样获得的3种抗体(HA-20、HB-20、HC-15)结合活性型HB-EGF蛋白的能力，进行下面的实验。HA-20、HB-20或HC-15抗体在1μg/mL HB-EGF蛋白(R&D Systems，Inc.，259-HE)包被的板(NUNC)中以各种浓度反应。接着与碱性磷酸酯酶(AP)标记的抗小鼠IgG(Zymed Laboratories，Inc.，#62-6622)反应1小时，并加入1mg/mL底物(Sigma，S0942-50TAB)用于显色。用读板器测定OD₄₀₅，并根据用特定抗体获得的结合曲线计算达到50％结合的抗体浓度(ED₅₀)。至于对活性型HB-EGF的结合活性，观察到0.2-1.4nM的ED₅₀值，因而发现在所有情况中存在强结合活性(图5)。
表2.抗体HA-20、HB-20和HC-15结合HB-EGF的ED₅₀值

3-3.对proHB-EGF的结合活性的分析
然后分析获得的3种抗体对proHB-EGF的结合活性。在含有10％FCS的生长培养基(Ham’s F12培养基，Invitrogen Corporation)中培养RMG1细胞(卵巢癌细胞株，购自Japan Health SciencesFoundation)，已知其内在地表达HB-EGF。每种抗体(10μg/mL)在4℃下与内在地表达HB-EGF的RMG1细胞以及Ba/F3细胞(HB-EGF_Ba/F3)、表达HB-EGF的DG44细胞(HB-EGF_DG44)和SKOV-3细胞(HB-EGF_SKOV-3)(后三者是过量表达HB-EGF的细胞)反应1小时，接着用FITC标记的抗小鼠IgG抗体(BeckmanCoulter，PN IM0819)染色。然后通过FACS(Becton，Dickinson andCompany)分析每种抗体与细胞表面HB-EGF的结合。
图6所示的图中比较了根据FACS分析，HA-20、HB-20和HC-15抗体对RMG1细胞中内在表达的proHB-EGF和Ba/F3、DG44和SKOV-3细胞中过量表达的proHB-EGF的结合活性。灰色波形显示在缺乏第一抗体的情况下的染色图(对照)，而实线显示在存在特定抗体的情况下的染色图。横轴表示染色强度，纵轴表示细胞数。如图6所示，HB-20和HC-15识别在细胞膜上过量表达的HB-EGF和卵巢癌细胞株在细胞膜上内在表达的HB-EGF，而HA-20根本不结合或只是非常弱地结合。这些结果表明，HA-20是一种强力地结合活性型HB-EGF而不识别proHB-EGF的抗体。
3-4.中和活性的分析
3-4-1.抑制EGFR/HB-EGF结合的能力的固相分析
3-4-1-1.EGFR-Fc蛋白质的产生
为了构建在固相条件下可以检验HB-EGF与其受体(EGFR)之间的结合的ELISA系统，首先制备EGFR的胞外区与人IgG1的Fc区的融合蛋白(EGFR-Fc)作为受体蛋白质。HB-EGF抗体在固相上抑制HB-EGF与EGFR之间的结合的模式如图7所示。
首先构建EGFR-Fc表达载体。使用以下的引物并使用在实施例2-3-1中构建的pCV_hEGFR/mG-CSFR作为模板进行PCR。
EGFR-7：GTTAAGCTTCCACCATGCGACCCTCCGGGAC(SEQID NO：94)
EGFR-8：GTTGGTGACCGACGGGATCTTAGGCCCATTCGTTG(SEQ ID NO：95)
(94℃/30秒，72℃/30秒：25个循环)
用BstEII和HindIII酶切扩增的编码EGFR的胞外区的基因片段，并将其插入pMCDN2-Fc中的BstEII-HindIII之间。确认插入的基因片段的碱基序列，以完成表达人EGFR的胞外区与人IgG1的Fc区的融合蛋白(EGFR-Fc)的载体(pMCDN2_EGFR-Fc)的构建。由表达载体表达的蛋白质(即，EGFR-Fc)的碱基序列和氨基酸序列分别在SEQ ID NO：96和SEQ ID NO：97中显示。
然后如下建立产生EGFR-Fc蛋白质的细胞株。首先用pvuI消化15μg EGFR-Fc表达载体(pMCDN2_EGFR-Fc)，然后通过电穿孔将其转染到DG44细胞内。随后通过Western印迹法分析在G418抗性株的培养上清液中产生的EGFR-Fc蛋白质。因此，通过SDS-PAGE分离10μL特定培养上清液；印迹在PVDF膜上；并用HRP标记的抗人IgG抗体(Amersham，NA933V)检测靶蛋白。选择产生水平最高的克隆，进行扩大培养，并回收培养上清液。
如下进行EGFR-Fc蛋白质的纯化。获得的EGFR-Fc产生株的培养上清液以1mL/min的流速吸附在HiTrap Protein G HP 1mL柱(Amersham Biosciences#17-0404-01)上。在用20mL 20mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)洗涤后，用3.5mL 0.1M甘氨酸-HCl(pH 2.7)洗脱蛋白质。为了鉴别包含靶蛋白的级分，通过SDS-PAGE分离各10μL的回收级分，接着进行Western印迹法和考马斯亮蓝(CBB)染色。使用PD-10柱(Amersham Biosciences#17-0851-01)用PBS(-)替换缓冲液。使纯化的蛋白质通过0.22μm的过滤器(Millipore#SLGV033RS)，并在4℃储存。
3-4-1-2.使用ELISA对HB-EGF与EGFR之间的结合的分析
纯化的EGFR-Fc以0.5μg/mL的浓度在抗人IgG抗体包被的ELISA板中反应1小时。0-250ng/mL HB-EGF(R&D Systems，Inc.，259-HE)反应1小时，接着用生物素标记的抗HB-EGF抗体(R&DSystems，Inc.，BAF259)和AP标记的链霉抗生物素蛋白(Zymed，#43-8322)检测结合EGFR-Fc的HB-EGF蛋白。使用ELISA分析EGFR/HB-EGF结合模式的模型如图8所示。结果表明，用固相系统从大约4ng/mL的浓度开始可以检测到HB-EGF与EGFR的结合(图9)。
3-4-1-3.对HB-EGF/EGFR结合的抗体介导的抑制活性的分析
使用前述的固相系统分析2-4-2中获得的抗体对HB-EGF/EGFR结合的抑制活性。向固定有EGFR-Fc的ELISA板中加入各抗体和HB-EGF(50ng/mL)，并在室温下反应1小时。用TBS-T洗板并通过前述步骤检测结合EGFR的HB-EGF(图10)。
对于全部抗体都观察到浓度依赖性的抑制结合的能力，并且确定HA-20、HB-20和HC-15有特别强的结合抑制。
3-4-2.对EGFR_Ba/F3细胞的生长抑制活性
比较HA-20、HB-20和HC-15对EGFR_Ba/F3细胞的HB-EGF依赖性生长的中和活性。如上所述，在HB-EGF(80ng/mL)的存在下，以2x 10⁴细胞/孔的密度向96孔板中接种EGFR_Ba/F3细胞，并加入特定的纯化抗体。培养3天后，使用WST-8(细胞计数试剂盒-8)测定细胞计数，并构建生长曲线。根据获得的结果，计算处于最大抑制效应的50％时的抗体浓度(EC₅₀值)。
根据结果，HC-15显示对EGFR_Ba/F3细胞有最强的生长抑制效应(EC₅₀＝3.8nM)，接下来是HA-20(EC₅₀＝32.6nM)和HB-20(EC₅₀＝40.3nM)(图11)。
表3.HA-20、HB-20和HC-15抗体显示的对EGFR_Ba/F3细胞的生长抑制效应的ED₅₀值

3-4-3.对RMG-1细胞的生长抑制活性
如下分析对RMG-1细胞的中和活性。将RMG-1细胞(6x10³细胞/孔)接种到96孔板中的含有8％或2％FCS的Ham’s F12培养基中，然后加入特定抗体。培养一周后，使用WST-8试剂测定细胞计数。
根据结果，HA-20以抗体浓度依赖性的方式抑制RMG-1细胞的生长(图12)。在2％FCS浓度时，生长抑制活性特别明显。
序列表
<110>株式会社未来创药研究所(Forerunner Pharma Research Co.，Ltd.)
<120>含有抗HB-EGF抗体的抗癌剂
<130>PCG-9019WO
<150>JP 2006-286824
<151>2006-10-20
<160>97
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>15
<212>DNA
<213>小鼠
<400>1
agctactgga tgcac                                           15
<210>2
<211>5
<212>PRT
<213>小鼠
<400>2
Ser Tyr Trp Met His
1               5
<210>3
<211>51
<212>DNA
<213>小鼠
<400>3
gagattaatc ctagcaacgg tcgtactaac tacaatgaga agttcaagag c   51
<210>4
<211>17
<212>PRT
<213>小鼠
<400>4
Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
Ser
<210>5
<211>15
<212>DNA
<213>小鼠
<400>5
tccctctttg actac                                           15
<210>6
<211>5
<212>PRT
<213>小鼠
<400>6
Ser Leu Phe Asp Tyr
1               5
<210>7
<211>990
<212>DNA
<213>小鼠
<400>7
acaacaacag ccccatctgt ctatcccttg gtccctggct gcagtgacac atctggatcc   60
tcggtgacac tgggatgcct tgtcaaaggc tacttccctg agccggtaac tgtaaaatgg  120
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tattccctca gcagcttggt gactgtaccc tccagcacct ggcccagcca gactgtcatc  240
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tccgtcttca tcttcccccc aaagcccaag gatgcactca tgatctccct aacccccaag  420
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aagaacctgt ctcgctcccc tggtaaatga                                     990
<210>8
<211>329
<212>PRT
<213>小鼠
<400>8
Thr Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Val Pro Gly Cys Ser Asp
1               5                   10                  15
Thr Ser Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe
            20                  25                  30
Pro Glu Pro Val Thr Val Lys Trp Asn Tyr Gly Ala Leu Ser Ser Gly
        35                  40                  45
Val Arg Thr Val Ser Ser Val Leu Gln Ser Gly Phe Tyr Ser Leu Ser
    50                  55                  60
Ser Leu Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val Ile
65                  70                  75                  80
Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Lys Thr Glu Leu Ile Lys Arg Ile
                85                  90                  95
Glu Pro Arg Ile Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Cys Pro
            100                 105                 110
Pro Gly Asn Ile Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys
        115                 120                 125
Pro Lys Asp Ala Leu Met Ile Ser Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val
    130                 135                 140
Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val His Val Ser Trp Phe
145                 150                 155                 160
Val Asp Asn Lys Glu Val His Thr Ala Trp Thr Gln Pro Arg Glu Ala
                165                 170                 175
Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His
            180                 185                 190
Gln Asp Trp Met Arg Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys
        195                 200                 205
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Arg
    210                 215                 220
Ala Gln Thr Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Arg Glu Gln Met
225                 230                 235                 240
Ser Lys Lys Lys Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Thr Asn Phe Phe Ser
                245                 250                 255
Glu Ala Ile Ser Val Glu Trp Glu Arg Asn Gly Glu Leu Glu Gln Asp
            260                 265                 270
Tyr Lys Asn Thr Pro Pro Ile Leu Asp Ser Asp Gly Thr Tyr Phe Leu
        275                 280                 285
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Thr Asp Ser Trp Leu Gln Gly Glu Ile
    290                 295                 300
Phe Thr Cys Ser Val Val His Glu Ala Leu His Asn His His Thr Gln
305                 310                 315                 320
Lys Asn Leu Ser Arg Ser Pro Gly Lys
                325
<210>9
<211>984
<212>DNA
<213>人
<400>9
gcctccacca agggcccatc cgtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag    60
agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg    120
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca    180
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacgaagacc    240
tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagtcc    300
aaatatggtc ccccatgccc atcatgccca gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc    360
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<212>PRT
<213>人
<400>10
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1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
            100                 105                 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
        115                 120                 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
    130                 135                 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145                 150                 155                 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165                 170                 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
                180                 185                 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
            195                 200                 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
        210                 215                 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225                 230                 235                 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
                245                 250                 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
            260                 265                 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
        275                 280                 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
    290                 295                 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305                 310                 315                 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
                325
<210>11
<211>36
<212>DNA
<213>小鼠
<400>11
agtgccagct caagtataag ttccaattac ttgcat                36
<210>12
<211>12
<212>PRT
<213>小鼠
<400>12
Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Ser Asn Tyr Leu His
1               5                   10
<210>13
<211>21
<212>DNA
<213>小鼠
<400>13
aggacatcca atctggcttc t                                21
<210>14
<211>7
<212>PRT
<213>小鼠
<400>14
Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1               5
<210>15
<211>27
<212>DNA
<213>小鼠
<400>15
cagcagggta gtagtatacc attcacg                    27
<210>16
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>16
Gln Gln Gly Ser Ser Ile Pro Phe Thr
1               5
<210>17
<211>324
<212>DNA
<213>小鼠
<400>17
cgggctgatg ctgcaccaac tgtatccatc ttcccaccat ccagtgagca gttaacatct     60
ggaggtgcct cagtcgtgtg cttcttgaac aacttctacc ccaaagacat caatgtcaag    120
tggaagattg atggcagtga acgacaaaat ggcgtcctga acagttggac tgatcaggac    180
agcaaagaca gcacctacag catgagcagc accctcacgt tgaccaagga cgagtatgaa    240
cgacataaca gctatacctg tgaggccact cacaagacat caacttcacc cattgtcaag    300
agcttcaaca ggaatgagtg ttag                                           324
<210>18
<211>107
<212>PRT
<213>小鼠
<400>18
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1               5                   10                  15
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
            20                  25                  30
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
        35                  40                  45
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
    50                  55                  60
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
65                  70                  75                  80
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
            85                  90                  95
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
        100                 105
<210>19
<211>324
<212>DNA
<213>人
<400>19
cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct     60
ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag    120
tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac    180
agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag    240
aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag    300
agcttcaaca ggggagagtg ttga                                           324
<210>20
<211>107
<212>PRT
<213>人
<400>20
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1               5                   10                  15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
            20                  25                  30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
        35                  40                  45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
    50                  55                  60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65                  70                  75                  80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
                85                  90                  95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
            100                 105
<210>21
<211>15
<212>DNA
<213>小鼠
<400>21
ggctatggta taaac                                        15
<210>22
<211>5
<212>PRT
<213>小鼠
<400>22
Gly Tyr Gly Ile Asn
1               5
<210>23
<211>48
<212>DNA
<213>小鼠
<400>23
atgatctggg gtgatggaag cgcagactat aattcagctc tcaaatcc    48
<210>24
<211>16
<212>PRT
<213>小鼠
<400>24
Met Ile Trp Gly Asp Gly Ser Ala Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
1               5                   10                  15
<210>25
<211>30
<212>DNA
<213>小鼠
<400>25
ggggattact acggctacag gttttcttac                        30
<210>26
<211>10
<212>PRT
<213>小鼠
<400>26
Gly Asp Tyr Tyr Gly Tyr Arg Phe Ser Tyr
1               5                   10
<210>27
<211>975
<212>DNA
<213>小鼠
<400>27
gccaaaacga cacccccatc tgtctatcca ctggcccctg gatctgctgc ccaaactaac     60
tccatggtga ccctgggatg cctggtcaag ggctatttcc ctgagccagt gacagtgacc    120
tggaactctg gatccctgtc cagcggtgtg cacaccttcc cagctgtcct gcagtctgac    180
ctctacactc tgagcagctc agtgactgtc ccctccagca cctggcccag ccagaccgtc    240
acctgcaacg ttgcccaccc ggccagcagc accaaggtgg acaagaaaat tgtgcccagg    300
gattgtggtt gtaagccttg catatgtaca gtcccagaag tatcatctgt cttcatcttc    360
cccccaaagc ccaaggatgt gctcaccatt actctgactc ctaaggtcac gtgtgttgtg    420
gtagacatca gcaaggatga tcccgaggtc cagttcagct ggtttgtaga tgatgtggag    480
gtgcacacag ctcagacaaa accccgggag gagcagttca acagcacttt ccgttcagtc    540
agtgaacttc ccatcatgca ccaggactgg ctcaatggca aggagttcaa atgcagggtc    600
aacagtgcag ctttccctgc ccccatcgag aaaaccatct ccaaaaccaa aggcagaccg    660
aaggctccac aggtgtacac cattccacct cccaaggagc agatggccaa ggataaagtc    720
agtctgacct gcatgataac agacttcttc cctgaagaca ttactgtgga gtggcagtgg    780
aatgggcagc cagcggagaa ctacaagaac actcagccca tcatggacac agatggctct    840
tacttcgtct acagcaagct caatgtgcag aagagcaact gggaggcagg aaatactttc    900
acctgctctg tgttacatga gggcctgcac aaccaccata ctgagaagag cctctcccac    960
tctcctggta aatga                                                     975
<210>28
<211>324
<212>PRT
<213>小鼠
<400>28
Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala
1               5                   10                  15
Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu
    50                  55                  60
Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val
65                  70                  75                  80
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
                85                  90                  95
Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro
            100                 105                 110
Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu
        115                 120                 125
Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser
    130                 135                 140
Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu
145                 150                 155                 160
Val His Thr Ala Gln Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
                165                 170                 175
Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn
            180                 185                 190
Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro
        195                 200                 205
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln
    210                 215                 220
Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val
225                 230                 235                 240
Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val
                245                 250                 255
Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln
            260                 265                 270
Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn
        275                 280                 285
Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val
    290                 295                 300
Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His
305                 310                 315                 320
Ser Pro Gly Lys
<210>29
<211>51
<212>DNA
<213>小鼠
<400>29
aagtccagtc aaagtgtttt atacagttca aatcagaaga acttcttggc c     51
<210>30
<211>17
<212>PRT
<213>小鼠
<400>30
Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Phe Leu
1               5                   10                  15
Ala
<210>31
<211>21
<212>DNA
<213>小鼠
<400>31
tgggcatcca ctagggaatc t                                      21
<210>32
<211>7
<212>PRT
<213>小鼠
<400>32
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1               5
<210>33
<211>24
<212>DNA
<213>小鼠
<400>33
catcaatacc tctcctcgta tacg                                      24
<210>34
<211>8
<212>PRT
<213>小鼠
<400>34
His Gln Tyr Leu Ser Ser Tyr Thr
1               5
<210>35
<211>15
<212>DNA
<213>小鼠
<400>35
ggctactaca tgcac                                                15
<210>36
<211>5
<212>PRT
<213>小鼠
<400>36
Gly Tyr Tyr Met His
1               5
<210>37
<211>51
<212>DNA
<213>小鼠
<400>37
gagattaatc ctagaactgg tattactacc tacaaccaga agttcaaggc c        51
<210>38
<211>17
<212>PRT
<213>小鼠
<400>38
Glu Ile Asn Pro Arg Thr Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
Ala
<210>39
<211>27
<212>DNA
<213>小鼠
<400>39
gttggcagct cgggcccttt tacgtac                                   27
<210>40
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>40
Val Gly Ser Ser Gly Pro Phe Thr Tyr
1               5
<210>41
<211>33
<212>DNA
<213>小鼠
<400>41
cgggcaagtc aggacattca tggttattta aac                            33
<210>42
<211>11
<212>PRT
<213>小鼠
<400>42
Arg Ala Ser Gln Asp Ile His Gly Tyr Leu Asn
1               5                   10
<210>43
<211>21
<212>DNA
<213>小鼠
<400>43
gaaacatcca atttagattc t                                   21
<210>44
<211>7
<212>PRT
<213>小鼠
<400>44
Glu Thr Ser Asn Leu Asp Ser
1               5
<210>45
<211>24
<212>DNA
<213>小鼠
<400>45
ctacaatatg ctagttcgct cacg                                24
<210>46
<211>8
<212>PRT
<213>小鼠
<400>46
Leu Gln Tyr Ala Ser Ser Leu Thr
1               5
<210>47
<211>399
<212>DNA
<213>小鼠
<400>47
atgggatgga gctatatcat cctctttttg gtagcaacag ctacagatgt ccactcccag     60
gtccaactgc agcagcctgg ggctgaactg gtgaagcctg gggcttcagt gaagctgtcc    120
tgcaaggctt ctggctacac cttcaccagc tactggatgc actgggtgaa gcagaggcct    180
ggacaaggcc ttgagtggat tggagagatt aatcctagca acggtcgtac taactacaat    240
gagaagttca agagcaaggc cacactgact gtagacaaat cctccagcac agcctacatg    300
caactcagca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgtatg gtccctcttt    360
gactactggg gccaaggcac cactctcaca gtctcctca                           399
<210>48
<211>133
<212>PRT
<213>小鼠
<400>48
Met Gly Trp Ser Tyr Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Asp
1               5                   10                   15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys
            20                  25                  30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
        35                  40                  45
Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn
65                  70                  75                  80
Glu Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser
                85                  90                  95
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
            100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Val Trp Ser Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
        115                 120                 125
Leu Thr Val Ser Ser
    130
<210>49
<211>378
<212>DNA
<213>小鼠
<400>49
atgcagatta tcagcttgct gctaatcagt gtcacagtca tagtgtctaa tggagaaatt     60
gtgctcaccc agtctccaac caccatggct gcatctcccg gggagaagat cactatcacc    120
tgcagtgcca gctcaagtat aagttccaat tacttgcatt ggtatcagca gaagccagga    180
ttctccccta aactcttgat ttataggaca tccaatctgg cttctggagt cccagctcgc    240
ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa ttggcaccat ggaggctgaa    300
gatgttgcca cttactactg ccagcagggt agtagtatac cattcacgtt cggctcgggg    360
acaaagttgg aaataaaa                                                  378
<210>50
<211>126
<212>PRT
<213>小鼠
<400>50
Met Gln Ile Ile Ser Leu Leu Leu Ile Ser Val Thr Val Ile Val Ser
1               5                   10                  15
Asn Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Thr Thr Met Ala Ala Ser
            20                  25                  30
Pro Gly Glu Lys Ile Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser
        35                  40                  45
Ser Asn Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Phe Ser Pro Lys
    50                  55                  60
Leu Leu Ile Tyr Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg
65                  70                  75                  80
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Gly Thr
                85                  90                  95
Met Glu Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Ser
            100                 105                 110
Ile Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
        115                 120                 125
<210>51
<211>411
<212>DNA
<213>小鼠
<400>51
atggctgtcc tggcattact cttctgcctg gtaacattcc caagctgtat cctttcccag     60
gtgcagctga aggagtcagg acctggcctg gtggcgccct cacagagcct gtccatcaca    120
tgcaccgtct cagggttctc attaaccggc tatggtataa actgggttcg ccagcctcca    180
ggaaagggtc tggagtggct gggaatgatc tggggtgatg gaagcgcaga ctataattca    240
gctctcaaat ccagactgag catccgcaag gacaactcca agagccaagt tttcttagaa    300
atgaacagtc tgcaaactga tgacacagcc aggtactact gtgccagagg ggattactac    360
ggctacaggt tttcttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc a             411
<210>52
<211>137
<212>PRT
<213>小鼠
<400>52
Met Ala Val Leu Ala Leu Leu Phe Cys Leu Val Thr Phe Pro Ser Cys
1               5                   10                  15
Ile Leu Ser Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala
            20                  25                  30
Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu
        35                  40                  45
Thr Gly Tyr Gly Ile Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Leu Gly Met Ile Trp Gly Asp Gly Ser Ala Asp Tyr Asn Ser
65                  70                  75                  80
Ala Leu Lys Ser Arg Leu Ser Ile Arg Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln
                85                  90                  95
Val Phe Leu Glu Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Arg Tyr
            100                 105                 110
Tyr Cys Ala Arg Gly Asp Tyr Tyr Gly Tyr Arg Phe Ser Tyr Trp Gly
        115                 120                 125
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
    130                 135
<210>53
<211>396
<212>DNA
<213>小鼠
<400>53
atggaatcac agactcaggt cttcctctcc ctgctgctct gggtatctgg tacctttggg     60
aacattatgc tgacacagtc gccatcatct ctggctgtgt ctgcaggaga aaaggtcact    120
atgagctgta agtccagtca aagtgtttta tacagttcaa atcagaagaa cttcttggcc    180
tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tctactgggc atccactagg    240
gaatctggtg tccctgatcg cttcgcaggc agtggatctg ggacagattt tactcttacc    300
atcagcagtg tacaaactga agacctggca gtttattact gtcatcaata cctctcctcg    360
tatacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa                              396
<210>54
<211>132
<212>PRT
<213>小鼠
<400>54
Met Glu Ser Gln Thr Gln Val Phe Leu Ser Leu Leu Leu Trp Val Ser
1               5                   10                  15
Gly Thr Phe Gly Asn Ile Met Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala
            20                  25                  30
Val Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser
        35                  40                  45
Val Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln
    50                  55                  60
Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg
65                  70                  75                  80
Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ala Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
                85                  90                  95
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Thr Glu Asp Leu Ala Val Tyr
            100                 105                 110
Tyr Cys His Gln Tyr Leu Ser Ser Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
        115                 120                 125
Leu Glu Ile Lys
    130
<210>55
<211>411
<212>DNA
<213>小鼠
<400>55
atgggatgga actggatctt tattttaatc ctgtcagtaa ctacaggtgt ccactctgag     60
gtccagctgc agcagtctgg acctgagctg gtgaagcctg gggcttcagt gaagatatcc    120
tgcaaggctt ctggttactc attcactggc tactacatgc actgggtgaa gcaaagtcct    180
gaaaagagac ttgagtggat tggagagatt aatcctagaa ctggtattac tacctacaac    240
cagaagttca aggccaaggc cacattgact gtagacaaat cctccagcac agcctacatg    300
cagctcaaga gcctgacatc tgaggactct gcagtctatt actgtgcaag agttggcagc    360
tcgggccctt ttacgtactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc a             411
<210>56
<211>137
<212>PRT
<213>小鼠
<400>56
Met Gly Trp Asn Trp Ile Phe Ile Leu Ile Leu Ser Val Thr Thr Gly
1               5                   10                  15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys
            20                  25                  30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe
        35                  40                  45
Thr Gly Tyr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser Pro Glu Lys Arg Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Arg Thr Gly Ile Thr Thr Tyr Asn
65                  70                  75                  80
Gln Lys Phe Lys Ala Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser
                85                  90                  95
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
            100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Gly Ser Ser Gly Pro Phe Thr Tyr Trp Gly
        115                 120                 125
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
    130                 135
<210>57
<211>384
<212>DNA
<213>小鼠
<400>57
atggacatga gggctcctgc tcaggttttt ggcttcttgt tgctctggtt tccaggtgcc     60
agatgtgaca tccagatgac ccagtctcca tcctccttat ctgcctctct gggagaaaga    120
gtcagtctca cttgccgggc aagtcaggac attcatggtt atttaaactt gtttcagcag    180
aaaccaggtg aaactattaa acacctgatc tatgaaacat ccaatttaga ttctggtgtc    240
ccgaaaaggt tcagtggcag taggtctggg tcagattatt ctctcattat cggcagcctt    300
gagtctgaag attttgcaga ctattactgt ctacaatatg ctagttcgct cacgttcggt    360
gctgggacca agctggagct gaaa                                           384
<210>58
<211>128
<212>PRT
<213>小鼠
<400>58
Met Asp Met Arg Ala Pro Ala Gln Val Phe Gly Phe Leu Leu Leu Trp
1               5                   10                  15
Phe Pro Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
            20                  25                  30
Leu Ser Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser
        35                  40                  45
Gln Asp Ile His Gly Tyr Leu Asn Leu Phe Gln Gln Lys Pro Gly Glu
    50                  55                  60
Thr Ile Lys His Leu Ile Tyr Glu Thr Ser Asn Leu Asp Ser Gly Val
65                  70                  75                  80
Pro Lys Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Ile
                85                  90                  95
Ile Gly Ser Leu Glu Ser Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln
            100                 105                 110
Tyr Ala Ser Ser Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
        115                 120                 125
<210>59
<211>627
<212>DNA
<213>人
<400>59
atgaagctgc tgccgtcggt ggtgctgaag ctctttctgg ctgcagttct ctcggcactg     60
gtgactggcg agagcctgga gcggcttcgg agagggctag ctgctggaac cagcaacccg    120
gaccctccca ctgtatccac ggaccagctg ctacccctag gaggcggccg ggaccggaaa    180
gtccgtgact tgcaagaggc agatctggac cttttgagag tcactttatc ctccaagcca    240
caagcactgg ccacaccaaa caaggaggag cacgggaaaa gaaagaagaa aggcaagggg    300
ctagggaaga agagggaccc atgtcttcgg aaatacaagg acttctgcat ccatggagaa    360
tgcaaatatg tgaaggagct ccgggctccc tcctgcatct gccacccggg ttaccatgga    420
gagaggtgtc atgggctgag cctcccagtg gaaaatcgct tatataccta tgaccacaca    480
accatcctgg ccgtggtggc tgtggtgctg tcatctgtct gtctgctggt catcgtgggg    540
cttctcatgt ttaggtacca taggagagga ggttatgatg tggaaaatga agagaaagtg    600
aagttgggca tgactaattc ccactga                                        627
<210>60
<211>208
<212>PRT
<213>人
<400>60
Met Lys Leu Leu Pro Ser Val Val Leu Lys Leu Phe Leu Ala Ala Val
1               5                   10                  15
Leu Ser Ala Leu Val Thr Gly Glu Ser Leu Glu Arg Leu Arg Arg Gly
            20                  25                  30
Leu Ala Ala Gly Thr Ser Asn Pro Asp Pro Pro Thr Val Ser Thr Asp
        35                  40                  45
Gln Leu Leu Pro Leu Gly Gly Gly Arg Asp Arg Lys Val Arg Asp Leu
    50                  55                  60
Gln Glu Ala Asp Leu Asp Leu Leu Arg Val Thr Leu Ser Ser Lys Pro
65                  70                  75                  80
Gln Ala Leu Ala Thr Pro Asn Lys Glu Glu His Gly Lys Arg Lys Lys
                85                  90                  95
Lys Gly Lys Gly Leu Gly Lys Lys Arg Asp Pro Cys Leu Arg Lys Tyr
            100                 105                 110
Lys Asp Phe Cys Ile His Gly Glu Cys Lys Tyr Val Lys Glu Leu Arg
        115                 120                 125
Ala Pro Ser Cys Ile Cys His Pro Gly Tyr His Gly Glu Arg Cys His
    130                 135                 140
Gly Leu Ser Leu Pro Val Glu Asn Arg Leu Tyr Thr Tyr Asp His Thr
145                 150                 155                 160
Thr Ile Leu Ala Val Val Ala Val Val Leu Ser Ser Val Cys Leu Leu
                165                 170                 175
Val Ile Val Gly Leu Leu Met Phe Arg Tyr His Arg Arg Gly Gly Tyr
            180                 185                 190
Asp Val Glu Asn Glu Glu Lys Val Lys Leu Gly Met Thr Asn Ser His
        195                 200                 205
<210>61
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工连接体
<400>61
Gly Gly Gly Ser
1
<210>62
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工连接体
<400>62
Ser Gly Gly Gly
1
<210>63
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工连接体
<400>63
Gly Gly Gly Gly Ser
1               5
<210>64
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工连接体
<400>64
Ser Gly Gly Gly Gly
1               5
<210>65
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工连接体
<400>65
Gly Gly Gly Gly Gly Ser
1               5
<210>66
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工连接体
<400>66
Ser Gly Gly Gly Gly Gly
1               5
<210>67
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工连接体
<400>67
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser
1               5
<210>68
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工连接体
<400>68
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1               5
<210>69
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>69
atgaagctgc tgccgtcggt g                                              21
<210>70
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>70
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<210>71
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>71
taagtcgacc accatgaagc tgctgccgtc ggtg                                34
<210>72
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>72
tttgcggccg ctcacttgtc atcgtcgtcc ttgtagtcgt gggaattagt catgcccaac    60
<210>73
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>73
aaagaattcc accatgaagc tgctgccgtc                                     30
<210>74
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>74
tatcggtccg cgaggttcga ggctcagccc atgacacctc                          40
<210>75
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>75
cgattttcca ctgtgctgct cagcccatga cacctctc                            38
<210>76
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>76
tgggctgagc agcacagtgg aaaatcgctt atataccta    39
<210>77
<211>3633
<212>DNA
<213>人
<400>77
atgcgaccct ccgggacggc cggggcagcg ctcctggcgc tgctggctgc gctctgcccg      60
gcgagtcggg ctctggagga aaagaaagtt tgccaaggca cgagtaacaa gctcacgcag     120
ttgggcactt ttgaagatca ttttctcagc ctccagagga tgttcaataa ctgtgaggtg     180
gtccttggga atttggaaat tacctatgtg cagaggaatt atgatctttc cttcttaaag     240
accatccagg aggtggctgg ttatgtcctc attgccctca acacagtgga gcgaattcct     300
ttggaaaacc tgcagatcat cagaggaaat atgtactacg aaaattccta tgccttagca     360
gtcttatcta actatgatgc aaataaaacc ggactgaagg agctgcccat gagaaattta     420
caggaaatcc tgcatggcgc cgtgcggttc agcaacaacc ctgccctgtg caacgtggag     480
agcatccagt ggcgggacat agtcagcagt gactttctca gcaacatgtc gatggacttc     540
cagaaccacc tgggcagctg ccaaaagtgt gatccaagct gtcccaatgg gagctgctgg     600
ggtgcaggag aggagaactg ccagaaactg accaaaatca tctgtgccca gcagtgctcc     660
gggcgctgcc gtggcaagtc ccccagtgac tgctgccaca accagtgtgc tgcaggctgc     720
acaggccccc gggagagcga ctgcctggtc tgccgcaaat tccgagacga agccacgtgc     780
aaggacacct gccccccact catgctctac aaccccacca cgtaccagat ggatgtgaac     840
cccgagggca aatacagctt tggtgccacc tgcgtgaaga agtgtccccg taattatgtg     900
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ggtattggtg aatttaaaga ctcactctcc ataaatgcta cgaatattaa acacttcaaa    1080
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atcacagggt ttttgctgat tcaggcttgg cctgaaaaca ggacggacct ccatgccttt    1260
gagaacctag aaatcatacg cggcaggacc aagcaacatg gtcagttttc tcttgcagtc    1320
gtcagcctga acataacatc cttgggatta cgctccctca aggagataag tgatggagat    1380
gtgataattt caggaaacaa aaatttgtgc tatgcaaata caataaactg gaaaaaactg    1440
tttgggacct ccggtcagaa aaccaaaatt ataagcaaca gaggtgaaaa cagctgcaag    1500
gccacaggcc aggtctgcca tgccttgtgc tcccccgagg gctgctgggg cccggagccc    1560
agggactgcg tctcttgccg gaatgtcagc cgaggcaggg aatgcgtgga caagtgcaac    1620
cttctggagg gtgagccaag ggagtttgtg gagaactctg agtgcataca gtgccaccca    1680
gagtgcctgc ctcaggccat gaacatcacc tgcacaggac ggggaccaga caactgtatc    1740
cagtgtgccc actacattga cggcccccac tgcgtcaaga cctgcccggc aggagtcatg    1800
ggagaaaaca acaccctggt ctggaagtac gcagacgccg gccatgtgtg ccacctgtgc    1860
catccaaact gcacctacgg atgcactggg ccaggtcttg aaggctgtcc aacgaatggg    1920
cctaagatcc cgtccatcgc cactgggatg gtgggggccc tcctcttgct gctggtggtg    1980
gccctgggga tcggcctctt catgcgaagg cgccacatcg ttcggaagcg cacgctgcgg    2040
aggctgctgc aggagaggga gcttgtggag cctcttacac ccagtggaga agctcccaac    2100
caagctctct tgaggatctt gaaggaaact gaattcaaaa agatcaaagt gctgggctcc    2160
ggtgcgttcg gcacggtgta taagggactc tggatcccag aaggtgagaa agttaaaatt    2220
cccgtcgcta tcaaggaatt aagagaagca acatctccga aagccaacaa ggaaatcctc    2280
gatgaagcct acgtgatggc cagcgtggac aacccccacg tgtgccgcct gctgggcatc    2340
tgcctcacct ccaccgtgca gctcatcacg cagctcatgc ccttcggctg cctcctggac    2400
tatgtccggg aacacaaaga caatattggc tcccagtacc tgctcaactg gtgtgtgcag    2460
atcgcaaagg gcatgaacta cttggaggac cgtcgcttgg tgcaccgcga cctggcagcc    2520
aggaacgtac tggtgaaaac accgcagcat gtcaagatca cagattttgg gctggccaaa    2580
ctgctgggtg cggaagagaa agaataccat gcagaaggag gcaaagtgcc tatcaagtgg    2640
atggcattgg aatcaatttt acacagaatc tatacccacc agagtgatgt ctggagctac    2700
ggggtgaccg tttgggagtt gatgaccttt ggatccaagc catatgacgg aatccctgcc    2760
agcgagatct cctccatcct ggagaaagga gaacgcctcc ctcagccacc catatgtacc    2820
atcgatgtct acatgatcat ggtcaagtgc tggatgatag acgcagatag tcgcccaaag    2880
ttccgtgagt tgatcatcga attctccaaa atggcccgag acccccagcg ctaccttgtc    2940
attcaggggg atgaaagaat gcatttgcca agtcctacag actccaactt ctaccgtgcc    3000
ctgatggatg aagaagacat ggacgacgtg gtggatgccg acgagtacct catcccacag    3060
cagggcttct tcagcagccc ctccacgtca cggactcccc tcctgagctc tctgagtgca    3120
accagcaaca attccaccgt ggcttgcatt gatagaaatg ggctgcaaag ctgtcccatc    3180
aaggaagaca gcttcttgca gcgatacagc tcagacccca caggcgcctt gactgaggac    3240
agcatagacg acaccttcct cccagtgcct gaatacataa accagtccgt tcccaaaagg    3300
cccgctggct ctgtgcagaa tcctgtctat cacaatcagc ctctgaaccc cgcgcccagc    3360
agagacccac actaccagga cccccacagc actgcagtgg gcaaccccga gtatctcaac    3420
actgtccagc ccacctgtgt caacagcaca ttcgacagcc ctgcccactg ggcccagaaa    3480
ggcagccacc aaattagcct ggacaaccct gactaccagc aggacttctt tcccaaggaa    3540
gccaagccaa atggcatctt taagggctcc acagctgaaa atgcagaata cctaagggtc    3600
gcgccacaaa gcagtgaatt tattggagca tga                                 3633
<210>78
<211>1210
<212>PRT
<213>人
<400>78
Met Arg Pro Ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala
1               5                   10                  15
Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln
            20                  25                  30
Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe
        35                  40                  45
Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn
    50                  55                  60
Leu Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys
65                  70                  75                  80
Thr Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr Val
                85                  90                  95
Glu Arg Ile Pro Leu Glu Asn Leu Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met Tyr
            100                 105                 110
Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn
        115                 120                 125
Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro Met Arg Asn Leu Gln Glu Ile Leu
    130                 135                 140
His Gly Ala Val Arg Phe Ser Asn Asn Pro Ala Leu Cys Asn Val Glu
145                 150                 155                 160
Ser Ile Gln Trp Arg Asp Ile Val Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn Met
                165                 170                 175
Ser Met Asp Phe Gln Asn His Leu Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp Pro
            180                 185                 190
Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gln
        195                 200                 205
Lys Leu Thr Lys Ile Ile Cys Ala Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys Arg
    210                 215                 220
Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys Hi s Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys
225                 230                 235                 240
Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp
                245                 250                 255
Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro
            260                 265                 270
Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly
        275                 280                 285
Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His
    290                 295                 300
Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu
305                 310                 315                320
Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val
                325                 330                 335
Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn
            340                 345                 350
Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp
        355                 360                 365
Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr
    370                 375                 380
Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu
385                 390                 395                 400
Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp
                405                 410                 415
Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln
            420                 425                 430
His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu
        435                 440                 445
Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser
    450                 455                 460
Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu
465                 470                 475                 480
Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu
                485                 490                 495
Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro
            500                 505                 510
Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn
        515                 520                 525
Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly
    530                 535                 540
Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro
545                 550                 555                 560
Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro
                565                 570                 575
Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val
            580                 585                 590
Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp
        595                 600                 605
Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys Hi s Leu Cys His Pro Asn Cys
    610                 615                 620
Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly
625                 630                 635                 640
Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu
                645                 650                 655
Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met Arg Arg Arg His
            660                 665                 670
Ile Val Arg Lys Arg Thr Leu Arg Arg Leu Leu Gln Glu Arg Glu Leu
        675                 680                 685
Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly Glu Ala Pro Asn Gln Ala Leu Leu
    690                 695                 700
Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Phe Lys Lys Ile Lys Val Leu Gly Ser
705                 710                 715                 720
Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys Gly Leu Trp Ile Pro Glu Gly Glu
                725                 730                 735
Lys Val Lys Ile Pro Val Ala Ile Lys Glu Leu Arg Glu Ala Thr Ser
            740                 745                 750
Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Ser
        755                 760                 765
Val Asp Asn Pro His Val Cys Arg Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser
    770                 775                 780
Thr Val Gln Leu Ile Thr Gln Leu Met Pro Phe Gly Cys Leu Leu Asp
785                 790                 795                 800
Tyr Val Arg Glu His Lys Asp Asn Ile Gly Ser Gln Tyr Leu Leu Asn
                805                 810                 815
Trp Cys Val Gln Ile Ala Lys Gly Met Asn Tyr Leu Glu Asp Arg Arg
            820                 825                 830
Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Val Lys Thr Pro
        835                 840                 845
Gln His Val Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu Leu Gly Ala
    850                 855                 860
Glu Glu Lys Glu Tyr His Ala Glu Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp
865                 870                 875                 880
Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu His Arg Ile Tyr Thr His Gln Ser Asp
                885                 890                 895
Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ser
            900                 905                 910
Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala Ser Glu Ile Ser Ser Ile Leu Glu
        915                 920                 925
Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr
    930                 935                 940
Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met Ile Asp Ala Asp Ser Arg Pro Lys
945                 950                 955                 960
Phe Arg Glu Leu Ile Ile Glu Phe Ser Lys Met Ala Arg Asp Pro Gln
                965                 970                 975
Arg Tyr Leu Val Ile Gln Gly Asp Glu Arg Met His Leu Pro Ser Pro
            980                 985                 990
Thr Asp Ser Asn Phe Tyr Arg Ala Leu Met Asp Glu Glu Asp Met Asp
        995                 1000                 1005
Asp Val Val Asp Ala Asp Glu Tyr Leu Ile Pro Gln Gln Gly Phe
    1010                1015                1020
Phe Ser Ser Pro Ser Thr Ser Arg Thr Pro Leu Leu Ser Ser Leu
    1025                1030                1035
Ser Ala Thr Ser Asn Asn Ser Thr Val Ala Cys Ile Asp Arg Asn
    1040                1045                1050
Gly Leu Gln Ser Cys Pro Ile Lys Glu Asp Ser Phe Leu Gln Arg
    1055                1060                1065
Tyr Ser Ser Asp Pro Thr Gly Ala Leu Thr Glu Asp Ser Ile Asp
    1070                1075                1080
Asp Thr Phe Leu Pro Val Pro Glu Tyr Ile Asn Gln Ser Val Pro
    1085                1090                1095
Lys Arg Pro Ala Gly Ser Val Gln Asn Pro Val Tyr His Asn Gln
    1100                1105                1110
Pro Leu Asn Pro Ala Pro Ser Arg Asp Pro His Tyr Gln Asp Pro
    1115                1120                1125
His Ser Thr Ala Val Gly Asn Pro Glu Tyr Leu Asn Thr Val Gln
    1130                1135                1140
Pro Thr Cys Val Asn Ser Thr Phe Asp Ser Pro Ala His Trp Ala
    1145                1150                1155
Gln Lys Gly Ser His Gln Ile Ser Leu Asp Asn Pro Asp Tyr Gln
    1160                1165                1170
Gln Asp Phe Phe Pro Lys Glu Ala Lys Pro Asn Gly Ile Phe Lys
    1175                1180                1185
Gly Ser Thr Ala Glu Asn Ala Glu Tyr Leu Arg Val Ala Pro Gln
    1190                1195                1200
Ser Ser Glu Phe Ile Gly Ala
    1205                1210
<210>79
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>79
atgcgaccct ccgggacggc                                                20
<210>80
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>80
cagtggcgat ggacgggatc t                                              21
<210>81
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>81
ttgcggccgc caccatgcga ccctccggga cggc                                34
<210>82
<211>61
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>82
accagatctc caggaaaatg tttaagtcag atggatcgga cgggatctta ggcccattcg    60
t                                                                    61
<210>83
<211>2514
<212>DNA
<213>小鼠
<400>83
atggtagggc tgggagcctg caccctgact ggagttaccc tgatcttctt gctactcccc     60
agaagtctgg agagctgtgg acacatcgag atttcacccc ctgttgtccg cctgggggac    120
cctgtcctgg cctcttgcac catcagccca aactgcagca aactggacca acaggcaaag    180
atcttatgga gactgcaaga tgagcccatc caacctgggg acagacagca tcatctgcct    240
gatgggaccc aagagtccct catcactctg cctcacttga actacaccca ggccttcctc    300
ttctgcttag tgccatggga agacagcgtc caactcctgg atcaagctga gcttcacgca    360
ggctatcccc ctgccagccc ctcaaaccta tcctgcctca tgcacctcac caccaacagc    420
ctggtctgcc agtgggagcc aggtcctgag acccacctgc ccaccagctt catcctaaag    480
agcttcagga gccgcgccga ctgtcagtac caaggggaca ccatcccgga ttgtgtggca    540
aagaagaggc agaacaactg ctccatcccc cgaaaaaact tgctcctgta ccagtatatg    600
gccatctggg tgcaagcaga gaatatgcta gggtccagcg agtccccaaa gctgtgcctc    660
gaccccatgg atgttgtgaa attggagcct cccatgctgc aggccctgga cattggccct    720
gatgtagtct ctcaccagcc tggctgcctg tggctgagct ggaagccatg gaagcccagt    780
gagtacatgg aacaggagtg tgaacttcgc taccagccac agctcaaagg agccaactgg    840
actctggtgt tccacctgcc ttccagcaag gaccagtttg agctctgcgg gctccatcag    900
gccccagtct acaccctaca gatgcgatgc attcgctcat ctctgcctgg attctggagc    960
ccctggagcc ccggcctgca gctgaggcct accatgaagg cccccaccat cagactggac   1020
acgtggtgtc agaagaagca actagatcca gggacagtga gtgtgcagct gttctggaag   1080
ccaacgcccc tgcaggaaga cagtggacag atccagggct acctgctgtc ctggaattcc   1140
ccagatcatc aagggcagga catacacctt tgcaacacca cgcagctcag ctgtatcttc   1200
ctcctgccct cagaggccca gaacgtgacc cttgtggcct acaacaaagc agggacctct   1260
tcacctacta cagtggtttt cctggagaac gaaggtccag ctgtgaccgg actccatgcc   1320
atggcccaag accttaacac catctgggta gactgggaag cccccagcct tctgcctcag   1380
ggctatctca ttgagtggga aatgagttct cccagctaca ataacagcta taagtcctgg   1440
atgatagaac ctaacgggaa catcactgga attctgttaa aggacaacat aaatcccttt   1500
cagctctaca gaattacagt ggctcccctg tacccaggca tcgtgggacc ccctgtaaat    1560
gtctacacct tcgctggaga gagagctcct cctcatgctc cagcgctgca tctaaagcat    1620
gttggcacaa cctgggcaca gctggagtgg gtacctgagg cccctaggct ggggatgata    1680
cccctcaccc actacaccat cttctgggcc gatgctgggg accactcctt ctccgtcacc    1740
ctaaacatct ccctccatga ctttgtcctg aagcacctgg agcccgccag tttgtatcat    1800
gtctacctca tggccaccag tcgagcaggg tccaccaata gtacaggcct taccctgagg    1860
accctagatc catctgactt aaacattttc ctgggcatac tttgcttagt actcttgtcc    1920
actacctgtg tagtgacctg gctctgctgc aaacgcagag gaaagacttc cttctggtca    1980
gatgtgccag acccagccca cagtagcctg agctcctggt tgcccaccat catgacagag    2040
gaaaccttcc agttacccag cttctgggac tccagcgtgc catcaatcac caagatcact    2100
gaactggagg aagacaagaa accgacccac tgggattccg aaagctctgg gaatggtagc    2160
cttccagccc tggttcaggc ctatgtgctc caaggagatc caagagaaat ttccaaccag    2220
tcccagcctc cctctcgcac tggtgaccag gtcctctatg gtcaggtgct tgagagcccc    2280
accagcccag gagtaatgca gtacattcgc tctgactcca ctcagcccct cttggggggc    2340
cccaccccta gccctaaatc ttatgaaaac atctggttcc attcaagacc ccaggagacc    2400
tttgtgcccc aacctccaaa ccaggaagat gactgtgtct ttgggcctcc atttgatttt    2460
cccctctttc aggggctcca ggtccatgga gttgaagaac aagggggttt ctag          2514
<210>84
<211>837
<212>PRT
<213>小鼠
<400>84
Met Val Gly Leu Gly Ala Cys Thr Leu Thr Gly Val Thr Leu Ile Phe
1               5                   10                  15
Leu Leu Leu Pro Arg Ser Leu Glu Ser Cys Gly His Ile Glu Ile Ser
            20                  25                  30
Pro Pro Val Val Arg Leu Gly Asp Pro Val Leu Ala Ser Cys Thr Ile
        35                  40                  45
Ser Pro Asn Cys Ser Lys Leu Asp Gln Gln Ala Lys Ile Leu Trp Arg
    50                  55                  60
Leu Gln Asp Glu Pro Ile Gln Pro Gly Asp Arg Gln His His Leu Pro
65                  70                  75                  80
Asp Gly Thr Gln Glu Ser Leu Ile Thr Leu Pro His Leu Asn Tyr Thr
                85                  90                  95
Gln Ala Phe Leu Phe Cys Leu Val Pro Trp Glu Asp Ser Val Gln Leu
            100                 105                 110
Leu Asp Gln Ala Glu Leu His Ala Gly Tyr Pro Pro Ala Ser Pro Ser
        115                 120                 125
Asn Leu Ser Cys Leu Met His Leu Thr Thr Asn Ser Leu Val Cys Gln
    130                 135                 140
Trp Glu Pro Gly Pro Glu Thr His Leu Pro Thr Ser Phe Ile Leu Lys
145                 150                 155                 160
Ser Phe Arg Ser Arg Ala Asp Cys Gln Tyr Gln Gly Asp Thr Ile Pro
                165                 170                 175
Asp Cys Val Ala Lys Lys Arg Gln Asn Asn Cys Ser Ile Pro Arg Lys
            180                 185                 190
Asn Leu Leu Leu Tyr Gln Tyr Met Ala Ile Trp Val Gln Ala Glu Asn
        195                 200                 205
Met Leu Gly Ser Ser Glu Ser Pro Lys Leu Cys Leu Asp Pro Met Asp
    210                 215                 220
Val Val Lys Leu Glu Pro Pro Met Leu Gln Ala Leu Asp Ile Gly Pro
225                 230                 235                 240
Asp Val Val Ser His Gln Pro Gly Cys Leu Trp Leu Ser Trp Lys Pro
                245                 250                 255
Trp Lys Pro Ser Glu Tyr Met Glu Gln Glu Cys Glu Leu Arg Tyr Gln
            260                 265                 270
Pro Gln Leu Lys Gly Ala Asn Trp Thr Leu Val Phe His Leu Pro Ser
        275                 280                 285
Ser Lys Asp Gln Phe Glu Leu Cys Gly Leu His Gln Ala Pro Val Tyr
    290                 295                 300
Thr Leu Gln Met Arg Cys Ile Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe Trp Ser
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Met Arg Pro Ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala
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Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln
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Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe
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Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn
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Leu Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys
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Thr Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr Val
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Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro Met Arg Asn Leu Gln Glu Ile Leu
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His Gly Ala Val Arg Phe Ser Asn Asn Pro Ala Leu Cys Asn Val Glu
145                 150                 155                 160
Ser Ile Gln Trp Arg Asp Ile Val Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn Met
                165                 170                 175
Ser Met Asp Phe Gln Asn His Leu Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp Pro
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Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gln
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Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys His Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys
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Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His
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Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu
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Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val
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Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn
            340                 345                 350
Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp
        355                 360                 365
Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr
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Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu
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Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp
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Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln
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His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu
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Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu
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acagagctaa actacaagaa cactgaacca gtcctggact ctgatggttc ttacttcatg   1020
tacagcaagc tgagagtgga aaagaagaac tgggtggaaa gaaatagcta ctcctgttca   1080
gtggtccacg agggtctgca caatcaccac acgactaaga gcttctcccg gactccgggt   1140
aaatga                                                              1146
<210>93
<211>381
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>嵌合多肽
<400>93
Met Lys Leu Leu Pro Ser Val Val Leu Lys Leu Phe Leu Ala Ala Val
1               5                   10                  15
Leu Ser Ala Leu Val Thr Gly Glu Ser Leu Glu Arg Leu Arg Arg Gly
            20                  25                  30
Leu Ala Ala Gly Thr Ser Asn Pro Asp Pro Pro Thr Val Ser Thr Asp
        35                  40                  45
Gln Leu Leu Pro Leu Gly Gly Gly Arg Asp Arg Lys Val Arg Asp Leu
    50                  55                  60
Gln Glu Ala Asp Leu Asp Leu Leu Arg Val Thr Leu Ser Ser Lys Pro
65                  70                  75                  80
Gln Ala Leu Ala Thr Pro Asn Lys Glu Glu His Gly Lys Arg Lys Lys
                85                  90                  95
Lys Gly Lys Gly Leu Gly Lys Lys Arg Asp Pro Cys Leu Arg Lys Tyr
            100                 105                 110
Lys Asp Phe Cys Ile His Gly Glu Cys Lys Tyr Val Lys Glu Leu Arg
        115                 120                 125
Ala Pro Ser Cys Ile Cys His Pro Gly Tyr His Gly Glu Arg Cys His
    130                 135                 140
Gly Leu Ser Leu Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro
145                 150                 155                 160
Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile
                165                 170                 175
Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile
            180                 185                 190
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln
        195                 200                 205
Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln
    210                 215                 220
Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu
225                 230                 235                 240
Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys
                245                 250                 255
Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys
            260                 265                 270
Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro
        275                 280                 285
Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr
    290                 295                 300
Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys
305                 310                 315                 320
Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
                325                 330                 335
Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val
            340                 345                 350
Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn
        355                 360                 365
His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
    370                 375                 380