一种具有增强免疫力功能的营养食品及其制备方法.pdf

本发明涉及一种具有增强免疫力功能的营养食品及其制备方法，属于功能性食品领域。本营养食品，主要由如下重量份的药食两用原料制成：刺拐棒1-5份、茯苓2-8份、枸杞子2-8份、香菇3-9份、大枣3-9份、银耳3-9份、苏叶3-9份、蜂王浆0.5-3份。经过动物实验表明，本发明营养食品具有明显的增强免疫力功能，适用于需要增强免疫力者，但不适用于少年儿童。

1、  一种具有增强免疫力功能的营养食品，主要由如下重量份的药食两用原料制成：刺拐棒1-5份、茯苓2-8份、枸杞子2-8份、香菇3-9份、大枣3-9份。

2、  根据权利要求1所述的营养食品，其优选的药食两用原料的重量份为：刺拐棒1份、茯苓2份、枸杞子2份、香菇3份、大枣3份。

3、  根据权利要求1所述的营养食品，其中还含有药食两用原料：银耳、苏叶、蜂王浆。

4、  根据权利要求3所述的营养食品，其银耳、苏叶、蜂王浆的重量份为：银耳3-9份、苏叶3-9份、蜂王浆0.5-3份。

5、  根据权利要求4所述的营养食品，其优选的药食两用原料的重量份为：银耳3份、苏叶3份、蜂王浆0.5份。

6、  根据权利要求1-5任一所述的营养食品，其剂型为软胶囊剂。

7、  根据权利要求6所述的营养食品的制备方法，包括如下步骤：
1)按比例称取刺拐棒、茯苓药食两用原料，用70％乙醇提取两次，合并提取液真空浓缩得干浸膏1；
2)按比例称取枸杞子、香菇、大枣药食两用原料，用蒸馏水提取1次，将提取液真空浓缩得干浸膏2；
3)按比例称取银耳、苏叶药食两用原料，用蒸馏水提取1次，将提取液真空浓缩得干浸膏3；
4)合并干浸膏1、干浸膏2、和干浸膏3，将其粉碎成200目粉，并按比例称取蜂王浆，按常规方法制成软胶囊。每个软胶囊含活性成分720mg。

8、  根据权利要求7所述营养食品的制备方法，浓缩后得到的干浸膏，在粉碎前还需在50-60℃下干燥3小时。

9、  所述营养食品的组方中所用的刺拐棒，是指五加科植物短梗五加的嫩茎，地方菜名，是该植物产区的习惯名称。

10、  本发明所制得的干浸膏活性组分可以加入制备不同剂型时所需的各种常规辅料，如崩解剂、润滑剂、粘合剂等，以常规的中药制剂方法制备成任何一种常用口服剂型，如丸剂、冲剂、片剂、胶囊剂、口服液等。

一种具有增强免疫力功能的营养食品及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种具有增强免疫力功能的营养食品及其制备方法，属于功能性食品领域。
背景技术
人体生来就具有对各种抗原物质的生理性反应，这种免疫功能人人皆有，无特异性，并可遗传给后代，称为非特异性免疫，在抗感染过程中起着第一道防线的作用。但在各种抗原刺激机体后，产生特异性免疫物质引起的免疫反应，如细胞免疫和体液免疫，称为特异性免疫。
在生物进化过程中，免疫系统出现于脊椎动物并趋于完善。免疫系统对维持机体正常生理功能具有重要作用。早在16世纪，人们就注意到传染病患者痊愈后，对该病就有不同的免疫力。因此认为免疫是指传染因子的再次感染获得抵抗力，即机体在初次感染后对传染因子产生了免疫应答的结果。换言之，经典的免疫仅指机体抗感染的防御功能，而且认为免疫对机体都是有利的。随着研究的不断深入，这种的概念逐渐动摇了。20世纪初，已经提示了一些与抗感染无关的且对机体有害的免疫现象，如注射异种动物的血清引起的血清病、血型不符的输血引起的输血反应、有些物质引起的过敏反应等。综合各种免疫现象，免疫(immunity)是指机体接触“抗原性异物”或“异已成分”的一种特异性生理反应，它是机体在进化过程中获得的“识别自身、排斥异己”的一种重要生理功能。
在正常情况下，免疫反应通常对机体是有利的。免疫功能低下，会对机体健康产生极为不利的影响，使多种传染病、非传染病的发病率和死亡率提高，其中引人注目的有肿瘤等。造成机体免疫力下降的原因有多种，诸如营养失衡、精神或心理因素、年龄增大、慢性疾病、应激、内分泌失调和遗传因素等。
在整个免疫过程中，抗原抗体反应具有特异性，这种特异性可以精细到能区分两种近似物质之间的微细差异，而这种差异常常是用其他方法所难以区别的。这种特异性的物质基础就是抗原决定簇。它是抗原性物质表面特殊的化学基团，通常由5~7个氨基酸、单糖或核苷酸残基组成。抗原以此与相应淋巴细胞的高原受体结合而激活淋巴细胞引起免疫应答。换言之，淋巴细胞表面的抗原识别受体通过识别抗原决定簇而区分“自身”与“异已”。1968年和1972年世界卫生组织和国际免疫学会联合会所属专门委员会先后决定，将具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白统称为免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)。因此，抗体可以理解为能与相应抗原特异性结合的、具有免疫功能的球蛋白，即抗体和免疫球蛋白可以作为同义词互用。
如上所述，具有增强免疫力的功能性食品，能够增强机体对各种疾病的防御力、抵抗力，维持自身的生理平衡。目前市场上出售的常用的增强免疫力的中西药物都有不同程度的副作用。因此研究开发安全的、确实具有增强免疫力功能的营养食品，可造福于上亿的需要增强免疫力功能营养食品的消费者。
发明内容
本发明针对上述领域中的缺陷，提供一种更为有效的具有增强免疫力功能的营养食品，完全符合药食同源的理念标准，是一种绿色营养食品。
本发明另外一个目的是提供了一种具有增强免疫力功能营养食品的制备方法。
1、一种具有增强免疫力功能的营养食品，主要由如下重量份的药食两用原料制成：剌拐棒1-5份、茯苓2-8份、枸杞子2-8份、香菇3-9份、大枣3-9份。
2、所述的营养食品，其优选的药食两用原料的重量份为：刺拐棒1份、茯苓2份、枸杞子2份、香菇3份、大枣3份。
3、所述的营养食品，其活性成分中还含有药食两用原料：银耳、苏叶、蜂王浆。
4、所述的营养食品，所述银耳、苏叶、蜂王浆的重量份为：银耳3-9份、苏叶3-9份、蜂王浆0.5-3份。
5、所述的营养食品，所述银耳、苏叶、蜂王浆优选的药食两用原料的重量份为：银耳3份、苏叶3份、蜂王浆0.5份。
6、所述的营养食品，其剂型为软胶囊剂。
7、所述的营养食品的制备方法，包括如下步骤：
1)按比例称取刺拐棒、茯苓药食两用原料，用70％乙醇提取两次，合并提取液真空浓缩得干浸膏1；
2)按比例称取枸杞子、香菇、大枣药食两用原料，用蒸馏水提取1次，将提取液真空浓缩得干浸膏2；
3)按比例称取银耳、苏叶药食两用原料，用蒸馏水提取1次，将提取液真空浓缩得干浸膏3；
4)合并干浸膏1、干浸膏2、和干浸膏3，将其粉碎成200目粉，并按比例称取蜂王浆，按常规方法制成软胶囊。每个软胶囊含活性成分720mg。
8、所述营养食品的制备方法，浓缩后得到的干浸膏，在粉碎前还需在50-60℃下干燥3小时。
9、本组方中所用的刺拐棒，是指五加科植物短梗五加的嫩茎的地方菜名，是该植物产区的习惯名称。
本发明所制得的干浸膏活性组分可以加入制备不同剂型时所需的各种常规辅料，如崩解剂、润滑剂、粘合剂等，以常规的中药制剂方法制备成任何一种常用口服剂型，如丸剂、冲剂、片剂、胶囊剂、口服液等。
本发明人经过反复研究，终于找到了上述有更好效果的增强免疫力营养食品。经过动物实验表明，本发明营养食品具有明显的增强免疫力功能，本品完全符合药食同源理论，是真正的“绿色食品”。
本发明公开的增强免疫力功能的营养食品，其主要是由刺拐棒、茯苓、枸杞子、香菇、大枣、银耳、苏叶、蜂王浆等按一定重量配比制备而成。
刺拐棒，刺拐棒植物，详见《中国植物志》第五十四卷，第115页。为五加科落叶灌木短梗五加的嫩茎和嫩叶，刺拐棒与刺五加同科同属。刺拐棒枝叶茂盛，花果奇异，除是一种观赏树外，还是一种保健野生蔬菜及重要的药用植物。刺拐棒叶制成的茶，含微量生物硷、强心工甙及0.2％挥发油和烟酸，含0.23％强心甙、0.1％挥发油及少量皂甙。刺拐棒药理作用是多样性的，具有滋肝补肾、强壮身体，调整血压、神经等作用。
茯苓(Poria)为多孔菌科植物茯苓[Poria cocos(Schw.)Wolf]的干燥菌核，主产于安徽、湖北、河南和云南等地。祖国医学认为茯苓具有利水渗湿、健脾和胃、宁心安神等功能。用茯苓制作的营养食品，古代文献记载有茯苓膏、茯苓酥、茯苓粥等；目前市场出售的有茯苓夹饼、茯芩糕、茯苓酥糖、茯苓软糖、茯苓酒等。茯苓含β-茯苓聚糖、茯苓次聚糖及三萜类化合物茯苓酸、乙酰茯苓酸、去氢茯苓酸、茯苓新酸、松苓酸、齿孔酸、三萜羟权等。也含有脂肪酸，如辛酸、十一酸、月桂酸、十二酸和棕榈酸。此外，茯苓还含有麦角甾醇、甲壳质、蛋白质、脂肪、甾醇、卵磷脂、腺嘌呤组氨酸、胆碱及无机成分Ca、Mg、P、Fe、Na、K、Kn等。茯苓的主要有效成分为茯苓多糖，具有增强机体免疫力、抗肿瘤、延缓衰老、抑菌等作用。
枸杞子为茄科植物宁夏枸杞Lycium barbarum L.的果实。无臭，味甜，微酸。甘，平。归肝、肾经。功能滋补肝肾，益精明目。用于虚劳精亏，腰膝酸痛，眩晕耳鸣，内热消渴，血虚萎黄，目昏不明。陶弘景：“补益精气，强盛阴道。”《药性论》：“能补益精诸不足，易颜色，变白，明目，安神。”《食疗本草》：“坚筋耐老，除风，补益筋骨，能益入，去虚劳。”王好古：“主心病嗌干，心痛，渴而引饮，肾病消中。”《纲目》：“滋肾，润肺，明目。”《本草述》：“疗肝风血虚，眼赤痛痒昏翳。“治中风眩晕，虚劳，诸见血证，咳嗽血，痿、厥、挛，消瘴，伤燥，遗精，赤白浊，脚气，鹤膝风。”
香菇(Lentinus edodes)又名冬菇，属担子菌纲、伞菌目、侧耳科、香菇属，其产量占世界食用茹类总产量的15％以上，仅次于双孢菇，是栽培的第二大类食用菌。香菇香气浓郁、味道鲜美、营养丰富，具有高蛋白、低脂肪、低热量、多种维生素、氨基酸并存的特点，有健脾益气、扶正祛邪、疏风散淤、调和阴阳的功效，是食、药用菌中的佳品。现代医学研究发现，经常食用香菇有增强人体免疫功能和防治癌症等作用。香菇多糖为其中的主要生理活性物质，具有显著增强癌症患者的抵抗力等多种生物学功能。已明确有免疫活性的香菇多糖只有β-葡聚糖一类。其一级结构具有由β(1→3)键连接的吡喃葡聚糖主链。在主链上的葡萄糖通过6-C分支与侧链相连接，一般每5个葡萄糖就有2个支点。侧链是由β(1→6)和β(1→3)键连接的葡萄糖低聚合物。水溶性β-葡聚糖为线状结构，无大分支。以β(1→3)键为主结构的葡萄糖，其生理活性高于以β(1→6)为主的多糖，而β(1→3)和β(1→6)结合的侧链共存是抗肿瘤作用所需要的。
大枣为鼠李科植物酸枣Zizipgus jujube Mill.的成熟果实，亦名红枣(《医学入门》)、干枣(《名医别录》)。味甘，性温。归脾、胃经。功能：补脾和胃、益气生津、调营卫、解药毒。主治：胃虚食少、脾弱便溏、气血津液不足、营卫不和、心悸怔忡、妇人脏躁。主要成分大枣含有机酸、三萜苷类、生物碱类、黄酮类、糖类、维生素类以及谷甾醇、豆甾醇、链甾醇，亦含有cAMP和cGMP。有机酸类有：桦木酸、齐墩果酸、山楂酸、苹果酸、酒石酸、儿茶酸、油酸等。三萜苷类有：山楂酸-3-O-顺式-对-香豆酰酯。黄酮类有、6，8-二葡萄糖基-2(R)-柑橘素、芦丁等。大枣中所含糖类主要是葡萄糖，亦含果糖、蔗糖、由葡萄糖和果糖组成的低聚糖、阿拉伯聚糖及半乳醛聚糖等。另外，还发现大枣中存在一种酸性多糖，命名为大枣果胶A。大枣中尚含有维生素C、核黄素、硫胺素、胡萝卜素、尼克酸等多种维生素。此外，大枣中尚含树脂、黏液质、香豆素类衍生物、儿茶酚、鞣质、挥发油、13种氨基酸及钙、磷、铁、硒等36种微量元素。大枣的主要功能集中在增强免疫力方面，对于此方面的作用，有很多文献报道。
银耳(Tremella fuciformis Berk.)又称白木耳，隶属于担子菌亚门层菌纲、有隔担子菌亚纲、银耳目(Tremellales)、银耳科、银耳属。银耳是我国一种著名的药食两用菌。我国历代医药学家都认为，银耳具有“补肾、润肺、生津、止咳”之功效。据张仁安《本草诗解药性注》云，“此物有麦冬之润而无其寒，有玉竹之甘而无其腻，诚润肺滋阴要品”。银耳含蛋白质6.7％～10％，碳水化合物65％～71.2％，脂肪0.6％～12.8％，粗纤维2.4％～2.75％，无机盐4.0％～5.4％，水分15.2％～18.7％及少量维生素B类。银耳蛋白质中含有18种氨基酸，即亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、酪氨酸、脯氨酸、精氨酸、赖氨酸、丙氨酸、苏氨酸、甘氨酸、丝氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、胱氨酸、组氨酸、甲硫氨基酸和丁氨酸。银耳多糖是从银耳中提取的主要生理活性物质，具有增强免疫力功能。实验证明，小鼠用SRBC免疫后每日腹腔注射银耳多糖50mg/kg，连续3d，末次处理后24min眼内膜取血，分离血清，测定动物溶血抗体水平。结果显示，银耳多糖能明显增加小鼠血清溶血抗体的含量，能拮抗环磷酰胺所致的体液免疫抑制，并可促进其恢复正常。对环磷酰胺、5-氟尼嘧啶(5-FU)等免疫抑制剂所致的细胞免疫抑制都有明显的拮抗作用，也能使其恢复正常或高于正常。
苏叶又名紫苏，本品为唇形科植物苏子的干燥叶(或带嫩枝)。夏季枝叶茂盛时采收，除去杂质，晒干供药用。苏叶，因其叶正反两面呈紫色，故又名紫苏。又因芳香异常，故又有复苏别称。《本划汇言》言“紫苏散寒气，清肺气，宽中气，安胎气，下结气，化痰气，乃治气之神药也。”《本划纲目》中有“紫苏嫩时采叶，和蔬配之，或盐及梅卤作范食甚香，夏月作熟汤饮之”。性味功效辛，温。归肺、脾经。解表散寒，行气和胃。发表散寒，行气宽中，解鱼蟹毒。化学成分紫苏全草含挥发油约0.5％，挥发油内含紫苏醛、L-柠檬烯、α-蒎烯等。还含精氨酸、矢车菊素，叶的挥发油中含异白苏烯酮等。紫苏中尚含铜、铬、锌、镍、铁等11种无机元素。本品有抗菌、解热、止血等作用，用于风寒感冒，咳嗽呕恶，妊娠呕吐，鱼蟹中毒等。
蜂王浆的营养价值高于蜂蜜。蜂王浆中含水分高达2/3，其余是蛋白质、氨基酸、无机盐和B族维生素，蜂王浆中还含有少量的核苷酸、激素、酶等生物活性物质。由于蜂王浆口味欠佳，带有辛辣涩味，一般常与10倍的蜂蜜混合后食用；主要成分是10-羟基-2-癸烯酸(亦称王浆酸，简称10-HAD，约含2％，C₁₀H₁₈O3，186.25)，另含水分62.5％～68.5％，蛋白质11.0％～14.5％，有多种维生素、腺苷(UDP-葡糖、UDP-葡糖酸、UD-Px)、尿苷、鸟苷、胞苷，有酸性及碱性磷酸酯酶、胆碱酯酶等酶类。乳白至淡黄色浆状物质，有酸涩辛辣味，略甜，有耐热，易溶于水。蜂王浆冻干粉对小鼠免疫功能的影响。设对照及低、中、高3个剂量组，经口给予蜂王浆冻干粉30d后作小鼠碳廓清试验和NK细胞活性测定。结果表明中剂量组小鼠的碳廓清速率较对照组增加32％，中、高剂量组的吞噬指数较对照组显著提高(P＜0.05)，中剂量组的NK细胞活性高于对照组(P＜0.05)。
现代中医认为：增强免疫力的用药，特别是使用中药、中药营养食品亦应从加强心、肝、脾、肺、肾的功能方面着手，保持在特殊情况下人体脏腑经络的气血、阴阳平衡，不要失调，人体这些脏腑的机能提高了，免疫力自然就增强了。
现代中医还认为：能促进血液中白细胞数量增加的药食两用原料药有：枸杞子、大枣、蜂王浆等；能促进单核巨噬细胞系统功能增强的药食两用原料药有：香菇、茯苓等；能促进T细胞数量增加、淋巴母细胞转化的药食两用原料药有：枸杞子、等；能对干扰素有诱生作用的药食两用原料药有：苏叶等；能促进抗体产生的药食两用原料药有：银耳等；能参与肿瘤免疫反应的药食两用原料药有：刺拐棒、大枣、茯苓等。
所以，我们采用刺拐棒等药理作用多样性的高级滋补药材作为君药，来滋补元气、滋肝补肾、益肺阴、清虚火、生津止渴、调整阴阳气血，强壮身体，调整血压、神经等。我们又采用枸杞子、香菇、茯苓、银耳等药理作用多样性的药食两用药材为臣药，进行辅助补益肝、肾、肺、脾，滋补肝肾，益精明目；健脾、补肺、固肾、益精。我们再采用大枣、苏叶、蜂王浆等众所周知的增强免疫力功能药食两用原料为佐使，更好的加强了本发明营养食品的增强免疫力功能。
本发明所用药物均采用乙醇和水溶液进行提取，回流的温度低于100℃，使药物中的有效成分不易因高温而发生变化，同时在浓缩时采用真空浓缩，使提取液中的有效成分不受高温影响，避免了某些对热不稳定的有效成分的破坏和损失，更好地保存了原料的营养成分和香气。浓缩后得到的干浸膏需在50-60℃下干燥3小时，才能彻底干燥。
经过动物和人体实验表明，本发明营养食品具有明显的增强免疫力功能，同时还能增强免疫力，用于需要增强免疫力者和免疫力低下者。
本具有增强免疫力功能的药食两用营养食品配方及其产品生产技术，是通过试验例来表明本发明营养食品效果的，试验包括功能学试验和安全性毒理学试验。具体详见下面的实施例和实验例。
具体实施方式以下通过实施例和实验例来进一步阐述本发明所述功能性营养食品的有效效果。
实施例1
原料配料：
刺拐棒1000g，茯苓2000g，枸杞子2000g，香菇3000g，大枣3000g，银耳3000g、苏叶3000g、蜂王浆500g
其制备方法：根据权利要求书和本说明书所述的本营养食品制备方法，进行制备。
实施例2
原料配料：
刺拐棒2000g，茯苓4000g，枸杞子4000g，香菇6000g，大枣6000g，银耳6000g、苏叶6000g、蜂王浆1000g
其制备方法：根据权利要求书和本说明书所述的本营养食品制备方法，进行制备。
实施例3
原料配料：
刺拐棒3000g，茯苓6000g，枸杞子6000g，香菇9000g，大枣9000g，银耳9000g、苏叶9000g、蜂王浆1500g
其制备方法：根据权利要求书和本说明书所述的本营养食品制备方法，进行制备。
本发明营养食品具有增强免疫力功能的动物实验
实验例1、
1.实验项目：
本营养食品对动物脏器/体重比重的影响(X±SD)，脾脏/体重比值/(mg/g)，胸腺/体重比值/(mg/g)；
本营养食品对小鼠细胞免疫功能各项指标的影响(X±SD)迟发型变态反应/mm，淋巴细胞增殖能力OD差值；
本营养食品对小鼠体液免疫功能各项指标的影响(X±SD)溶血空斑数/(×10³/全脾)，半数溶血值；
本营养食品对小鼠体液免疫功能各项指标的影响(X±SD)碳廓清能力吞噬指数a，鸡红细胞吞噬率/％，鸡红细胞吞噬指数；
本营养食品对小鼠NK细胞活性的影响(X±SD)，NK细胞活性/％。
2.试验原则所列指标均为已做项目。
3.实验方法
(1)实验本营养食品对动物脏器/体重比重的影响(X±SD)，脾脏/体重比值/(mg/g)，胸腺/体重比值/(mg/g)；
原理胸腺、脾脏等免疫器官随着年龄的增长会逐渐退化或萎缩，表现为免疫器官体积缩小、质量减轻、脏器指数下降。许多免疫抑制剂可造成人类或动物免疫脏器的质量减轻与功能低下，而免疫刺激剂可使低下的免疫功能与免疫脏器质量恢复至正常水平。
实验步骤
①实验动物选购武汉市医学动物实验中心的近交系成年雄性小鼠，单一性别300只，体重100～120g，动物合格证号：鄂医试07014.使用许可证号：EYS0809。每个剂量组12只；
②剂量分组及受试物给予时间实验设3个剂量组和1个空白对照组，受试物以成人推荐量每日口服720mg/d，按成人60kg体重计，即12mg/(kg体重)的5倍为其中的1个低剂量组，10倍为其中的1个中剂量组，15倍为其中的1个高剂量组，受试物(实施例1制备的营养食品)给予时间30天。
③测定指标最后1次给受试物后的第2天，摘除眼球放血处死动物，摘取胸腺和脾脏，用扭力天平称重。

比较两组间的差异。动物实验结果见表1、
表1本营养食品对动物脏器/体重比重的影响(X±SD)

(2)实验本营养食品对小鼠细胞免疫功能各项指标的影响(X±SD)迟发型变态反应/mm，淋巴细胞增殖能力OD差值；
实验动物、剂量分组及受试物和给予时间均同实验方法(1)。
①迟发型变态反应(DTH)实验采用二硝基氟苯诱导小鼠DTH(耳肿胀法)原理二硝基氟苯(DNFB)是一种半抗原，将其稀释液涂抹腹壁皮肤后，可与皮肤蛋白结合成完全抗，由此刺激T淋巴细胞增殖成致敏淋巴细胞。4～7d后再将其涂抹于耳部进行抗原攻击，使局部产生心悸型变态反应，而出现肿胀。一般在抗原攻击后24～48h达高峰，测定其肿胀程度可以反映迟发型变态反应程度。
材料二硝基氟苯(DNFB)、丙酮、麻油、硫化钡、打孔器。
试剂配制DNFB溶液：DNFB溶液应新鲜配制，称取DNFB 50mg，置清洁干燥小瓶中，将预先配好的5mL丙酮麻油溶液(丙酮∶麻油＝1∶1)倒入小瓶，盖好瓶塞并用胶布密封。混匀后，用250mL注射器通过瓶盖取用。
试验步骤
①致敏：每只小鼠腹部皮肤用硫化钡脱毛，范围约3cm×3cm，用DNFB溶液50uL均匀涂抹致敏。
②DTH的产生与测定：5d后，用DNFB溶液10uL均匀涂抹于小鼠右耳(两面)进行攻击。攻击后24h颈椎脱臼处死小鼠，剪下左右耳壳。用打孔器取下直径8mm的耳片，称重，以左、右耳质量之差为肿胀度，计算肿胀率

数据处理与结果判定采用言状分析进行数据统计。用左右耳质量之差表示DTH的程度。受试物组的质量差值显著高于对照组的质量差值，可确定本项实验结果阳性。
②淋巴细胞增殖能力OD差值实验采用MTT法原理  当T淋巴细胞受ConA、PHA等致分裂原或特异性抗原刺激后发生母细胞转化，活细胞特别是增殖细胞中的线粒体水解酶可将MTT(四甲基偶氮唑蓝)分解为蓝紫色结晶，其光密度值能反映细胞的增殖细胞中的线粒体水解酶可将MTT(四甲基偶氮唑蓝)分解为蓝紫色结晶，其光密度值能反映细胞的增殖情况。
仪器和材料RPMI-1640细胞培养液，小牛血清，2-巯基乙醇(2-ME)，青霉素，链霉素，刀豆蛋白A(ConA)，盐酸，异丙醇，四甲基偶氮唑蓝(MTT)，Hank’s液，PRS缓冲液(pH7.2～7.4)，纱布或200目筛网，24孔培养板，96孔培养板(平板)，手术器械，二氧化碳培养箱，酶标仪，721分光光度计，超净工作台，高压灭菌器，无菌过滤器。
试剂配制①完全培养液：将RPMI-1640培养液过滤除菌，在使用之前加入10％小牛血清、1％谷氨酰胺(200mmol/L)、青霉素(100U/mL)、链霉素(100ug/L)及5×10^-5mol/L的2-巯基乙醇，用无菌的1mol/L的HCL或1mol/L的NaOH调pH值至7.0～7.2，即为完全培养液。②ConA液：用双蒸水配制成100ug/mL的溶液，过滤除菌，在低温冰箱(-20℃)中保存。③无菌Hank’s液：用前以3.5％的无菌NaHCO₃调pH7.2～7.4。④MTT液：将5mgMTT溶于1mL pH7.2的PBS中，现配现用。⑤酸性异丙醇溶液：96mL异丙醇中加入4mL 1mol/L的HCI，临用前配制。
实验步骤
脾细胞悬液制备：无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank’s液的平皿中，用镊子轻轻将脾脏撕碎，制成单个细胞悬液。经200目筛网过滤，用Hank’s液洗3次，每次1000r/min离心10min。然后将细胞悬浮于1mL完全培养液中，用台酚蓝染色计数活细胞数(应在95％以上)，调整细胞浓度为2×10⁶个/mL。
淋巴细胞增殖反应：将脾细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1mL，一孔加75uL ConA液(相当于7.5ug/mL)，另一孔作为对照，置5％CO₂37℃培养72h。培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液0.7mL，加入0.7mL不含小牛血清的RPMI-1640培养液，同时加入MTT(5mg/mL)50uL/孔，继续4h。培养结束后，每孔加入1mL酸性异丙醇，并吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板中，每个孔作3～6个平行孔，用酶联免疫检测仪，以570nm波长测定光密度值。也可将溶解液直接移入2mL比色杯中，在721型分光光度计上比色测定OD值，波长570nm。
数据处理及结果判定采用方差分析进行数据统计。用加ConA孔的光密度值代表淋巴细胞的增殖能力，受试物的光密度值显著高于对照组的光密度值，可确定本项试验结果阳性。
动物实验结果见表2、
表2本营养食品对小鼠细胞免疫功能各项指标的影响(X±SD)

*与空白对照组相比有显著性差异(P＜0.05)。
(3)实验本营养食品对小鼠体液免疫功能各项指标的影响(X±SD)溶血空斑数/(×10³/全脾)，半数溶血值；
实验动物、剂量分组及受试物和给予时间均同实验方法(1)。
体液免疫功能测定原理
①溶血空斑数/(×10³/全脾)测定原理：经过绵羊红细胞(SRBC)免疫的小鼠脾细胞悬液与一定量的SRBC混合，在补体参与下，使分泌抗体的脾细胞周围的SRBC溶解，形成肉眼可见的空斑数大体可反映抗体生成细胞数。
仪器和材料二氧化碳培养箱、恒温水浴、离心机、手术器械、玻片架、200目筛网、SRBC、补体(豚鼠血清)、Hank’s液、RPMI-1640培养液、SA缓冲液、琼脂糖。
试验步骤：
SRBC制备绵羊颈静脉取血，将羊血放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中，朝一个方向摇动，以脱去纤维蛋白，放入4℃冰箱保存备用，可保存2周；
制备补体采集豚鼠血，分离出血清(至少5只豚鼠的混合血清)，将1mL压积SRBC加入到5mL豚鼠血清中，4℃冰箱放置30min，经常振荡，离心取上清，分装，-70℃保存。用时以SA缓冲液按1∶10稀释；
玻片涂膜在清洁玻片上刷上一薄层琼脂糖(0.5琼脂糖加双蒸水至100mL，加热溶解)，干后可长期保存备用；
免疫动物取脱纤维的羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心(2000r/min)10min，计数细胞，每只鼠经腹腔或静脉注射SRBC 5×10⁷～2×10⁸个。也可将压积SRBC用生理盐水配成2％(体积分数)的细胞悬液，每只鼠腹腔注射0.2mL；脾细胞悬液制备将SRBC免疫4～5d后的小鼠颈椎脱臼处死，取出脾脏，放在盛有Hank’s液的小平皿内，轻轻磨碎脾脏，制成细胞悬液，经200目筛网过滤，离心(1000r/min)10min。用Hank’s液洗涤2遍，最后将细胞悬浮在5mL RPMI-1640培养液中，进行细胞计数，并将细胞浓度调整为5×10⁶个/mL；
空斑的测定将表层培养基1g琼脂糖加双蒸水至100mL加热溶解后，放45～50℃水浴保温，与等量pH7.2～7.4的2倍浓度的Hank’s液混合，分装于小试管，每管0.5mL，再向管内加50uL 10％SRBC(体积分数，用SA缓冲液配制)和20uL脾细胞悬液(5×10⁶个/mL)，迅速混匀，倾倒于刷琼脂糖薄层的玻片上，等琼脂凝固后，将玻片水平扣放在片架上，放入二氧化碳培养箱中孵育1～1.5h，然后用SA缓冲液稀释的补体(1∶8)加入到玻片架凹槽内，继续温育1～1.5h后，计数溶血空斑数。
数据处理及结果判定采用方差分析进行数据统计，用空斑数/10⁶脾细胞或空斑数/全脾细胞来表示。受试物的空斑数显著高于对照组的空斑数，可确定本实验结果阳性。
②半数溶血值(HC₅₀)的测定原理用SRBC免疫动物后，血清中可产生抗SRBC抗体(溶血素)，在补体参与下，与SRBC一起孵育，可发生溶血反应，释放血红蛋白。通过测定血红蛋白含量，即可反映动物血清中溶血素的含量。
仪器和材料721分光光度计、恒温水浴、离心机、SRBC、补体(豚鼠血清)、SA缓冲液、都氏试剂(碳酸氢钠1.0g、高铁氰化钾0.2g、氰化钾0.05g，加蒸馏水至1000mL)。
试验步骤
SRBC制备：同“抗体生成细胞检测”。
制备补体：同“抗体生成细胞检测”。
溶血反应：取血清用SA缓冲液稀释(一般为200～500倍)。将稀释后的血清1mL置试管内，依次加入10％(体积分数)SRBC 0.5mL、补体1mL(用SA液按1∶10稀释)。另设不加血清的对照管(以SA缓冲液代替)。置37℃恒温水浴中保温15～30min后，于冰浴终止反应。2000r/min离心10min。取上清液1mL，加都氏试剂3mL，同时取10％(体积分数)SRBC 0.25mL加都氏试剂至4mL与另一支试管内，充分混匀，放置10min后，于540nm处以对照管作空白，分别测定各管光密度值。
数据处理及结果判定采用方差分析进行数据统计。溶血素的量以半数溶血值(HC₅₀)表示，按下列公式计算，受试物组的HC₅₀显著高于对照组的HC₅₀，可确定本试验结果阳性。

动物实验结果见表3、
表3本营养食品对小鼠体液免疫功能各项指标的影响(X±SD)

*与空白对照组相比有显著性差异(P＜0.05)。
(4)实验本营养食品对小鼠体液免疫功能各项指标的影响(X±SD)碳廓清能力吞噬指数a，鸡红细胞吞噬率/％，鸡红细胞吞噬指数；
实验动物、剂量分组及受试物和给予时间均同实验方法(1)。
①小鼠碳粒廓清试验原理在一定范围内，碳颗粒的清除速率与其剂量呈指数函数关系，即吞噬速度与血碳浓度成正比，而与已吞噬的碳粒量成反比。以血碳深度对数值为纵坐标，时间为横坐标，两者呈直线关系。此直线斜率(k)可表示吞噬速率，也可称为未经纠正的吞噬指数。因动物肝、脾质量能影响吞噬速率，故一般以校正吞噬指数α表示。α反映了每单位组织质量的吞噬活性。公式如下：

实验仪器和材料721型分光光度计、计时器、血色素吸管、印度墨汁、Na₂CO₃。
实验步骤，
溶液配制：注射用墨汁：将印度墨汁原液用生理盐水稀释3～4倍。Na₂CO₃溶液：取0.1g Na₂CO₃，加蒸馏水至100mL。
注射墨汁：按体重从小鼠尾静脉注入稀释的印度墨汁，按每1g体重0.1mL计算。等墨汁注入，立即计时。
测定：注入墨汁后2min、10min，分别从内眦静脉丛取血20uL，并立即将其加到2mL0.1％Na₂CO₃溶液中。用721型分光光度计在600nm波长处测光密度值(OD)，以Na₂CO₃溶液作空白对照。将小鼠处死，取肝脏和脾脏，用滤纸吸干脏器表面血污，分别称重。
数据处理及结果判定用方差分析进行数据统计，以吞噬指数表示小鼠碳廓清的能力。
按正式计算吞噬指数α。受试样品组的吞噬指数显著高于对照组的吞噬指数，可确定本项试验结果阳性。
α=1gOD1-1gOD2t2-t1×k3]]>
②小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验采用滴片法原理：利用巨噬细胞对光滑表面如玻璃表面具有黏附的特性，将含有巨噬细胞的腹腔液滴于载玻片上，加入鸡红细胞，孵育一定时间后，冲洗掉未黏附的细胞，固定染色，在显微镜下计数吞噬鸡红细胞的巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数，据此判定巨噬细胞的吞噬管、吸取球、载玻片、染色槽、试管。
试剂配制琼脂的配制：取琼脂3g，加水100mL，加热煮沸至熔化透明，加入1％的溴甲酚紫指示剂1～2滴。PBS缓冲液的配制：KH₂PO₁6.66g，Na₂HPO₁·12H₂O 6.38g，将上述试剂溶于1000mL蒸馏水中调pH值至7.2即成。
试验步骤①1％鸡红细胞悬液：试验前取鸡颈静脉或埃及血，置于盛有玻璃珠(20个左右)的三角瓶内，连续顺一个方向充分摇动5～10min，除去纤维蛋白，4℃冰箱保存。试验前用生理盐水洗涤3次，1500r/min，离心10min，弃去上清，按血球压积用Hank’s液配制成1％的红细胞悬浊液；②小鼠巨噬细胞的激活：试验前4d给每只小鼠腹腔注射2％压积羊血红细胞0.2mL。用颈椎脱臼法处死小鼠，腹腔注射加小牛血清的Hank’s液4mL/只，轻轻按揉腹部20次以充分洗出腹腔巨噬细胞，然后将腹壁剪开一个小口，用胶头吸管吸收腹腔洗液2mL于试管内(或用注射器)。用1mL加样器吸取腹腔洗液0.5mL加入盛有0.5mL 1％鸡血红细胞悬液的试管内，混匀。用注射器(装大针头)吸取0.5mL混合液，加入玻片的琼脂圈内。放置孵箱内37℃孵育15～20min。孵育结束后迅速用生理盐水将未贴壁细胞冲掉，于甲醇液中固定1min，Giemsa液染色15min。用蒸馏水冲洗干净，晾干，用40倍显微镜计数，并按下式计算吞噬率和吞噬指数：


数据处理及结果判定用方差分析进行数据统计，以吞噬百分率或吞噬指数表示小鼠巨噬细胞的吞噬能力。受试物的吞噬百分率或吞噬指数与对照组比较，差异均有显著性，可确定本项试验结果阳性。
动物实验结果见表4、
表4本营养食品对小鼠体液免疫功能各项指标的影响(X±SD)

*与空白对照组相比有显著性差异(P＜0.05)。
**与空白对照组相比有较显著性差异(P＜0.01)。
(5)实验本营养食品对小鼠NK细胞活性的影响(X±SD)，NK细胞活性/％。
实验动物、剂量分组及受试物和给予时间均同实验方法(1)。
实验采用乳酸脱氢酶(LDH)测定法，原理活性胞胞浆内含有LDH。正常情况下，LDH不能透过细胞膜，当细胞受到NK细胞的杀伤后，LDH可释放到细胞外。LDH可使乳酸锂脱氢，进而使NAD(辅酶I)还原成NADH(还原型辅酶I)，后者再经递氢体吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)还原硝基氯化四氮唑(INT)，INT接受H+后被还原成紫红色甲脂类化合物。用酶标仪在波长490nm处比色测定。
仪器和材料酶标仪、YAC-1肿瘤细胞系、Hank’液(pH7.2～7.4)、RPMI-1640完全培养液、乳酸锂或乳酸钠、硝基氯化四氮唑(INT)、0.2mol/L的Tris-HCI缓冲液(pH8.2)吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)、NAD(辅酶I)、1％NP40或2.5％Triton。LDH基质液：在0.2mol/L的Tris-HCI缓冲液(pH8.2)中，含有5×10^-2mol/L乳酸锂、6.6×10^-4mol/L硝基氯化四氮唑(INT)、2.8×10^-4mol/L吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)和1.3×10^-3mol/L氧化型辅酶I(NAD)。
试验步骤
①靶细胞的传代(YAC-1细胞)试验前24h将靶细胞进行传代培养，用前以Hank’液洗3次，用RPMI-1640完全培养液调整细胞浓度为4×10⁵个/mL。
②脾细胞悬液的制备(效应细胞)无菌取脾脏，置于盛有适量无菌Hank’液的小平皿中，用镊子轻轻将脾磨碎，制成单细胞悬液，经200目筛网过滤，再用Hank’液洗3次，每次1000r/min离心10min。弃上清后将细胞弹起，加入0.5mL灭菌水，裂解红细胞20s，再加入0.5mL2倍Hank’液及8mLHank’液，1000r/min离心10min。用1mL含10％小牛血清的RPMI-1640完全培养液重悬，用1％冰醋酸稀释后计数(活细胞数应在95％以上)用台酚酚蓝染色计数活细胞数(应在95％以上)最后用RPMI-1640完全培养液调整细胞浓度为2×10⁷个/mL。
③细胞活性检测取靶细胞和效应细胞各100uL(效靶比50∶1)，加入U形96孔培养板中。靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液100uL，靶细胞最大释放孔加靶细胞和1％NP40或2.5％Triton各100uL。上述各项均设三个平行孔，于5％CO₂培养箱中37℃培养4h。然后将96孔培养板以1500r/min离心5min，每孔吸取上清100uL置平底96孔培养板中，同时加入LDH基质液100uL，根据室温不同反应3～10min，再每孔加入1mol/L的HCI30uL，用酶标仪在波长490nm处测定光密度值(OD)。
数据处理及方差分析进行数据统计并按下式计算NK细胞活性。受试物组的NK细胞活性显著高于对照组的NK细胞活性，可确定本项试验结果阳性。

动物实验结果见表5、
表5本营养食品对小鼠NK细胞活性的影响(X±SD)

本营养食品增强免疫力功能动物实验结果由上面的表1、表2、表3、表4、表5显示证明：经口给予小鼠不同剂量的本受试物(本营养食品)30d后，与空白对照组相比，本受试物在中剂量组能提高小鼠的迟发型变态反应能力(P＜0.05)、小鼠的碳廓清能力(P＜0.05)、小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬率(P＜0.05)和小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬指数(P＜0.05)；在高剂量组有提高小鼠的迟发型变态反应能力(P＜0.05)、增强ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化能力(P＜0.05)、提高小鼠抗体生成细胞数(P＜0.05)、提高小鼠半数溶血值(P＜0.05)、提高小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬指数(P＜0.05)。本受试物对小鼠体重增长无不良影响。
所以，根据《保健食品检验与评价技术规范》(2003版)对增强免疫力功能营养食品的判定标准，可确定本营养食品动物实验结果表明具有增强免疫力功能。
实验例2、
本营养食品的安全性毒理学试验，经口急性毒性动物试验
1.材料与方法
1.1样品：本营养食品。性状：棕色膏状物。批号：20070421。比重：1.03g/ml。
人体摄入量：1.12g/d。
1.2溶剂：玉米油。
1.3试验动物：SPF级ICR种小白鼠，体重18～22克。由北京大学医学部实验动物科学部提供。动物合格证号：SCXX(京)2006-0008。动物观察3天后用于试验，动物饲养于屏障环境。
1.4动物饲料：由北京市科奥协力饲料有限公司提供。饲料合格证号：SCXX(京)2005-0007
1.5试验方法：按照卫生部《营养食品检验与评价技术规范》(2003年版)急性毒性试验规定的方法时行。动物随机分为两组，每组20只，雌雄各半，分别人对照组和试验组。动物禁食16小时后，试验组动物以0.2ml/10g体重经口一次灌胃受试物原液。给受试物剂量为20.6g/kg体重。对照组动物灌胃等量的玉米油。给受试物后每日观察一次，观察动物中毒表现、死亡数和死亡时间。共观察14天。试验结束时称取并记录小鼠体重，处死动物进行尸检。
2.结果本营养食品，按20.6g/kg体重给小鼠灌胃。观察14天，动物未见明显中毒反应症状。动物体重与对照组比较无明显差别(见表)。
表本营养食品对受试动物体重的影响

结论：
本营养食品的急性经口毒性试验结果表明，两种性别小鼠经口急性毒性LD₅₀均大于20.6g/kg体重。根据《保健食品检验与评价技术规范》(2003版)，急性毒性分级标准，本营养食品属实际无毒。