具有氯苯胺降解能力的代尔夫特菌 H1 及其应用 ( 一 ) 技术领域
本 发 明 涉 及 一 株 具 有 氯 苯 胺 降 解 能 力 的 新 菌 株 —— 代 尔 夫 特 菌 (Delftia tsuruhatensis strain)H1 及其应用。 ( 二 ) 背景技术
氯代苯胺类化合物是一类重要的化工原料， 被广泛应用于染料、 农药、 防腐剂的合 成和制药工业中。作为氯代芳烃化合物的一族， 它们具有 “三致效应” 与遗传毒性， 难于生 物降解， 持久滞留于环境， 并容易生物富集， 对生态环境和人体健康造成严重威胁， 已被美 国环保署 (EPA) 和欧盟列入优先控制污染物名单。因此， 研究氯苯胺类化合物的高效降解 对于改善水体环境质量、 保障人群健康和生态安全具有重要意义。生物降解技术具有反应 条件温和、 运行费用低和无二次污染等特点， 是降解该类物质最有效的方法之一。
采用生物技术降解氯苯胺类物质的关键之一便是获得具有高效降解氯苯胺能 力的优良菌株。目前， 国内外研究者对氯苯胺的生物降解已开展了大量研究工作， 分离 到一些在好氧或厌氧条件下降解氯苯胺的细菌， 主要有假单胞菌 (Pseudomonas)， 不动杆 菌 (Acinetobacter)， 丛毛单胞菌 (Comamonas)， 克雷白氏杆菌 (Klebsiella)， 黄杆菌属 (Flavobacterium)， 莫拉杆菌 (Moraxella)， β 变形菌 (βProteobacteria) 等。这些降解 菌仅能降解单一的氯苯胺， 且大多数菌株的降解效率有待进一步提高。本发明的降解菌株 可实现高效降解氯苯胺类物质， 因此， 在实际应用中可发挥更重要的作用。
经检索专利和其他相关文献， 尚未发现在好氧条件下应用代尔夫特菌属 Delftia tsuruhatensis 降解氯苯胺的报道。该降解菌的发现对工业废水中氯苯胺类污染物的高效 净化具有重要意义。 ( 三 ) 发明内容
本发明的目的是提供一株高效、 快速降解氯苯胺类物质的菌种及其应用。
本发明采用的技术方案是 ：
具有氯苯胺降解能力的代尔夫特菌 (Delftia tsuruhatensis strain)H1， 保藏 于中国典型培养物保藏中心， 地址 ： 中国， 武汉， 武汉大学， 430072， 保藏编号 CCTCC No ： M 209249， 保藏日期 2009 年 11 月 4 日。
所述的 CCTCC No ： M 209249 来源于中国石化浙江镇海炼化污水处理厂曝气池中 的活性污泥中， 经驯化、 分离、 纯化获得， 能以氯苯胺为唯一碳源和氮源。
所述代尔夫特菌 H1 菌落及生化特征如下 ： 菌落呈淡乳白色， 圆形， 边缘整齐， 光滑 湿润 ； 电镜观察， 大小为 (0.6 ～ 0.8)μm×(1.9 ～ 2.1)μm， 有鞭毛， 无芽孢菌 ； 电子显微 镜下观察该菌体的形态为稍粗杆菌， 革兰氏染色阴性， 氧化酶阳性。该菌株的 16S rDNA 的 Genebank 的登录号为 GQ868495。
本发明还涉及所述的代尔夫特菌 H1 在微生物降解氯苯胺及其衍生物中的应用。
具体的， 所述代尔夫特菌 H1 用于降解废水中的氯苯胺及其衍生物。优选的， 所述降解在 15 ～ 45℃、 pH4 ～ 10 进行。更为优选的， 所述降解在 30℃、 pH7 进行。
该菌株在纯培养条件下， 能将 300mg/L 的氯苯胺在 33 小时内完全降解， 对氯苯胺 的最高降解浓度可达 600mg/L。
本发明的有益效果主要体现在 ： 提供了一株高效、 快速降解氯苯胺类物质的新菌 株及其应用， 该菌株可在好氧条件下快速降解氯苯胺类污染物， 将在氯苯胺类工业废水治 理实践中发挥重要作用。 此外， 该菌株为野生型， 遗传背景清晰， 适于进行遗传改良， 有望大 幅度提高对氯苯胺类污染物的降解能力。 ( 四 ) 附图说明
图 1 为 Delftia tsuruhatensis H1 显微镜和透射电镜照片 (a ： 革兰氏染色显微 镜图片 ； b： 透射电镜图片 ) ；
图 2 为 Delftia tsuruhatensis H1 的系统发育树图 ；
图 3 为不同温度下菌 Delftia tsuruhatensis H1 对氯苯胺的降解曲线图 ；
图 4 为不同 pH 下菌 Delftia tsuruhatensis H1 对氯苯胺的降解曲线图 ；
图 5 菌 Delftia tsuruhatensis H1 对不同初始浓度的邻氯苯胺降解曲线 ； 图 6 为菌 Delftia tsuruhatensis H1 对不同初始浓度的间氯苯胺降解曲线 ； 图 7 为菌 Delftia tsuruhatensis H1 对不同初始浓度的对氯苯胺降解曲线 ； 图 8 为菌 Delftia tsuruhatensis H1 对混合底物的降解曲线。( 五 ) 具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述， 但本发明的保护范围并不仅限于 此 ( 实施例中的百分含量， 如无特别说明， 均为质量百分含量 ) ：
实施例 1 ： Delftia tsuruhatensis H1(CCTCC No ： M 209249) 的分离、 纯化及其鉴 定
1.Delftia tsuruhatensis H1 的分离及纯化
Delftia tsuruhatensis H1 是从浙江镇海炼化污水处理厂曝气池的活性污泥中 取样， 经驯化、 分离及纯化得到的一株革兰氏阴性菌。具体步骤如下 ：
(1) 污泥定向驯化
取浙江镇海炼化污水处理厂曝气池的活性污泥。在 SBR 反应器中对活性污泥进行 氯苯胺类物质的定向驯化， 每 36h 为一驯化周期， 驯化 4 个月， 直至活性污泥对氯苯胺类物 质实现稳定高效降解。
(2) 菌株的筛选与纯化
从 SBR 反应器中取出 5mL 污泥， 加入 50mL 无菌水于锥形瓶中， 置于摇床 160rpm， 30 ℃振荡 1 小时。然后利用氯苯胺降解菌筛选培养基对活性污泥进行菌株筛选。氯苯 胺降解菌筛选培养基成分 ： KH2PO4， 0.24g/L ； Na2HPO4， 0.24g/L ； MgSO4·7H2O， 0.0696g/L ； CaCl2·2H2O， 0.022g/L ； FeCl3， 0.005g/L ； CuSO4·H2O， 0.00003g/L ； MnSO4·H2O， 0.00013g/ L； ZnCl2， 0.00023g/L ； CoCl·6H2O， 0.00042g/L ； NaMoO4·2H2O， 0.00015g/L ； AlCl3·6H2O， 0.00005g/L ； 琼脂， 15g/L ； 溶剂为水， pH 7 ～ 7.5。氯苯胺类物质另外分别添加 ： 邻氯苯胺，100mg/L ； 间氯苯胺， 100mg/L ； 对氯苯胺， 100mg/L。氯苯胺降解菌筛选培养基接种活性污 泥， 在恒温培养箱 28℃培养 2 ～ 3 天， 挑取平板上长出的单菌落， 得到多株纯菌落。
将筛选到的多株氯苯胺降解菌在含有氯苯胺类物质为唯一碳源和氮源的无机盐 培养基中考察菌株对氯苯胺类物质的去除效果， 通过同空白实验的对照， 结果得到了一株 高效降解氯苯胺类物质的菌株 H1。所用的培养基成分为 ： KH2PO4， 0.24g/L ； Na2HPO4， 0.24g/ L； MgSO4·7H2O， 0.0696g/L ； CaCl2·2H2O， 0.022g/L ； FeCl3， 0.005g/L ； CuSO4·H2O， 0.00003g/ L； MnSO4·H2O， 0.00013g/L ； ZnCl2， 0.00023g/L ； CoCl·6H2O， 0.00042g/L ； NaMoO4·2H2O， 0.00015g/L ； AlCl3·6H2O， 0.00005g/L ； 邻氯苯胺， 100mg/L ； 间氯苯胺， 100mg/L ； 对氯苯胺， 100mg/L ； 溶剂为水， pH 7 ～ 7.5。
2.Delftia tsuruhatensis H1 的 16S rDNA 鉴定
通过 16S rRNA 序列分析和 Biolog 微生物鉴定系统鉴定， 确定 H1 菌为 Delftia tsuruhatensis strain。具体步骤如下 ：
采用 3S 柱离心式环境样品 DNA 回收试剂盒 (V2.2， 上海申能博彩生物科技有限公 司 ) 提取 Delftia tsuruhatensis H1 的 DNA， 4℃保存。然后作为 PCR 反应的模板， 设计引 物， 扩增 Delftia tsuruhatensis H1 的全序列 DNA， 上下游引物序列分别如下 ：
BSF8/20 ： 5′ -AGAGT TTGAT CCTGG CTCAG-3′
BSR1541/20 ： 5′ -AAGGA GGTGA TCCAG CCGCA-3′
PCR 反应程序设定为 ： 先 94℃预变性 4min ； 然后 94℃变性 1min， 59℃退火 1min， 72℃延伸 1.5min， 循环 35 个周期 ； 然后 72℃延伸 10min ； 最后 4℃保持 10min。将 PCR 产物 进行测序 ( 上海英骏 )， 测序结果见 SEQ No.1。
将 H1 的 16S rDNA 序列上传到 Genbank， 获得 Genbank 的登录号 GQ868495， 同时 同 Genbank 中的基因序列进行同源性比较， 发现其属于 Delftia 属， 然后通过系统发育树 的建立， H1 可能为 Delftia tsuruhatensis， 图 2 为该菌的系统发育树图。为了进一步确 定鉴定结果， 通过各项生理生化实验以及 Biolog 微生物鉴定系统的分析， 最终确定 H1 为 Delftiatsuruhatensis。
实施例 2 ： Delftia tsuruhatensis H1 对氯苯胺类物质的降解特性
1. 不同温度下菌 Delftia tsuruhatensis H1 对氯苯胺的生物降解性能
在不同温度下实施 Delftia tsuruhatensis H1 对氯苯胺的降解实验， 发现其在 25 ～ 35℃具有较高的降解氯苯胺系混合物的能力， 从实际应用角度看， 30℃为最为适宜的 温度， 此时去除率最高， 具体实施步骤如下 ：
在无机培养基(无机盐培养基组成为： KH2PO4， 0.24g/L ； Na2HPO4， 0.24g/L ； MgSO4·7H2O， 0.0696g/L ； CaCl2·2H2O， 0.022g/L ； FeCl3， 0.005g/L ； CuSO4·H2O， 0.00003g/ L； MnSO4·H2O， 0.00013g/L ； ZnCl2， 0.00023g/L ； CoCl·6H2O， 0.00042g/L ； NaMoO4·2H2O， 0.00015g/L ； AlCl3·6H2O， 0.00005g/L ； 溶剂为水， pH7 ～ 7.5) 中， 添加氯苯胺类物质作为 唯一碳源， 氯苯胺类物质的终浓度为 ： 邻氯苯胺， 100mg/L ； 间氯苯胺， 100mg/L ； 对氯苯胺， 100mg/L。加入新鲜培养的 H1 的菌悬液， OD600 为 0.2， 接种量为 2mL/100mL。分别置于 15℃、 20℃、 25℃、 30℃、 35℃、 40℃的摇床中 160rpm 培养 ； 另外准备 6 个同样的未接菌的培养基分 别置于对应的温度同时培养， 作为空白对照。培养 30h 后， 取样液相色谱检测氯苯胺类物质 的浓度， 同时测定菌株的菌密度 (OD600)， 绘制氯苯胺类物质的去除率曲线图及 H1 的生长曲线图。 结果如图 3 所示， 表明在温度为 15℃时， 菌株对氯苯胺类物质的去除率较低。随 着温度的逐渐提高， 菌株对氯苯胺类物质的去除率也随之提高 ； 在温度为 25 ～ 35℃时为该 菌株较为适宜生长的温度， 菌株的生长和对氯苯胺类物质的去除率都达到了较高的值 ； 温 度 30℃时达到了最大值， 30h 对氯苯胺类物质的去除率分别为邻氯苯胺， 79.4％； 间氯苯胺， 100％ ； 对氯苯胺， 100％。随着温度的进一步提高， 菌株的生长和降解能力开始下降。
2. 不同 pH 下菌 Delftia tsuruhatensis H1 对氯苯胺类物质的降解特性
在不同 pH 下实施 Delftia tsuruhatensis H1 对氯苯胺类物质的降解实验， 结果 表明其最佳的生长降解 pH 值为 7， 具体实验方案如下 ：
在 7 个 500mL 的盐水瓶中加入 100mL 等量的无机盐培养基， 氯苯胺类物质作为唯 一碳源， 初始浓度为 100mg/L， 分别调节 pH 至 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10 ； 同时准备 7 瓶相同的培养 基作为空白对照。均接种 2mL 新鲜培养的 H1 菌悬液， OD600 为 0.2， 在 30℃， 160rpm 下培养。 分别在 0h， 30h 取样， 检测培养基中的氯苯胺类物质的浓度变化和菌株的菌密度 (OD600)， 绘 制氯苯胺类物质的去除率曲线图及 H1 的生长曲线图。
结果如图 4 所示， 在 pH 为 4、 5、 9、 10 时， H1 对氯苯胺类物质的去除效果较差。在 pH 为 4、 10 的培养液中， 溶液较澄清， 表明菌株生长十分不好。在 pH 为 5 ～ 9 的条件下， 细 菌都能以氯苯胺类物质为唯一碳源生长， 只是生长和降解速率有所不同， 在 pH 为 7 时， 菌株 H1 的生长和降解速率最快， 对邻氯苯胺、 间氯苯胺、 对氯苯胺 30h 的去除率分别为 78.6％、 100％、 100％。
3. 菌 Delftia tsuruhatensis H1 对不同初始浓度的氯苯胺类物质的降解特性
在不同氯苯胺类物质初始浓度下， 实施 H1 对邻氯苯胺、 间氯苯胺、 对氯苯胺四种 物质的降解， 结果发现 H1 对邻氯苯胺、 间氯苯胺、 对氯苯胺的耐受浓度为 100mg/L、 600mg/ L、 600mg/L。具体实施方案如下 ：
在 500ml 的盐水瓶中加入 100mL 的无机盐培养基， 氯苯胺类物质作为唯一碳源。 邻氯苯胺的最终浓度为 10、 25、 50、 75、 100mg/L ； 间氯苯胺的终浓度为 50、 100、 200、 400、 600mg/L ； 对氯苯胺的终浓度为 50、 100、 200、 400、 600mg/L。分别接种等量 2mL OD600 为 0.2 的菌悬液， 30℃， 160rpm 培养， 间隔一段时间取样， 绘制 H1 对氯苯胺类物质的降解曲线图。
从图 5 ～图 7 可以看出在 H1 对邻氯苯胺的降解速率明显要慢于间氯苯胺和对 氯苯胺， 当邻氯苯胺浓度低于 100mg/L 时， H1 可快速地降解邻氯苯胺， 细菌生长良好， 而在 100mg/L 时， 菌株受到强烈抑制 ； 当间氯苯胺浓度在 600mg/L 以内时， H1 都可快速地降解间 氯苯胺， 细菌生长良好 ； 当对氯苯胺浓度达到 600mg/L 时， 菌株生长降解受到抑制， 不能高 效降解。
4. 菌 Delftia tsuruhatensis strainH1 对混合底物的降解情况
在 以 邻 氯 苯 胺、 间 氯 苯 胺、 对 氯 苯 胺 三 种 物 质 为 混 合 底 物， 实 施 菌 Delftia tsuruhatensis H1 对氯苯胺类物质的降解特性， 结果表明其对三种物质的降解难易程度 为： 间氯苯胺＞对氯苯胺＞邻氯苯胺。具体实施方案如下 ：
在 500mL 的盐水瓶中加入 100mL 的无机盐培养基， 加入氯苯胺类混合物作为唯一 碳源， 总浓度 300mg/L， 各物质浓度分别为 100mg/L。接种 2mL OD600 为 0.2 的菌悬液， 30℃， 160rpm 培养。每隔一段时间取样， 检测培养基中的氯苯胺类物质的浓度和菌密度 (OD600)，
直到降解完全。绘制氯苯胺类物质的降解曲线和菌株生长图。
结果如图 8 所示， 在降解初期， 菌株对氯苯胺的降解有 5 ～ 10h 左右的延滞期， 同 时菌株生长缓慢 ； 在 12h 后， 菌株开始适应该环境， 进入对数生长期， 氯苯胺类物质被快速 降解， 从图中可以看出 H1 对间氯苯胺和对氯苯胺的去除速率要明显快于邻氯苯胺 ； 在 20h 时， 间氯苯胺被完全降解， 对氯苯胺、 邻氯苯胺先后在 22h、 33h 降解完。菌株的菌密度在 18 ～ 20h 达到最大值， 20h 后菌株进入衰退期。